泛素在真核生物中的應(yīng)用

泛素在真核生物中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)在生命過程中起著重要作用，如細(xì)胞信息的傳輸、物質(zhì)代謝和身體防御。目前，它在促進(jìn)泛素-蛋白酶原過程中能夠分解出蛋白質(zhì)。但近年來發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)(例如組蛋白)在被泛素化修飾后并不能使蛋白質(zhì)降解。本文僅就組蛋白的泛素化、去泛素化以及與乙?；⒓谆姿峄g的關(guān)系作一簡(jiǎn)單介紹。1蛋白質(zhì)的多泛素化修飾泛素(ubiquitin,Ub)是高度保守的、含76個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),分子量為8.5kDa,在真核生物體內(nèi)廣泛存在。泛素分子氨基端1~72位點(diǎn)的氨基酸殘基形成一個(gè)緊密折疊的球狀結(jié)構(gòu),緊靠羧基端的4個(gè)氨基酸殘基是隨機(jī)盤繞的。蛋白質(zhì)的泛素化修飾就是蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基位點(diǎn)與泛素分子的羧基末端相互結(jié)合的過程。由于泛素分子本身有7個(gè)賴氨酸殘基位點(diǎn),并且泛素本身的賴氨酸殘基也可以與泛素分子相互結(jié)合,因此底物蛋白的一個(gè)賴氨酸殘基可能結(jié)合多個(gè)泛素分子,這樣就形成了蛋白質(zhì)的多泛素化修飾。蛋白質(zhì)的多泛素化鏈中,泛素羧基末端76位點(diǎn)的甘氨酸殘基通常與前一個(gè)泛素分子的48、63、29或11位點(diǎn)的賴氨酸殘基結(jié)合[2~4]。48位點(diǎn)的賴氨酸殘基表面有連續(xù)的疏水片段,這個(gè)片斷是結(jié)合蛋白水解酶所必須的,也是底物被泛素化修飾后降解所必須的。當(dāng)泛素的賴氨酸殘基連接4個(gè)或者超過4個(gè)泛素標(biāo)簽時(shí),則底物蛋白就可能通過26S蛋白酶作用而降解。蛋白質(zhì)還可以被單泛素化修飾。單泛素化修飾就是底物蛋白的一個(gè)或幾個(gè)賴氨酸殘基僅結(jié)合一個(gè)泛素分子。單泛素化可能影響底物局部的三維空間結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的單泛素化修飾是可逆轉(zhuǎn)的、非蛋白質(zhì)水解的調(diào)控,可以調(diào)控如內(nèi)吞作用、組蛋白的活性、DNA修復(fù)等過程。真核細(xì)胞中泛素化修飾后的靶蛋白可能被降解﹑可能被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的特定部位,也有可能導(dǎo)致靶蛋白的功能發(fā)生變化,這主要取決于靶蛋白所加的泛素鏈的結(jié)構(gòu),以及泛素鏈的長(zhǎng)短。2沒有發(fā)現(xiàn)的統(tǒng)整體的泛素化泛素化調(diào)節(jié)途徑共有三類酶催化:泛素激活酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1),泛素接合酶(ubiquitinconjugatingenzyme,E2),泛素-蛋白質(zhì)連接酶(ubiquitinproteinligase,E3)。首先,由泛素激活酶催化,泛素的羧基末端與泛素激活酶的半胱氨酸激活位點(diǎn)以巰酯鍵(thiolesterbond)結(jié)合,此過程需要消耗ATP。