基于中空纖維的液相色譜法測定牛奶中替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的研究

基于中空纖維的液相色譜法測定牛奶中替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的研究

大環(huán)內酯類抗生素對革蘭氏菌和根生動物有很強的抑制作用，是動物的一般藥物。長期食用含抗生素殘留的動物源食品后,會對人體健康造成危害。目前各國對大環(huán)內酯類抗生素的殘留限量都作出了嚴格的規(guī)定,因此建立簡便、靈敏、快速的大環(huán)內酯類抗生素的分析方法具有重要意義。目前用于大環(huán)內酯類抗生素殘留的檢測方法主要有微生物檢測法、氣相色譜法、高效液相色譜法(HLPC)[3~4]和液相色譜-質譜聯(lián)用技術(LC-MS)[5~6]等。高效液相色譜法以其適于難揮發(fā)物質的分離測定而被廣泛應用于農(nóng)藥、獸藥殘留分析。在進行色譜分析時,樣品前處理往往是整個分析過程的重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的樣品前處理技術,如液-液萃取(LLE)存在操作繁瑣耗時,需要使用大量對人體和環(huán)境有害的有機溶劑,難以實現(xiàn)自動化等缺點。1999年,Pedersen-Bjergaard等首次提出了基于中空纖維的液相微萃取技術(HF-LPME)。它集采樣、萃取和濃縮于一體,具有成本低、裝置簡單,可與GC、HPLC、CE聯(lián)用等優(yōu)點。此外,纖維的使用是一次性的,避免了固相微萃取中交叉污染的問題。HF-LPME所需的有機溶劑量很少(幾至幾十微升),是一種對環(huán)境無害的樣品前處理新技術,在藥物、環(huán)境等分析領域有廣闊的應用前景。目前采用HF-LPME和液相色譜技術聯(lián)用測定大環(huán)內酯類抗生素的文獻報道不多見。本文將HF-LPME和高效液相色譜聯(lián)用,建立了牛奶中替米考星、麥迪霉素和交沙霉素3種大環(huán)內酯類抗生素的分析方法。1材料和方法1.1藥品、試劑和儀器甲醇、乙睛(色譜純),天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心;試驗用水為二次蒸餾水,經(jīng)0.45μm濾膜過濾;二氯甲烷、正庚烷、三氯甲烷、三乙胺、氫氧化鈉、磷酸(均為分析純),天津市天大化工實驗廠;甲苯(優(yōu)級純),天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司;替米考星、麥迪霉素和交沙霉素標準品,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,分別用甲醇配制成1.0mg/mL儲備液;牛奶購于當?shù)爻小?.2柱和固體培養(yǎng)基Waters600高效液相色譜儀、Millenium32色譜工作站、996二極管陣列檢測器、在線脫氣裝置,美國Waters公司;BaselineC18柱(4.6i.d.×250mm,5.0μm),石家莊奧美克醫(yī)藥科技有限公司;恒溫磁力攪拌器、5mL樣品瓶和微型轉子,Supelco公司;TGL-16B離心機,上海安亭科學儀器廠;MTN-2800D氮吹儀,天津奧特賽恩斯儀器有限公司;AccurelQ3/2聚丙烯中空纖維(內徑600μm,孔徑0.2μm,壁厚200μm,MembranaGmbH,德國);SK-1快速混勻器,常州國華電器有限公司;JL-120超聲波發(fā)生器,上海杰理科技有限公司。1.3測試方法1.3.1流動相、柱溫固定相:BaselineC18柱(4.6i.d.×250mm,5.0μm);流動相:甲醇-水(體積比70∶30,含0.25%三乙胺和0.30%磷酸);流速1.0mL/min;替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的檢測波長分別為289、231、231nm;柱溫:室溫;進樣量10μL。1.3.2萃取條件1.4標準溶液的制備和標準曲線的繪制1.4.1標準溶液的配制分別準確移取適量1.0mg/mL替米考星、麥迪霉素和交沙霉素儲備液于50mL容量瓶中,用甲醇配制成質量濃度分別為5.00、10.0、20.0、50.0、100、200、500μg/mL的系列混合標準溶液,于4℃保存?zhèn)溆谩?.4.2標準樣品的制備準確量取空白牛奶樣品9.8mL于50mL離心試管中,加入100μL36%醋酸,再分別加入100μL上述不同濃度的混合標準溶液,得到質量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5μg/mL的混合標準樣品溶液,渦旋混勻1min,在4000r/min下離心10min,取上清液調pH至8.5,并移取4.5mL于5mL樣品瓶中。按照本文1.3節(jié)的試驗條件萃取,進樣分析,每個濃度平行測定5次。以分析物的峰面積Y對混合標液質量濃度X(μg/mL)作標準曲線。1.5樣品溶液的制備準確量取實際牛奶樣品10mL于50mL離心試管中,加入100μL36%醋酸,渦旋混勻1min,在4000r/min下離心10min,取上清液調pH至8.5,并移取4.5mL于5mL樣品瓶中。按照本文1.3節(jié)的試驗條件萃取,進樣分析。2結果與討論2.1流動相ph值的控制以甲醇-水為流動相,考察了流動相組成對3種化合物分離的影響。