豬下丘腦內(nèi)開(kāi)花樣內(nèi)orexina的分布

豬下丘腦內(nèi)開(kāi)花樣內(nèi)orexina的分布

1998年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)遺產(chǎn)（也稱為殘留素和殘留因子）是1998年發(fā)現(xiàn)的一種神經(jīng)遺產(chǎn)。它可以調(diào)節(jié)動(dòng)物的喂食、睡眠和覺(jué)醒周期、神經(jīng)內(nèi)政部、生殖和內(nèi)臟活動(dòng)。開(kāi)胃素有開(kāi)胃素A(33肽)和開(kāi)胃素B(28肽)兩種,它們都是前開(kāi)胃素原(propreorexin)的蛋白水解產(chǎn)物。人、豬、犬、牛和鼠的開(kāi)胃素A的氨基酸序列一致;豬和犬的開(kāi)胃素B序列一致,與人的開(kāi)胃素B只有1個(gè)氨基酸差異。開(kāi)胃素通過(guò)其受體發(fā)揮作用。開(kāi)胃素受體有兩種亞型:OX1R和OX2R,屬寡受體家族的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)。關(guān)于開(kāi)胃素及其受體在人、小鼠、大鼠、綿羊和雞的分布都有報(bào)道。開(kāi)胃素在腦內(nèi)主要分布于下丘腦的外側(cè)區(qū),在某些外周器官(胃腸道、胰、睪丸、垂體、松果體和腎上腺等)也存在。開(kāi)胃素受體的分布更為廣泛。但關(guān)于豬開(kāi)胃素及其受體的分布定位僅見(jiàn)Lin等少量報(bào)道,未見(jiàn)詳細(xì)的研究報(bào)道。本試驗(yàn)用免疫組織化學(xué)方法研究了開(kāi)胃素A在豬下丘腦各核團(tuán)內(nèi)的分布,為探討開(kāi)胃素的作用部位及其生理功能提供形態(tài)學(xué)資料。1材料和方法1.1疫組化染色試劑盒和aec顯色試劑1月齡健康蘇鐘仔豬5頭,購(gòu)自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種豬場(chǎng)。即用型SABC免疫組化染色試劑盒和AEC顯色試劑均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。開(kāi)胃素A(C-19)抗血清(SC-8070),由SantaCruzBiotechnologyInc生產(chǎn),購(gòu)自上海吉泰科技有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1mlk-1的麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射20g·L-1氨基甲酸乙酯(5mL·kg-1)麻醉,經(jīng)心臟灌注用0.1mol·L-1PBS配制的4g·L-1多聚甲醛固定。固定后取下丘腦,置同一固定液中后固定4～6h。1.2.2冰激凌切片固定好的組織塊經(jīng)0.1mol·L-1PBS充分洗滌后,置于用0.1mol·L-1PBS配制的20g·L-1蔗糖溶液,在4℃待其下沉后做冰凍切片。片厚20μm,貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上,室溫干燥后置于-20℃冰箱備用。1.2.3不同的免疫組化切片經(jīng)37℃恒溫箱干燥過(guò)夜后,按以下程序進(jìn)行操作:①切片經(jīng)蒸餾水洗滌5min;②用新鮮配制的0.5%H2O2/甲醇室溫處理30min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,蒸餾水洗滌3次;③正常兔血清封閉(室溫,30min);④加一抗:山羊開(kāi)胃素A抗血清(37℃,置濕盒中)孵育1.5h;⑤加二抗:生物素標(biāo)記的二抗(37℃)孵育30min;⑥SABC溶液中(37℃)作用30min;⑦顯色:AEC顯色10～30min。對(duì)照實(shí)驗(yàn):用0.1mol·L-1PBS代替一抗,其余步驟不變。1.3觀察用Olympus雙目顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察,并選取典型部位顯微拍照。