曲馬多對(duì)心肌缺血大鼠丘腦束旁核部位5-h1a受體mrna表達(dá)的影響

曲馬多對(duì)心肌缺血大鼠丘腦束旁核部位5-h1a受體mrna表達(dá)的影響

在心肌缺血期間，心臟交動(dòng)血清素質(zhì)化機(jī)制會(huì)增加心臟交動(dòng)血清素的輸入沖動(dòng)，從而誘發(fā)心絞痛。但由心肌缺血引發(fā)的心絞痛(癥狀)和急性心肌梗死(損傷)的程度往往不相平行。丘腦束旁核(parafascicularnucleus,Pf)是內(nèi)臟痛覺(jué)感受、調(diào)制和整合的重要中樞,Pf內(nèi)含有豐富的5-HT能神經(jīng)末梢及其受體。研究表明,5-HT1A受體在大鼠內(nèi)臟痛模型中發(fā)揮著重要的作用,但目前對(duì)5-HT1A受體mRNA的研究多局限于外周炎癥后脊髓水平的表達(dá),心肌缺血時(shí)Pf水平5-HT1A受體mRNA的表達(dá)尚無(wú)定論。本研究擬觀(guān)察曲馬多對(duì)急性心肌缺血大鼠Pf部位5-HT1A受體mRNA表達(dá)的影響。動(dòng)物cao及pf區(qū)域組織切片鑒定動(dòng)物與分組健康成年雄性SD大鼠24只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體重260～280g,隨機(jī)分為4組(n=6):(1)對(duì)照組(C組),即非冠狀動(dòng)脈(冠脈)扎閉組,開(kāi)胸后冠脈左前降支下穿線(xiàn),不結(jié)扎;(2)扎閉冠脈(CAO)組(CAO組),CA06h;(3)曲馬多+CAO組(TCAO組),靜脈注射曲馬多(批號(hào)346G,GrunenthalGmbH有限公司,德國(guó))12.5mg*kg-115min后CA06h;(4)嗎啡+CAO組(MCAO組),靜脈注射嗎啡(批號(hào)040602G,沈陽(yáng)第一制藥廠(chǎng))1.25mg·kg-115min后CAO6h。動(dòng)物模型的建立腹腔注射20%烏拉坦1.2g/kg麻醉后氣管切開(kāi),控制呼吸,呼吸頻率75次/min,潮氣量8ml/kg。在左胸骨旁第4、5肋間作1cm長(zhǎng)切口,暴露心臟,剪開(kāi)心包膜后用7-0無(wú)損傷縫線(xiàn)結(jié)扎冠脈左前降支(C組僅穿線(xiàn)不結(jié)扎),并計(jì)時(shí)。然后逐層關(guān)胸,行胸腔負(fù)壓引流后,解除人工通氣,動(dòng)物恢復(fù)自主呼吸。建模成功標(biāo)準(zhǔn):(1)CAO后肉眼可見(jiàn)明確的心肌缺血區(qū);(2)動(dòng)物總出血量不超過(guò)1ml;(3)動(dòng)物生命體征未出現(xiàn)劇烈波動(dòng)。Pf位置標(biāo)定將CAO后的大鼠固定丁ST-7腦脊柱立體定位儀(成茂株式會(huì)社,日本)上。依照文獻(xiàn)(以前囟為0點(diǎn),距前囟向尾側(cè)4.0～4.2mm、距中縫旁開(kāi)0.8～1.2mm、腦表面下5.5～6.5mm),鉆孔開(kāi)顱顯露腦組織,用單腔玻璃微電極(尖端直徑0.5～1.0μm)由微推進(jìn)儀從腦表面垂直刺入,到達(dá)Pf位置后,用微電泳儀(DP-301,WarnerInstrument公司,美國(guó))以芝加哥藍(lán)陰極電流(10μA,20min)進(jìn)行Pf位置標(biāo)定。CA06h后處死動(dòng)物(C組冠脈左前降支下穿線(xiàn)),取心臟和大腦做組織學(xué)檢查和鑒定。腦切片制備參照文獻(xiàn)方法操作,采用LeicaCM-1850恒冷箱切片機(jī)(Leica公司,德國(guó))行15μm厚冠狀冰凍連續(xù)切片。原位雜交染色(漂浮法)。每組均設(shè)立試劑(陰性)對(duì)照。5-HT1A受體mRNA原位雜交檢測(cè)試劑盒、原位雜交專(zhuān)用蓋玻片、DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德公司,焦碳酸二乙酯(DEPC)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。