第二步,泛素被轉(zhuǎn)運(yùn)到泛素接合酶的半胱氨酸殘基,也是以巰酯鍵的形式接合;接合酶共有超過20個(gè)這樣的半胱氨酸殘基激活位點(diǎn)。最后,在泛素連接酶的作用下,通過泛素的羧基末端與底物蛋白的賴氨酸ε-氨基基團(tuán)之間形成肽鍵(isopeptide)而將泛素轉(zhuǎn)移到底物蛋白上。E3對(duì)靶蛋白的特異性識(shí)別在泛素調(diào)節(jié)路徑中起決定作用。多聚泛素化需要以上三種酶的共同作用,而單泛素化一般僅需要前兩種酶。迄今為止,發(fā)現(xiàn)并且鑒定的E3主要有兩大類:HECT(homologoustotheE6-APcarboxylterminus)結(jié)構(gòu)域家族和RING(reallyinterestingnewgene)結(jié)構(gòu)域家族。HECT結(jié)構(gòu)域主要是通過與泛素形成催化作用所必需的硫酯鍵發(fā)揮作用,而RING結(jié)構(gòu)域?yàn)镋2和底物提供居留位點(diǎn)從而使E2催化泛素轉(zhuǎn)移到底物上。像乙?；土姿峄粯?組蛋白泛素化是可逆轉(zhuǎn)的調(diào)控。因此,組蛋白泛素化的動(dòng)態(tài)平衡過程由兩個(gè)因素決定:細(xì)胞內(nèi)可以利用的游離泛素和可以對(duì)組蛋白添加或移除泛素的酶的活性。將泛素加到組蛋白需要一系列酶E1、E2、E3的作用。泛素部分的移除需要肽酶(isopeptide)的活性。雖然所有蛋白質(zhì)的泛素化修飾使用相同的E1和不同的E2,但是不同蛋白質(zhì)的泛素化似乎需要特異性的E3。兩個(gè)芽殖酵母蛋白R(shí)ad6、Cdc34,在體外已經(jīng)顯示在沒有E3的存在下,能夠泛素化組蛋白H2B。然而,體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)僅Rad6是H2B泛素化所必須的。近來的研究顯示Rad6相關(guān)的RING蛋白Brel可能是H2B泛素化的E3,因?yàn)镽ING結(jié)構(gòu)域的Brel突變?cè)隗w內(nèi)取消了H2B的泛素化。研究還證明Rad6和Brel在進(jìn)化中是保守的。相對(duì)于酵母的Rad6,HR6A和HR6B是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的兩個(gè)同源物。實(shí)驗(yàn)表明HR6A和HR6B在體內(nèi)能夠部分的彌補(bǔ)酵母的Rad6突變,在體外能夠泛素化組蛋白H2B。在人類也發(fā)現(xiàn)了Brel兩個(gè)推定的同源盒。與H2B泛素化的情形不同,生物體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)H2A泛素化的E2、E3。體外研究發(fā)現(xiàn)純化的Rad能夠泛素化H2A、H2B。但是,還不清楚H2A和H2B在體內(nèi)是否擁有相同的E2。酵母中檢測(cè)不到H2A的泛素化,這阻礙了對(duì)E2、E3的研究。小鼠精子發(fā)生過程中uH2A的分析揭示了HR6B與uH2A有強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)。然而,在HR6B剔除小鼠體內(nèi)未檢測(cè)到uH2A。這個(gè)結(jié)果盡管可以解釋為HR6A和HR6B之間可能有功能上的重復(fù),但是也說明HR6B在H2A泛素化過程中可能沒有功能?？紤]到在哺乳動(dòng)物體內(nèi)還有兩個(gè)推定的Brel同源盒,HR6A和HR6B這兩個(gè)蛋白質(zhì)中是否有一個(gè)在體內(nèi)有E3的功能可能需要進(jìn)一步研究。3組蛋白hb作為基因組織的調(diào)控作用染色質(zhì)是一系列核小體相互連接成的念珠狀結(jié)構(gòu)。