2免疫陽(yáng)性細(xì)胞分布實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,開(kāi)胃素A免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞體分布于豬下丘腦的視前內(nèi)側(cè)區(qū)、室周核、室旁核、視上核、背內(nèi)側(cè)核、穹隆周核、乳頭體核、前區(qū)、外側(cè)區(qū)和后區(qū)等部位,以下丘腦外側(cè)區(qū)、乳頭體核和視上核出現(xiàn)的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元最多,以室周核的最少(圖1、圖2-1～圖2-8)。陽(yáng)性神經(jīng)元胞體形態(tài)多樣,胞漿內(nèi)有紅色顆粒沉著,胞核內(nèi)無(wú)紅色顆粒沉著。對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性(圖2-9)。免疫陽(yáng)性細(xì)胞詳細(xì)分布情況如下:下丘腦外側(cè)區(qū)出現(xiàn)大量的開(kāi)胃素A免疫陽(yáng)性神經(jīng)元(圖2-1),并且主要分布于穹隆周圍區(qū)。神經(jīng)元呈三角形、卵圓形或紡錘狀,突起比較明顯,以中、小型細(xì)胞為主。視上核有大量開(kāi)胃素A免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布,但神經(jīng)元免疫反應(yīng)較弱,細(xì)胞形態(tài)多樣,多屬小型細(xì)胞,分布比較密集。室旁核開(kāi)胃素A免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布較為密集(圖2-2),胞體較大,多為卵圓形,突起比較明顯。乳頭體出現(xiàn)大量的開(kāi)胃素A免疫陽(yáng)性神經(jīng)元,其內(nèi)側(cè)核和外側(cè)核分布相似,但神經(jīng)元免疫反應(yīng)較弱。室周核出現(xiàn)少量開(kāi)胃素A免疫陽(yáng)性神經(jīng)元(圖2-3),細(xì)胞中等大小。視前內(nèi)側(cè)區(qū)陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量較少,散在分布(圖2-4),神經(jīng)元胞體較小,無(wú)明顯的突起。未定帶免疫陽(yáng)性神經(jīng)元多呈紡錘形,胞體中等大小(圖2-5)。下丘腦后區(qū)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布比較稀疏(圖2-6),胞體多為圓形或卵圓形。下丘腦前區(qū)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元胞體較大,數(shù)量不多。背內(nèi)側(cè)核免疫陽(yáng)性神經(jīng)元中等大小,為單極、雙極和多極神經(jīng)元(圖2-7)。穹隆周核免疫陽(yáng)性神經(jīng)元圍繞穹隆分布,數(shù)目不多,呈紡錘狀或三角形(圖2-8)。3評(píng)論員群體在煥腦之外區(qū)的生殖調(diào)控研究發(fā)現(xiàn)在人、鼠、犬、貓和猴腦內(nèi),開(kāi)胃素免疫陽(yáng)性神經(jīng)元主要位于下丘腦。綿羊的開(kāi)胃素免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布于下丘腦背內(nèi)側(cè)核、下丘腦外側(cè)區(qū)、未定帶和穹隆周核,少數(shù)細(xì)胞位于下丘腦后區(qū)。在大鼠腦內(nèi),開(kāi)胃素神經(jīng)元胞體僅見(jiàn)于下丘腦,雙側(cè)對(duì)稱地位于下丘腦外側(cè)區(qū),可能主要在穹隆周區(qū)。散在的開(kāi)胃素神經(jīng)元胞體也見(jiàn)于正中隆起、下丘腦后部、背側(cè)部、背內(nèi)側(cè)部、弓狀核和subincertal核。本研究結(jié)果與在嚙齒類和綿羊上獲得的結(jié)果有諸多相似之處,但也存在一些差異,如開(kāi)胃素A在豬視前內(nèi)側(cè)區(qū)、室周核、室旁核、視上核、乳頭體核和下丘腦前區(qū)等部位分布,文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的異同,既說(shuō)明開(kāi)胃素在種系發(fā)生上具有保守性,也反映出種間存在差異。下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、室旁核和外側(cè)下丘腦區(qū)屬于下丘腦食欲調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的“網(wǎng)絡(luò)中