采用BX51光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本)高倍鏡(×400)下以IDA-2000數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)(中國(guó)科學(xué)院北京空海科技發(fā)展有限公司)對(duì)Pf5-HT1A受體mRNA染色陽(yáng)性神經(jīng)元(胞漿棕黃色顆粒)進(jìn)行半定量分析。通過(guò)組織切片上的電極標(biāo)記點(diǎn)及神經(jīng)解剖結(jié)構(gòu)確認(rèn)Pf位置,隨機(jī)選取以標(biāo)記點(diǎn)為中心的周?chē)鶄€(gè)視野,每張切片隨機(jī)分析包括標(biāo)記點(diǎn)在內(nèi)的七個(gè)視野。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)5-ht1a受體的作用5-HT1A受體mRNA表達(dá)的比較C組Pf內(nèi)有散在的陽(yáng)性神經(jīng)元,形態(tài)呈不規(guī)則型;CAO組Pf內(nèi)陽(yáng)性神經(jīng)元增多,形態(tài)呈不規(guī)則型;TCAO組Pf中陽(yáng)性神經(jīng)元較CAO組明顯減少,胞漿著色較淺,細(xì)胞突起較少。MCAO組變化同TCAO組。5-HT1A受體mRNA陽(yáng)性單位、陽(yáng)性面積率、平均光度和積分光度表達(dá)的比較與CAO組比較,TCAO組和MCAO組上述指標(biāo)的表達(dá)降低(P<0.05)。與C組比較,CAO組以上指標(biāo)的表達(dá)升高(P<0.05),TCAO組和MCAO組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。5-HT及其受體是與痛覺(jué)調(diào)制有密切關(guān)系的神經(jīng)遞質(zhì)-受體系統(tǒng)。腦內(nèi)5-HT主要參與鎮(zhèn)痛作用,但不同類(lèi)型5-HT受體在痛覺(jué)生理和病理生理中發(fā)揮作用不同。在腦內(nèi),5-HT1A受體廣泛地分布于與痛覺(jué)有關(guān)的區(qū)域。5-HT1A受體可分布在突觸前膜或突觸后膜,若分布在5-HT神經(jīng)元胞體上,則稱(chēng)為自身受體。5-HT1A自身受體在腦干的激活抑制5-HT神經(jīng)元的電沖動(dòng),從而使5-HT神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少;而分布在突觸后膜上的5-HT1A受體激動(dòng)后除了調(diào)節(jié)5-HT的釋放外,還能引起去甲腎上腺素的釋放,從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究結(jié)果表明對(duì)照組Pf5-HT1A受體mRNA的表達(dá)處于一較低水平,CA06h后顯著增加。冠脈阻塞造成心肌缺血后,隨著心臟代謝功能的變化,各種痛敏介質(zhì)和促炎物質(zhì)通過(guò)多種途徑釋放出來(lái),通過(guò)外周和中樞痛覺(jué)敏感化的機(jī)制,造成大量化學(xué)性傳入通路的激活,從而引起心絞痛的傳入沖動(dòng)增加,通過(guò)丘腦Pf廣泛的神經(jīng)纖維聯(lián)系,使其接受的傷害性刺激也增加,最終導(dǎo)致Pf部位5-HT1A受體mRNA的轉(zhuǎn)錄和合成增加、表達(dá)增多。劉保堅(jiān)等認(rèn)為,中樞5-HT1A受體激動(dòng)后,通過(guò)抑制5-HT的釋放來(lái)調(diào)節(jié)交感和迷走神經(jīng)的活動(dòng),使交感神經(jīng)活性降低,心肌缺血傷害性刺激傳入沖動(dòng)減少。雷亞娟等研究認(rèn)為5-HT1A受體激動(dòng)劑烏拉地爾對(duì)心肌缺血誘發(fā)Pf痛敏神經(jīng)元的放電具有抑制作用,并被5-HT拮抗劑美西麥角所逆轉(zhuǎn)。本研究還觀(guān)察到曲馬多能夠抑制CAO誘導(dǎo)的5-HT1A受體mRNA表達(dá)增強(qiáng)。嗎啡具有類(lèi)似曲馬多作用。曲馬多有微弱的μ-阿片受體激動(dòng)劑活性,并能抑制神經(jīng)遞質(zhì)主要是5-HT和去甲腎上腺素的再攝取[O]。其(+)性對(duì)映體選擇性作用于μ-受體,而(-)性對(duì)映體則增加神經(jīng)元外5-HT的濃度,并抑制神經(jīng)元突觸對(duì)去甲腎上腺素的再攝取。這兩種對(duì)映