核小體的核心是由組蛋白H2A、H2B、H3、H4各兩個(gè)分子構(gòu)成的八聚體,在八聚體的表面纏繞有1.75圈的雙螺旋DNA。相鄰的兩個(gè)核小體之間由DNA連接,稱為纖絲(fiber),在纖絲部位結(jié)合有組蛋白分子H1。在組蛋白H1存在時(shí),核小體之間緊密接觸,形成直徑為10nm的纖維狀結(jié)構(gòu)。這就是染色體構(gòu)型變化的一級(jí)結(jié)構(gòu)。在染色質(zhì)中,DNA和組蛋白是染色質(zhì)的穩(wěn)定成分,組蛋白與DNA的含量之比接近1∶1。組蛋白是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)成分,通過帶正電荷的氨基末端區(qū)域與帶負(fù)電荷的DNA骨架相互作用,對(duì)基因的表達(dá)有重要調(diào)控作用。目前研究發(fā)現(xiàn),組蛋白除了可以被乙?；?、甲基化、磷酸化等修飾以外,還能被泛素化修飾。組蛋白H2A在1975年被首次發(fā)現(xiàn)有泛素化修飾,其泛素化修飾位點(diǎn)是高度保守的賴氨酸殘基119(K119)位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)在大量高等真核生物中H2A總量的5%~15%被泛素化,除了在芽殖酵母中沒有發(fā)現(xiàn)泛素化的組蛋白H2A(ubiquitinated-H2A,uH2A)以外,在許多組織和細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有多聚泛素化(polyubiquitination)的H2A。研究還發(fā)現(xiàn),組蛋白H2A的泛素化能夠促進(jìn)組蛋白H1與核小體的結(jié)合,促進(jìn)多聚梳群蛋白(polycombgroupprotein)的沉默,還在X染色體失活的起始過程中有重要作用。除了H2A以外,組蛋白H2B也可以被泛素化修飾。盡管染色質(zhì)中泛素化的組蛋白H2B量并不多,約占1%~2%,但是在從芽殖酵母到人類的真核生物中廣泛分布。H2B的泛素化位點(diǎn)也定位于羧基端的賴氨酸殘基:哺乳動(dòng)物的賴氨酸120(K120)位點(diǎn),芽殖酵母K123位點(diǎn)。對(duì)芽殖酵母S.cerevisiae的研究發(fā)現(xiàn),組蛋白H3的4位賴氨酸的二甲基化或三甲基化需要H2B的123位賴氨酸的泛素化,說明一個(gè)組蛋白亞單位的修飾能夠調(diào)控另一個(gè)不同亞單位的修飾;研究還發(fā)現(xiàn)H3的4位賴氨酸的甲基化能夠?qū)е露肆８浇虻某聊?因此H2B的甲基化能夠間接調(diào)控基因的沉默。Robzyk等研究發(fā)現(xiàn),H2B的123位賴氨酸泛素化位點(diǎn)的突變能夠影響有絲分裂細(xì)胞的生長(zhǎng)和減數(shù)分裂。在對(duì)人類乳腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn):組蛋白H2B在染色質(zhì)中的水平與正在進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄有關(guān),特別是依賴于核不均RNA(hnRNA)的合成。當(dāng)核小體在轉(zhuǎn)錄過程中開放時(shí),組蛋白H2B會(huì)被泛素化,并阻止核小體的重新折疊,以促進(jìn)下一輪的轉(zhuǎn)錄。