大鼠腦缺血再灌注后腦組織nos、nf-b的表達(dá)及意義

大鼠腦缺血再灌注后腦組織nos、nf-b的表達(dá)及意義

腦缺血置換術(shù)（i.r）是傷口、休克和器官疾病的常見臨床現(xiàn)象，是一種復(fù)雜的病理生理過程。機(jī)體微循環(huán)是一個(gè)統(tǒng)一的、密切的、聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),局部腦組織損傷微循環(huán)障礙可以引起全身微循環(huán)紊亂。一氧化氮(NO)是一種不穩(wěn)定的“氣體型分子”,生成NO需要一氧化氮合酶(NOS)的催化,高濃度NO可致腦細(xì)胞代謝障礙和病理改變。同時(shí)NO是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子,作為第二信使和神經(jīng)遞質(zhì)廣泛地分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),NOS免疫陽性的神經(jīng)元通過分泌的NO對(duì)其他遞質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)對(duì)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的調(diào)控作用是通過參與多種細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控而產(chǎn)生影響。研究證明,腦組織臂旁核、藍(lán)斑、杏仁核、室旁核在感受、整合和傳遞信息方面起一定的作用,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制處理傷害性信息的重要組成部分,同時(shí)與內(nèi)臟調(diào)節(jié)相關(guān)的核團(tuán)間發(fā)生廣泛的纖維聯(lián)系,廣泛參與內(nèi)臟損傷活動(dòng)的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠腦I/R模型,觀察大鼠腦組織的病理改變及腦組織不同部位(藍(lán)斑、室旁核、臂旁核、杏仁核)不同時(shí)間段NOS、NF-κB的表達(dá),以探討NOS、NF-κB在腦組織損傷中的調(diào)控作用及意義,為腦組織的損傷提供形態(tài)學(xué)基礎(chǔ),并為建立腦I/R損傷后腦組織的防護(hù)性治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心選用健康Wistar大鼠72只,體重250～300g,雌雄不限(由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),置于安靜、溫暖、避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)48h。72只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、缺血30min組(I組)和缺血30min后再灌注(I/R)0、2、4、6、8、10、12h組共9組,每組8只。1.2戊巴比妥鈉液及多聚甲醛液免疫組化試劑盒及NOS、NF-κB一抗購自武漢博士德生物工程有限公司;2%戊巴比妥鈉液;4%多聚甲醛液;梯度酒精;蒸餾水。動(dòng)物試驗(yàn)臺(tái),無菌手套,無菌標(biāo)本瓶,冰箱,電烤箱,光學(xué)顯微鏡,LEICAR2135切片機(jī)。1.3免疫組化染色采用Pulsinelli--Brierley方法建立大鼠腦I/R模型,用2%戊巴比妥鈉(0.2ml/100g)腹腔內(nèi)注射麻醉,電凝雙側(cè)錐動(dòng)脈成永久性阻塞;鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,并埋線備用,次日以無損傷動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,對(duì)照組次日不鉗夾頸總動(dòng)脈。I/R0、2、4、6、8、10、12h組,分別于缺血30min終點(diǎn)(再灌注0h)取腦,于腦組織藍(lán)斑、室旁核、臂旁核、杏仁核所在部位做冠狀切片,片厚4μm,連取5張,1張作HE染色,其余4張作免疫組化染色。以胞漿和細(xì)胞核呈棕黃色為陽性,經(jīng)圖像分析儀處理,每個(gè)組織塊隨機(jī)選取1張切片,對(duì)照?qǐng)D譜,定位核團(tuán),計(jì)算該切片特定核團(tuán)中單視野內(nèi)NOS、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)的總和,每組6張取均數(shù)。1.4統(tǒng)計(jì)處理采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組間NOS、NF-κB陽性細(xì)胞數(shù)比較采用方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1浸漬劑tpI/R2h組神經(jīng)細(xì)胞腫脹,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。I/R8h組腦神經(jīng)細(xì)胞核碎裂、消失,間隙增寬,結(jié)構(gòu)疏松,神經(jīng)細(xì)胞局部溶解、液化性壞死范圍較廣(圖2)。