下丘腦室旁核ap敏感性鉀離子通道在大鼠炎性痛中的作用

下丘腦室旁核ap敏感性鉀離子通道在大鼠炎性痛中的作用

炎性痛的相關(guān)因素包括周圍組織損傷、缺血、缺氧和酸中毒。臨床治療中的炎癥疼痛是醫(yī)生面臨的難題。目前的研究主要集中在炎性痛與受體、離子通道、神經(jīng)遞質(zhì)的關(guān)系上。在炎性痛條件下,傷害性神經(jīng)遞質(zhì),如組胺和5-羥色胺等的釋放增加,刺激了外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)傷害性感受器,從而提高神經(jīng)細(xì)胞的興奮性,增加背根神經(jīng)節(jié)、脊髓和腦組織痛相關(guān)物質(zhì)的表達(dá)。ATP敏感性鉀離子通道廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)元,并調(diào)節(jié)其膜興奮性、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和參與神經(jīng)保護(hù)。研究表明,側(cè)腦室內(nèi)注入KATP通道開(kāi)放劑克羅卡林和吡那地爾可以增強(qiáng)皮下注射嗎啡引起的鎮(zhèn)痛作用,這種增強(qiáng)效應(yīng)可以被KATP通道特異性阻斷劑格列本脲消除,提示這種鎮(zhèn)痛作用的發(fā)揮與KATP通道有關(guān)。DAMGO(一種μ阿片受體激動(dòng)劑)注入丘腦中央下核(thalamicnucleussubmedius,Sm),減少脊髓背角c-Fos表達(dá)和抑制畏懼行為,而這種效應(yīng)可以被核團(tuán)內(nèi)預(yù)先注射格列本脲所阻斷。這說(shuō)明KATP通道可能在脊髓上水平參與疼痛信號(hào)調(diào)控。越來(lái)越多的研究顯示,下丘腦室旁核參與疼痛調(diào)控。因此,本研究采用一種常用的動(dòng)物疼痛模型———CFA誘導(dǎo)的炎性痛模型,用免疫組織化學(xué)的方法觀察炎性痛條件下下丘腦室旁核神經(jīng)元中KATP通道的表達(dá)變化和傷害性行為相關(guān)的脊髓背角c-Fos的表達(dá),為進(jìn)一步理解炎性痛的發(fā)病機(jī)制及探討KATP通道在炎性痛中的作用提供參考。1材料和方法1.1各類抗兔、二氮嗪和金屬酶兔抗kir6.2一抗(1∶200,AlomoneLabs,以色列);c-Fos一抗(1∶400,Abcam,美國(guó));FITC標(biāo)記的驢抗兔(1∶200,Millipore公司,美國(guó));組化試劑盒(北京中杉);二氮嗪(Sigma,美國(guó));激光共聚焦顯微鏡(FV1000,Olympus,日本);熱痛敏刺激儀(IITCseries8-390型,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所生產(chǎn))。1.2動(dòng)物的使用原則Sprague-Dawley大鼠,♂,250~280g,由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)在12h/12h明暗光線交替、22~24℃的安靜環(huán)境中,自由進(jìn)食、水。所有實(shí)驗(yàn)均遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用規(guī)范》。采用隨機(jī)數(shù)字法分為5組(每組6只):正常組(Normal組)、完全弗氏佐劑致炎性痛組(CFA組)、生理鹽水對(duì)照組(Saline組)、KATP通道特異性激動(dòng)劑二氮嗪組(Diaoxide組)和激動(dòng)劑溶媒對(duì)照組(Vehicle組)。1.3慢性炎性痛模型的建立將大鼠輕輕固定,用100μl微量注射器,盡快將用生理鹽水稀釋后的100μl濃度為50%的完全弗氏佐劑(CFA)注入大鼠左側(cè)后肢足底中心皮下,建立慢性炎性痛模型。對(duì)照組僅足底皮下注射生理鹽水100μl。CFA足底注射后大鼠產(chǎn)生典型的外周炎癥表現(xiàn),包括:注射局部的紅、腫、疼痛等,持續(xù)時(shí)間大于1周。1.4大鼠側(cè)腦室模型在致炎后d3,大鼠直接以水合氯醛麻醉(300mg·kg-1體重,ip),參照《大鼠腦立體坐標(biāo)圖譜》(PaxinosandWatson),于立體定位儀(日本)上向大鼠一側(cè)側(cè)腦室[前囟:(-1.6~1.8)mm;深:(7.8-8.0)mm;中縫向左右旁開(kāi)(0.3-0.6)mm]注射二氮嗪(diaoxide)25ng(溶于0.3μl0.5%DMSO中)。注射后15、30、60、240min后檢測(cè)熱痛閾。1.5熱痛敏刺激法在相同的時(shí)間段、相同的室內(nèi)溫度和濕度下進(jìn)行測(cè)定。按照Hargreaves法,將大鼠放置于3mm厚的15cm×15cm×15cm的有機(jī)玻璃箱中,待大鼠在其中適應(yīng)30min安靜后,用熱痛敏刺激儀照射大鼠左后肢足底后外側(cè)。