此外,研究還發(fā)現(xiàn)泛素化的組蛋白H2B優(yōu)先富集于染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域,組蛋白H2B的泛素化還與聚合酶的延伸有關(guān),以上可以推測(cè)組蛋白H2B的泛素化能夠促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。研究還發(fā)現(xiàn)H2B的123位賴氨酸的泛素化還能影響H3的79位賴氨酸的甲基化。Ng等報(bào)道H2B的123位賴氨酸和H3的79位賴氨酸在核小體內(nèi)的空間位置非?？拷?H2B的123位賴氨酸的泛素化對(duì)H3的79位賴氨酸的甲基化很重要,但反過來H3的79位賴氨酸的甲基化對(duì)H2B的123位賴氨酸的泛素化卻沒有影響。綜上所述,組蛋白H2B的泛素化修飾對(duì)基因的表達(dá)有調(diào)控作用。Henry等通過對(duì)GAL1基因表達(dá)的研究,提出了一個(gè)組蛋白H2B泛素化調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的模型:GAL1基因的正常轉(zhuǎn)錄需要組蛋白H2B的泛素化和去泛素化修飾,并且泛素化過程非常短暫。首先組蛋白H2B發(fā)生泛素化修飾,H2B的泛素化修飾導(dǎo)致了H3的4位賴氨酸的甲基化;緊接著H2B發(fā)生去泛素化,這又誘使H3的36位賴氨酸甲基化,此時(shí)GAL1基因能夠正常轉(zhuǎn)錄。如果組蛋白H2B未發(fā)生泛素化,則H3的4位賴氨酸不會(huì)甲基化,此時(shí)H3的36位賴氨酸高甲基化,從而基因低水平轉(zhuǎn)錄。但是如果組蛋白H2B雖然發(fā)生了泛素化修飾,而隨后沒有去泛素化修飾,則H3的4位賴氨酸高甲基化、H3的36位賴氨酸低甲基化,此時(shí)基因仍然只能低水平轉(zhuǎn)錄。由此可見H2B去泛素化能夠促進(jìn)H3的4位賴氨酸和H3的36位賴氨酸之間的甲基化平衡,從而調(diào)控GAL1基因的正常轉(zhuǎn)錄。泛素化形式的H3不多,僅在大鼠睪丸變態(tài)的精子細(xì)胞中有發(fā)現(xiàn)。在對(duì)果蠅體外實(shí)驗(yàn)的研究發(fā)現(xiàn):真核生物基因轉(zhuǎn)錄所必須的通用轉(zhuǎn)錄因子TFIID的成分TAFII250,能夠參與組蛋白H1泛素化激活、共軛接合,這也是首次報(bào)道同一個(gè)蛋白質(zhì)內(nèi)有E1、E2兩種酶的活性。相比較而言,組蛋白H3、H1的泛素化形式比H2A、H2B少,目前也還沒有發(fā)現(xiàn)組蛋白H3、H1的泛素化位點(diǎn)。另外,核心組蛋白的變異體也發(fā)現(xiàn)有泛素化修飾。如巨大組蛋白H2A1.2(macroH2A1.2)的K115、K116位點(diǎn)等都發(fā)現(xiàn)有泛素化修飾。泛素化的macroH2A可以招募組蛋白H1到核小體以使染色質(zhì)進(jìn)一步壓縮,并且在雌性哺乳動(dòng)物的X染色體失活過程中,組蛋白H2A和macroH2A的泛素化可能有協(xié)同作用。各種組蛋白的泛素化修飾見表1。4ubp1細(xì)胞中心蛋白及ubp8催化的去泛素化酶泛素部分可以通過泛素76位點(diǎn)甘氨酸的肽鍵水解而移除。目前發(fā)現(xiàn)至少有90種去泛素化酶,并且這些酶有序列多樣性。由于細(xì)胞內(nèi)泛素不是游離的單體,而是以多聚泛素蛋白和泛素核糖體融合蛋白的形式存在,因此去泛素化酶是從多聚泛素鏈、泛素前體物質(zhì)和泛素綴合物中生成泛素單體的關(guān)鍵。去泛素化酶分為兩個(gè)家族:泛素羧基端水解酶家族(UbC-terminalhydrolase,UCH)和泛素特異性加工蛋白酶家族(Ub-specificprocessingprotease,UBP)。