嚴(yán)重創(chuàng)傷大鼠下丘腦熱休克蛋白70與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的變化

嚴(yán)重創(chuàng)傷大鼠下丘腦熱休克蛋白70與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶轉(zhuǎn)錄表達(dá)的變化

傷口被認(rèn)為是“現(xiàn)代文明社會(huì)疾病”。嚴(yán)重的傷口會(huì)導(dǎo)致許多副作用和副作用。創(chuàng)傷應(yīng)激時(shí)下丘腦作為應(yīng)激反應(yīng)的重要調(diào)控中樞，下丘腦的損傷和功能異?？赡苁菓?yīng)激不良發(fā)生的重要因素。以往的研究認(rèn)為一氧化氮（NO）蛐iNOS和HSP70是兩種重要的急性期反應(yīng)蛋白。嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)HSP70與iNOS在下丘腦損傷與抗損傷機(jī)制中的作用，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用胸部撞擊傷+股骨骨折的多發(fā)傷模型，應(yīng)用免疫組化和原位雜交技術(shù)研究嚴(yán)重創(chuàng)傷早期下丘腦內(nèi)HSP70與iNOS及其mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況。材料和方法1常規(guī)染色、產(chǎn)物的染色及原位核酸雜交采用3個(gè)月齡的健康雄性Wister大鼠63只，體重267.8±13.4g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（6只）和致傷組（48只）。用1.5%戊巴比妥鈉（20mg蛐kg）麻醉，對(duì)照組只麻醉不致傷。創(chuàng)傷組麻醉后，應(yīng)用BIM-Ⅲ型生物撞擊機(jī)撞擊大鼠右胸中上1蛐3交界處。彈道壓力420kPa，彈距1cm。撞擊后立即折斷一側(cè)股骨中段。分別于傷后0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h和24h活殺，用4%多聚甲醛DEPC固定液經(jīng)心臟灌注固定，解剖并開顱取腦組織，恒冷冰凍切片行常規(guī)染色和特異性染色。其中9只大鼠下丘腦標(biāo)本經(jīng)戊二醛、鋨酸后固定行電子顯微鏡觀察。采用S-ABC免疫組化染色法。試劑為Sigma公司的小鼠抗HSP70抗體及博士德公司免疫組化染色試劑盒。將冰凍切片經(jīng)新鮮配制的0.3%H2O2甲醇處理后滴加封閉液，室溫10min，滴加小鼠抗大鼠的抗體，0.01MPBS洗滌。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG。滴加試劑SABC，洗滌后DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。對(duì)照實(shí)驗(yàn)于作用液中不加一抗，結(jié)果均為陰性。應(yīng)用原位核酸雜交技術(shù)。試劑為博士德公司的ISHDetectionKit，其探針為地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針。將經(jīng)甲醇處理的冰凍切片，胃蛋白酶37℃消化3min，預(yù)雜交2h。滴加20μl含地高辛標(biāo)記探針的雜交液，恒溫箱38℃雜交20h。37℃水溫的2×SSC洗滌。滴加雜交穩(wěn)定液。滴加封閉液，滴加兔抗地高辛，滴加生物素化山羊抗兔IgG,滴加試劑SABC,洗滌后DAB顯色。蘇木素輕度復(fù)染。對(duì)照實(shí)驗(yàn)采用不含探針的雜交液，結(jié)果均為陰性。將不同時(shí)相點(diǎn)的免疫組化、原位雜交的圖像輸入計(jì)算機(jī)，求出單位面積中陽性細(xì)胞數(shù)，應(yīng)用Tiger圖像分析系統(tǒng)測(cè)定染色強(qiáng)度。所得數(shù)據(jù)用醫(yī)學(xué)數(shù)理統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。肺損傷的部位及創(chuàng)傷評(píng)分（1）創(chuàng)傷后即刻出現(xiàn)呼吸暫停，一般持續(xù)20秒～1min繼之逐漸出現(xiàn)深慢呼吸及隨后的長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)性淺快呼吸越60～90次蛐min。