從照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避的時(shí)間為TWL。光源刺激強(qiáng)度恒定不變。自動(dòng)切斷時(shí)間為25s,以防止組織損傷。每只動(dòng)物連續(xù)測(cè)定5次,測(cè)量間隔3min,取后3次比較平穩(wěn)的數(shù)據(jù)平均值為大鼠TWL。1.6腰髓細(xì)胞處理u2004大細(xì)胞菌群的表達(dá)大鼠用10%水合氯醛(300mg·kg-1)腹腔注射麻醉后,經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈插管,依次灌注37℃生理鹽水150ml沖洗和4℃、4%多聚甲醛溶液300ml固定,總灌注時(shí)間為1~1.5h。取大腦組織和脊髓后,放入4%多聚甲醛溶液中4℃后固定過(guò)夜;轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液中4℃脫水至組織沉淀。冰凍連續(xù)冠狀切片,熒光片厚40μm,取相應(yīng)腦組織節(jié)段的切片;取腰脊髓L4-5節(jié)段切片,片厚30μm。用0.01mol·L-1PBS(NaCl8.0g,KCl0.2g,NaH2PO40.24g,Na2HPO43.63g;pH7.4)沖洗切片3次×5min/次。1.7抗c-fos一抗兔模型選取完整切片至24孔孵育板中,加入含0.3%Triton-100的10%驢血清封閉液,室溫封閉2h;加入兔抗kir6.2一抗(1∶200)或兔抗c-Fos一抗(1∶400),4℃孵育48h;0.01mol·L-1的PBS沖洗3次×5min/次;暗室中加入FITC標(biāo)記的驢抗兔(1∶200),4℃孵育過(guò)夜,0.01mol·L-1的PBS沖洗3次×5min/次,貼片、室溫干片、50%甘油封片,激光共聚焦顯微鏡避光下放大100倍、400倍,對(duì)腦和脊髓組織切片進(jìn)行觀察并攝片。免疫對(duì)照組用PBS代替一抗,其余步驟同前。1.8兩組part陽(yáng)性小鼠骨髓ca-c-fos陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)免疫熒光染色切片采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)觀測(cè)。光鏡切片細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:各例動(dòng)物取相同層面KATP陽(yáng)性細(xì)胞最集中的4張腦和脊髓組織切片,于100倍放大,在固定部位截取一屏(脊髓組織取脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板層恒定位置)分別計(jì)數(shù)KATP陽(yáng)性和c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法所有計(jì)量資料均用ue0af±s表示,采用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并生成統(tǒng)計(jì)圖表。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)多組比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),組間兩兩比較采用q檢驗(yàn);兩組比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1兩組大鼠ldb、ld50、kCFA組和Saline組之間,術(shù)前TWL差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。左側(cè)足底皮下注射CFA致炎后d1、d3、d7,TWL明顯降低,低于術(shù)前的基礎(chǔ)值(P<0.01);與Saline組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)伴有患足紅腫、行走困難及提縮患爪等一些保護(hù)性行為,而且這一效果持續(xù)至少3d,然后才逐漸減輕。Saline組大鼠術(shù)前和術(shù)后的TWL未見(jiàn)明顯變化,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CFA致炎后d3、d7,腰段脊髓背角的c-Fos表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)Fig1、2。2.2fa致炎后兩組大鼠腦片中katp陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較CFA組和生理鹽水組均可見(jiàn)KATP陽(yáng)性細(xì)胞。CFA致炎后d3和d7,大鼠腦片中計(jì)數(shù)到的KATP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯小于Saline組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見(jiàn)Fig3。