泛素羧基端水解酶家族分子量一般較小(除了BAP1,81kDa),約20~30kDa,并且有組織特異性。UCH家族的核心催化域與已知的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶非常相似,有230個(gè)氨基酸核心催化域,能夠水解泛素羧基端的酰胺基和酯鍵。UBP的核心催化域有350個(gè)氨基酸。芽殖酵母有16種UBP,分子量從50~250kDa不等。這些UBP間的不同在于其不同的氨基端延伸物,這些氨基端延伸物能夠識(shí)別底物特異性。第一個(gè)被分離出的UBP是Ubp4。Ubp4的突變導(dǎo)致酵母MATα2因子的降解缺陷,并且Ubp4負(fù)責(zé)將多聚泛素肽鏈從底物上移除。另外,研究顯示Ubp3與Sir4(與異染色質(zhì)沉默有關(guān))有關(guān),但是目前還不清楚這個(gè)泛素蛋白酶的底物。有研究發(fā)現(xiàn)Ubp8的突變(SAGA復(fù)合物的成分)會(huì)導(dǎo)致uH2B的增加。此外,野生酵母純化的SAGA復(fù)合物能夠在體外去泛素化H2B,而源自Ubp8缺失酵母的SAGA復(fù)合物卻沒有這種功能。Ubp3突變體未發(fā)現(xiàn)有這樣的效果,因而Ubp8對(duì)uH2B的影響可能是特異性的。在對(duì)芽殖酵母的研究發(fā)現(xiàn),H2B的泛素化是可逆轉(zhuǎn)的過程,泛素的移除是被Ubp8催化的。但是令人不解的是,在SAGA復(fù)合物中有兩種組蛋白修飾活性(去泛素化和乙?；?。研究發(fā)現(xiàn),Ubp8作為組蛋白H2B的去泛素化酶,能夠被招募到GAL10基因的上游激活序列,是GAL10基因表達(dá)所必須的。由于Ubp8的同源物存在于從植物到人類的大量的生物體內(nèi),因此Ubp8同源物是否參與H2A的去泛素化還有待研究。研究證實(shí)組蛋白的去泛素化與染色質(zhì)的凝集有關(guān)。組蛋白在有絲分裂間期是泛素化的,但在有絲分裂中期組蛋白被去泛素化,此時(shí)染色質(zhì)凝集成染色體。到有絲分裂后期染色體解聚成染色質(zhì)時(shí),組蛋白又被重新泛素化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離出一種去泛素化酶UbpM,發(fā)現(xiàn)UbpM也參與染色質(zhì)的凝集,突變后能夠阻滯細(xì)胞分裂。另外,組蛋白去泛素化酶Ubp10還能夠使組蛋白去泛素化而維持端粒的長(zhǎng)度和穩(wěn)定性。Mimnaugh等也發(fā)現(xiàn)組蛋白H2A的去泛素化與核固縮和染色質(zhì)凝集密切相關(guān),并且認(rèn)為這些信號(hào)是細(xì)胞凋亡的前兆。5基因組蛋白修飾的基因表達(dá)泛素化和磷酸化有幾個(gè)共同的特征:(1)二者都是可逆的共價(jià)結(jié)合修飾。磷酸化能被蛋白磷酸酶逆轉(zhuǎn);泛素化也能被肽酶或去泛素化酶逆轉(zhuǎn)。(2)反應(yīng)迅速。兩種修飾反應(yīng)都能在幾分鐘或幾秒鐘內(nèi)快速發(fā)生。(3)泛素化和磷酸化都是高度特異性的,并且被一系列不同的酶控制。人類基因組計(jì)劃證明有超過40種不同的E2、500種不同的E3、80種不同的去泛素化酶。研究還顯示人類有蛋白激酶518種、磷酸化酶120種。(4)泛素化和磷酸化都能通過結(jié)合特異性氨基酸的結(jié)構(gòu)域檢測(cè)。近年來的研究發(fā)現(xiàn),組蛋白的乙?；軌蚱茐暮诵◇w核心顆粒的穩(wěn)定性。另外,H2A、H2B的泛素化能夠減弱染色質(zhì)中H2A-H2B二聚體與H3-H4四聚體之間的相互作用。在精子發(fā)生過程中,如果轉(zhuǎn)錄起始和延伸確實(shí)需要H2A-H2B二