（2）心動(dòng)過速，心率大于200次蛐min。（3）解剖見右肺兩葉以上大片狀出血，一般肺根部傷情最嚴(yán)重（受力中心點(diǎn)），部分動(dòng)物出現(xiàn)左上肺出血或水腫（可能為胸腔對(duì)沖傷所致），氣管和支氣管內(nèi)可見血性或泡沫狀分泌物，個(gè)別出現(xiàn)肋骨骨折、血?dú)庑丶捌は職饽[，股骨骨折位于中段血腫量2～3ml。創(chuàng)傷評(píng)分ISS=18，死亡率在20%，主要死因?yàn)樾奶E停、急性呼吸衰竭及血?dú)庑氐?。?chuàng)傷后下丘腦組織大體及光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)正常，未見組織水腫、出血、壞死等病理改變。電鏡觀察僅見下丘腦細(xì)胞內(nèi)線粒體輕度腫脹。2.hsp80的表達(dá)正常對(duì)照組下丘腦HSP70僅為低水平的基礎(chǔ)表達(dá)，而iNOS則無基礎(chǔ)表達(dá)。HSP70主要在神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)，位于胞漿及突起處，主要集中于室旁核；而iNOS在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中均有表達(dá)，染色細(xì)胞體積較小，在下丘腦分布廣泛。創(chuàng)傷后1h下丘腦內(nèi)HSP70普遍性表達(dá)增強(qiáng)（P<0.05),6h達(dá)到高峰（18倍）,24h陽性細(xì)胞數(shù)減少,主要集中在下丘腦室旁核，而且室旁核特異性染色強(qiáng)度更高（3.5倍），其它部位明顯減弱減少僅見痕量表達(dá)（圖1）。iNOS在正常對(duì)照組及創(chuàng)傷后0.5h內(nèi)均未見陽性染色，創(chuàng)傷后1h開始出現(xiàn)，2～6h明顯增多增強(qiáng)（P<0.05），其高峰期出現(xiàn)在8h(增加13倍)，24h表達(dá)有所下降（圖2）。HSP70和iNOS兩者表達(dá)量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)γ=0.97601。3inosmrna轉(zhuǎn)錄正常對(duì)照組HSP70mRNA轉(zhuǎn)錄水平僅為痕量，在創(chuàng)傷后0.5h即開始增加，4h達(dá)到高峰（11倍），6h以后穩(wěn)定在較高水平（6倍）。iNOSmRNA轉(zhuǎn)錄在創(chuàng)傷后1h才開始出現(xiàn)僅為痕量，4h達(dá)到高峰（13倍），以后稍有下降。兩者的原位雜交的陽性分布區(qū)與免疫組化染色相仿。hsp60與inos的相互作用本實(shí)驗(yàn)采用胸部撞擊傷+單側(cè)股骨骨折的動(dòng)物模型來研究嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)，避開了機(jī)械力對(duì)下丘腦的直接損傷，重點(diǎn)突出了下丘腦在調(diào)節(jié)整體創(chuàng)傷應(yīng)激中的病理生理改變，具有較普遍的代表意義。致傷后下丘腦的大體及光鏡標(biāo)本均未發(fā)現(xiàn)有明確的形態(tài)學(xué)改變，電鏡下僅見輕微的線粒體腫脹，線粒體是對(duì)損傷最敏感的細(xì)胞器。同時(shí)發(fā)現(xiàn)HSP70和iNOS轉(zhuǎn)錄表達(dá)異常增高。這表明下丘腦對(duì)嚴(yán)重創(chuàng)傷的早期反應(yīng)主要是代謝和功能發(fā)生了改變，出現(xiàn)某些急性期基因表達(dá)及急性期蛋白合成增加。創(chuàng)傷產(chǎn)生的疼痛、失血缺氧、炎性因子等因素可引起中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)釋放或直接作用于下丘腦。其中炎性因子可以通過iNOS介導(dǎo)而造成神經(jīng)細(xì)胞的損害。文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)胞在受到內(nèi)毒素等炎性因子刺激后2h才開始表達(dá)iNOS。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)iNOS在創(chuàng)傷后1h即開始出現(xiàn)，高峰期出現(xiàn)在8h。