2.2藍(lán)斑nos陽性神經(jīng)元/胞漿染色結(jié)果NOS免疫陽性反應(yīng)表現(xiàn)為胞漿染成棕黃色或棕黃色顆粒沉積。對(duì)照組藍(lán)斑出現(xiàn)少量淡染的圓形或橢圓形神經(jīng)元,散在分布(圖3)。I/R8h組藍(lán)斑NOS陽性神經(jīng)元數(shù)較對(duì)照組增加,胞漿著色略加深,有的聚集成團(tuán),可見陽性纖維穿行其間(圖4)。I/R12h組藍(lán)斑NOS陽性神經(jīng)元密集,胞體著色深,呈圓形、橢圓形、梭形,有的形成團(tuán)狀(圖5)。與對(duì)照組相比,I/R2、4、6、8、10、12h組腦組織不同部位NOS表達(dá)均明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05),NOS8h時(shí)表達(dá)達(dá)高峰,8～12h呈下降趨勢(shì)(表1)。2.3杏仁核nf-b陽性神經(jīng)元表達(dá)變化NF-κB免疫陽性神經(jīng)元主要表達(dá)為細(xì)胞核染成棕黃色或棕黃色顆粒沉積,對(duì)照組杏仁核出現(xiàn)核少量淡染圓形、多角形陽性神經(jīng)元,散在分布(圖6)。I/R8h組杏仁核NF-κB陽性神經(jīng)元數(shù)較對(duì)照組增加,具有明顯突起(圖7)。I/R12h組杏仁核NF-κB陽性神經(jīng)元密集、胞核著色加深,有的形成團(tuán)塊,胞體呈圓形、橢圓形(圖8)。NF-κB的表達(dá)在各組與對(duì)照組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與對(duì)照組相比,其余各組腦組織不同部位NF-κB的表達(dá)均明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),0～8h呈上升趨勢(shì),8～12h較穩(wěn)定(表2)。3討論3.1nos在損傷早期腦保護(hù)作用結(jié)果見表1NOS是20世紀(jì)80年代后期在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)和證實(shí),通常以無活性的聚合體存在胞漿中,已確定有神經(jīng)元型NOS(nNOS)、內(nèi)皮型NOS(eNOS)和誘導(dǎo)型NOS(iNOS)3種亞型,NOS活性為nNOS、eNOS、iNOS的活性總和。NO具有典型的雙重作用,其有利的一面是:激活的NOS在持續(xù)時(shí)間上nNOS、eNOS是短時(shí)調(diào)節(jié),在損傷早期腦組織局部nNOS、eNOS合成NO通過以下途徑發(fā)揮腦保護(hù)作用:(1)增加腦血流;(2)抗血栓形成作用;(3)抗血管痙攣?zhàn)饔?(4)抗中性粒細(xì)胞粘附反應(yīng)。其不利的一面是iNOS是持久調(diào)節(jié),隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)其產(chǎn)生的NO加重組織的損傷,iNOS主要被一些細(xì)胞因子誘導(dǎo)而激活,催化合成大量的NO參與腦損傷的病理過程,表明NO通過以下途徑造成神經(jīng)元損傷:(1)NO使各種含鐵-硫的酶失活;(2)NO通過超氧自由基起細(xì)胞毒性作用;(3)NO引起蛋白質(zhì)的ADP-核糖化;(4)NO可引起多巴胺大量釋放;(5)NO可通過介導(dǎo)N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)的而發(fā)揮神經(jīng)毒性作用,在晚期NO可反饋抑制NOS的活性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組與I、I/R0h組間NOS的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,NOS表達(dá)無明顯升高,提示腦組織局部nNOS、eNOS合成NO可能發(fā)揮了腦保護(hù)作用。I/R2h以后各組NOS表達(dá)均明顯上調(diào),表明iNOS可能被一些細(xì)胞因子誘導(dǎo),催化合成大量的NO參與腦損傷的病理過程,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示NO在腦I/R引起腦損傷的調(diào)控中起雙重作用。3.2b在免疫調(diào)節(jié)中的作用NF-κB是一種能與免疫球蛋白輕鏈基因增強(qiáng)子κB序列(GGGACTTTCC)特異性結(jié)合的核蛋白,具有傳遞細(xì)胞核內(nèi)外信息的功能。研究證實(shí),當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生某些病理改變時(shí),活化的NF-κB在核內(nèi)以直接或間接的方式誘導(dǎo)與免疫和炎癥有關(guān)的多種基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮生物學(xué)作用,調(diào)節(jié)機(jī)體的病理反應(yīng)。近年來研究表明,炎癥反應(yīng)在機(jī)體I/R損傷中起重要作用,氧自由基和其它信使激活炎性細(xì)胞因子和趨化因子的釋放是許多炎性疾病發(fā)生和發(fā)展的主要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)