結果表明,流動相甲醇與水的體積比為70/30,流速為1.0mL/min時,3種抗生素可獲得較好的分離。為了改善峰形,在水相中加入少量的三乙胺,再加入少量磷酸調節(jié)流動相pH值。經(jīng)試驗優(yōu)化,確定流動相中三乙胺和磷酸的含量分別為0.25%和0.30%。2.2m波長范圍內的峰信號采用二極管陣列(DAD)檢測器,可同時檢測200~400nm波長范圍內的峰信號。替米考星、交沙霉素和麥迪霉素的最大吸收波長分別為289、231、231nm,因此在289nm處定量檢測替米考星,在231nm處定量檢測麥迪霉素和交沙霉素。2.3限制條件優(yōu)化2.3.1避免揮發(fā)性合適的有機溶劑是提高萃取效率的關鍵。該有機溶劑不僅要與纖維有良好的親和力,而且要不溶于水,揮發(fā)性低,有適當?shù)酿ざ?以防止擴散和揮發(fā)損失。分別以二氯甲烷、三氯甲烷、正庚烷、甲苯為萃取溶劑研究它們對萃取效率的影響。因二氯甲烷和三氯甲烷的揮發(fā)性較大導致溶劑部分損失,故未被采用。甲苯的萃取效率比正庚烷高,最終選擇甲苯為萃取溶劑。2.3.3萃取時間的影響液相微萃取過程是一個基于分析物在樣品與有機溶劑(或受體)之間分配平衡的過程。萃取時間也是影響萃取效率的一個重要因素。考察了不同萃取時間對萃取效率的影響(見圖3)。圖3表明,萃取時間20min時,萃取效果最佳。萃取時間繼續(xù)延長,萃取溶劑有部分損失,萃取效率反而降低,故選擇萃取時間20min。2.3.4萃取速度和萃取效率的關系在HF-LPME中,攪拌樣品溶液使纖維外側的樣品溶液不斷更新,可縮短達到萃取平衡所需的時間,從而提高萃取效率。但如果攪拌速度太快,纖維壁外側容易產(chǎn)生氣泡,加速萃取溶劑揮發(fā),從而影響萃取的準確性和重現(xiàn)性。考察了攪拌速度600~1500r/min對萃取效率的影響,如圖4所示。當轉速為1000r/min時,3種待測物的萃取效率均達到最大值。因此,選擇磁力攪拌速度為1000r/min。2.3.5萃取效率的影響因素萃取過程中在樣品溶液中加入鹽會影響待測物在水相中的溶解度,從而影響萃取效率?？疾炝薔aCl含量0%~20%對3種抗生素萃取效率的影響。結果表明,隨鹽濃度的增大,替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的萃取效率逐漸降低,因此,本試驗中不添加NaCl。2.4xg/ml作工作曲線在優(yōu)化的試驗條件下,對系列樣品混合標準溶液進行萃取、測定。以峰面積Y對質量濃度X(μg/mL)作工作曲線,結果見表1。替米考星、麥迪霉素和交沙霉素質量濃度在0.05~5μg/mL之間呈良好的線性關系,相關系數(shù)(r2)分別為0.9978、0.9986和0.9989,檢出限分別為5、2、2ng/mL(SN=3)。2.5萃取溶劑初始濃度ci按公式E=Co,eq/Ci計算富集倍數(shù),其中Co,eq為分析物在萃取溶劑中的濃度,Ci為樣品溶液的初始濃度,結果見表1。替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的富集倍數(shù)分別為34、52和47倍,表明HF-HPME對這3種大環(huán)內酯類抗生素的富集效率較高。2.6回收率試驗與實際樣品分析2.6.1加標回相色譜法的準確度為了驗證方法的準確度和可靠性,做加標回收率試驗。在10mL空白牛奶樣品中分別加入不同濃度的替米考星、麥迪霉素和交沙霉素混合標樣,按照試驗方法萃取測定,結果見表2。替米考星、交沙霉素和麥迪霉素6次測定的平均回收率在79.0%~105.3%之間,相對標準偏差RSD在5.3%~9.4%之間,表明本法具有較高的準確度?？瞻着Ｄ虡悠泛图訕藰悠?0.1μg/mL)的色譜圖見圖5(289nm和231nm)。HF-LPME的試驗裝置如圖1所示。將中空纖維在丙酮中超聲清洗5min,晾干后截取7cm,再將中空纖維在甲苯中浸泡1min使纖維壁微孔中充滿甲苯。用注射器A向中空纖維中注入20μL甲苯,迅速將纖維浸入4.5mL樣品溶液中,并在另一端插入注射器B以免甲苯揮發(fā)。在室溫、攪拌速度1000r/min條件下萃取20min,用注射器B抽出萃取溶液,置于0.5mL離心管中,室溫下氮氣流吹干,用12μL乙腈溶解,進樣10μL進行色譜分析。2.3.2ph值的選擇pH值能改變分析組分在樣品溶液與萃取溶劑之間的分配系數(shù),從而影響萃取效率。大環(huán)內酯類抗生素在中性或弱堿性溶液中較為穩(wěn)定。本試驗中考察了pH7.5~10.0對萃取效率的影響(見圖2),結果表明,隨著pH值的升高,3種抗生素的萃取效率逐漸提高,當pH8.5時萃取效率最高。pH值繼續(xù)升高,萃取效率反而降低,故選擇樣品溶液pH8.5。2.6.2牛奶中替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的殘留情況按照本文1.5節(jié)實際樣品分析方法檢測伊利、蒙牛及市售鮮奶3種牛奶樣品。在前兩種商業(yè)品牌的牛奶中未檢出替米考星、麥迪霉素和交沙霉素殘留,僅在市售鮮奶樣品中檢出了替米考星,其殘留量為0.058μg/mL。鮮奶樣品的色譜圖見圖6(289nm)。3萃取方法的確定本文應用基于中空纖維的液相微萃取(HP-LPME)新技術建立了牛奶樣品中替米考星、麥迪霉素和交沙霉素的高效液相色譜分析方法。對影響HP-LPME的試驗條件進行了優(yōu)化。此方法對3