2.3在dvn中注射特定的c-fos緩沖液后，大鼠的疼痛行為以及脊柱后部的c-fos的高度3part的藥物作用ATP敏感性鉀離子通道是一種受神經(jīng)遞質(zhì)或細(xì)胞內(nèi)ATP調(diào)控的內(nèi)向整流鉀通道,ATP濃度升高時(shí)其開(kāi)放率明顯下降?，F(xiàn)有的研究顯示,KATP通道存在于大鼠的中樞神經(jīng)元及脊髓背角神經(jīng)元上,調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,可能與疼痛調(diào)控的相關(guān)機(jī)制有關(guān)。Wu等研究發(fā)現(xiàn)坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(chronicconstrictioninjuryofthesciaticnerve,CCI)術(shù)后,在神經(jīng)損傷的同側(cè)可發(fā)現(xiàn)脊髓背角KATP亞基表達(dá)均下調(diào),伴隨著熱痛和機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏;足底局部注射KATP通道激動(dòng)劑磺脲類藥物能拮抗足底注射低劑量雙氯芬酸對(duì)福爾馬林致炎性痛的治療效應(yīng)。這些研究都說(shuō)明KATP通道參與了疼痛的發(fā)生過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)采用了一種常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,CFA誘導(dǎo)的炎性痛。該模型能成功模擬病理性疼痛典型的自發(fā)痛、痛覺(jué)過(guò)敏和觸誘發(fā)痛等癥狀,并維持一段時(shí)間,結(jié)果證實(shí),大鼠CFA致炎后d1TWL即降低,直到d3都維持在較低水平。研究表明,生理性刺激大鼠初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元能引起脊髓背角突觸后神經(jīng)元的c-Fos表達(dá),傷害性熱刺激也能升高脊髓背角Ⅰ、Ⅱ板層c-Fos的表達(dá),而嗎啡預(yù)處理可以減少上述c-Fos的表達(dá)。這從另一方面說(shuō)明藥物對(duì)疼痛的治療作用也可以通過(guò)免疫組化標(biāo)記c-Fos來(lái)反映。c-Fos表達(dá)可作為傷害性刺激后疼痛傳導(dǎo)和調(diào)控的標(biāo)志,c-Fos表達(dá)與疼痛狀態(tài)相對(duì)應(yīng)。我們的研究發(fā)現(xiàn),免疫組化顯示,CFA注射同側(cè)的脊髓背角有c-Fos表達(dá)且主要表達(dá)在與疼痛相關(guān)的L4-5脊髓Ⅰ、Ⅱ板層,這些結(jié)果和上述關(guān)于c-Fos的相關(guān)研究一致;注射CFA后c-Fos表達(dá)增加,d3表達(dá)最高,這和疼痛行為學(xué)結(jié)果一致,從形態(tài)學(xué)上證明CFA炎性痛模型的成功。研究結(jié)果表明,疼痛模型下,疼痛信號(hào)相關(guān)解剖結(jié)構(gòu)的KATP通道蛋白表達(dá)下降;本實(shí)驗(yàn)免疫熒光結(jié)果顯示,在炎性痛條件下,下丘腦室旁核KATP通道表達(dá)下降,d3下降最明顯,這與疼痛行為學(xué)變化是一致的。這說(shuō)明室旁核KATP通道可能參與炎性痛的發(fā)生過(guò)程。疼痛最明顯的d3,室旁核注射KATP通道特異性激動(dòng)劑二氮嗪能逆轉(zhuǎn)CFA致炎引起的熱痛敏,同時(shí)可減輕疼痛誘發(fā)的脊髓背角c-Fos的表達(dá),進(jìn)一步為室旁核KATP通道參與炎性痛的調(diào)控提供證據(jù)。在脊髓水平,去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)通過(guò)激活中間神經(jīng)元的內(nèi)源性阿片受體,阿片受體進(jìn)一步激活KATP通道,從而產(chǎn)生抗傷害性刺激的作用。實(shí)驗(yàn)表明,電刺激引起的疼痛模型下,下丘腦內(nèi)源性相關(guān)肽(甲硫氨酸腦啡肽、β內(nèi)啡肽)水平增加,而研究證實(shí)大鼠下丘腦室旁核NE在疼痛的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果,我們推測(cè)下丘腦室旁核KATP通道可能是通過(guò)NE激活室旁核的內(nèi)源性阿片肽受體,從而進(jìn)一步激活KATP通道,參與炎性痛發(fā)生和調(diào)控的過(guò)程。綜上所述,通過(guò)對(duì)下丘腦室旁核KATP通道表達(dá)與炎性痛引起的機(jī)械痛和熱痛敏之間的關(guān)系的研究,我們推測(cè)下丘腦室旁核KATP通道可能參與疼痛的發(fā)生和調(diào)控過(guò)程,為炎性痛的發(fā)生機(jī)制及治療提供新的線索,為臨床治療炎性痛提供新的參考。外周