與文獻(xiàn)報(bào)道相比出現(xiàn)時(shí)間早持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。其發(fā)生機(jī)制尚不清楚。由于炎性因子的大量合成需要在創(chuàng)傷后一定時(shí)間后發(fā)生，因此推測(cè)早期的iNOS產(chǎn)生與中樞興奮性遞質(zhì)增高及失血缺氧有關(guān)（作用迅速），而其持續(xù)高水平表達(dá)則由隨后大量產(chǎn)生的炎性因子所致。iNOS的特點(diǎn)是能高效快速產(chǎn)生大量NO，造成或加重神經(jīng)細(xì)胞興奮性損傷。Boczkowsk等和Tatsumi等均報(bào)道iNOS產(chǎn)生的NO直接抑制線粒體呼吸鏈，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低、能量失衡，威脅著細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性及細(xì)胞的完整性。HSP70的保護(hù)作用一般是通過分子伴侶作用，使蛋白質(zhì)正確折疊、組裝及轉(zhuǎn)位，維護(hù)細(xì)胞功能和生存的。此外，HSP70尚可提高細(xì)胞對(duì)低濃度ATP的耐受性，幫助線粒體恢復(fù)損傷。Moro等研究發(fā)現(xiàn)兩分子的HSP70與基質(zhì)Tim44結(jié)合成轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體，使多肽鏈得以進(jìn)入線粒體內(nèi)。以往的研究認(rèn)為神經(jīng)元HSP70的表達(dá)與神經(jīng)元的興奮性損傷密切相關(guān)。如Lowenstein等研究發(fā)現(xiàn)HSP70表達(dá)多出現(xiàn)在易因過度興奮而產(chǎn)生損傷的神經(jīng)元內(nèi)，而Tomimoto等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元受到可逆性或不可逆性損害時(shí)HSP70表達(dá)均可上調(diào)，但前者更明顯。我們發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重創(chuàng)傷后下丘腦HSP70增強(qiáng)，尤其是室旁核陽性細(xì)胞最多，且表達(dá)強(qiáng)度最高。表明室旁核內(nèi)的神經(jīng)元在嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)興奮性最強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，可能存在興奮性損傷。由于室旁核含有重要的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，是調(diào)控應(yīng)激激素分泌的關(guān)鍵部位，若出現(xiàn)興奮性損傷必然導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)異常。HSP70除具有重要的抗損傷作用外，可能還與調(diào)節(jié)下丘腦的神經(jīng)內(nèi)分泌功能有關(guān)。最近的研究表明，HSP70和iNOS之間尚存在著相互作用機(jī)制。如Calabrese等在實(shí)驗(yàn)中觀察到經(jīng)LPS、α-INF處理的星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的iNOS與HSP70應(yīng)激蛋白的合成增加相關(guān)聯(lián)，應(yīng)用iNOS抑制劑L-NMMA則HSP70合成減少；添加NO供體硝普鈉可使HSP70表達(dá)呈劑量依賴性增高。因此Calabrese認(rèn)為iNOS可以誘導(dǎo)HSP70的生成，而Lau等發(fā)現(xiàn)HSP70含量的增加導(dǎo)致iNOS活性的降低及減少iNOS后繼合成。Bellmann等認(rèn)為HSP70通過特異性上調(diào)P38信號(hào)傳導(dǎo)通路來調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)和活性。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)HSP70和iNOS在創(chuàng)傷后表達(dá)部位重疊，同步增多呈顯著相關(guān)，推測(cè)嚴(yán)