南京師范泰州學(xué)院問問

摘要豆枯草桿菌(Bacillussubtilislnatto)摘要豆枯草桿菌(Bacillussubtilislnatto)甲基紅試驗(yàn)，乙酰甲基甲醇試驗(yàn)，枸櫞酸利用試驗(yàn)，符合大腸桿菌性狀 umbellatus umbellatus polysaccharideofGrifolaumbellatawerestudiedbyultrasonicextractionmethod.Theresultsshowthat,thebestsinglefactorconditionatthesolid-liquidratiowas1g:40mL,extractiontimeis60min,thetemperature60℃,ultrasonicpoweris100W,comparedwiththeconventionalwaterextraction,ultrasonicextractioncansignificantlyimprovethePolyporusumbellatuspolysaccharidecontent,shortentheextractiontime,reducetheratioofmaterialtoliquidandlowerextractiontemperature.PurificationofPolysaccharidebyethanol,ethanolpurificationconditionsofoptimalresultsshowthat,intheethanolvolumeratio4,precipitationof15hattheconcentrationof100%,thehighestpurificationefficiency.AccordingtotheanalysisoftheresultsofPolyporusumbellatuspolysaccharideinnature,Polyporusumbellatuspolysaccharidewithreducingpower,andareductionincreaseswiththeincreaseoftheconcentrationofpolysaccharide;TLCresultsshowed,Polyporusumbellatuspolysaccharideforpolysaccharide,iscomposedofapluralityoffructosyllinkedbyglycosidicbondpolymerization;PolyporuspolysaccharidehadastrongerinhibitoryeffectonSalmonellacoli,aStaphylococcusaureuscouldnotKeywords:grifola;Polysaccharides;Ultrasonicextraction;Purification;ofthe前 本課題研究的背景及意 本課題研究的內(nèi) 納豆激酶生物學(xué)特性 前 本課題研究的背景及意 本課題研究的內(nèi) 納豆激酶生物學(xué)特性 形態(tài)特征 理化性質(zhì) 納豆主要成分 納豆激酶的提取方法 納豆激酶的生物活 血栓溶 抗菌及提高免疫作用 降血壓 降膽固 降血脂 抗氧化 納豆激酶的研究進(jìn) 納豆激酶的應(yīng)用前 2.1主要試劑的配 儀器設(shè) 2.2實(shí)驗(yàn)思 原始種子庫的制備 主種子庫的制 2.3小結(jié) 第三章納豆激原始種子庫的制備 主種子庫的制 2.3小結(jié) 第三章納豆激酶性質(zhì)檢 實(shí)驗(yàn)材料 3.1.1樣品 3.1.2藥品 主要試劑的配 儀器設(shè)備 菌種庫檢 平板劃線 革蘭氏染色鏡檢 抗生素抗性實(shí) 生化反應(yīng)試 3.5小結(jié) 第四章結(jié)果與討 4.1結(jié)論 4.2展望 22而平常用尿納豆激酶(NarroKunase，NK)由食品納豆中提取或納豆菌發(fā)酵生產(chǎn)，是一種分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于UK、SK、tPA的蛋白質(zhì)，并可由腸道，吸收，納豆激酶的體外、體內(nèi)溶栓性質(zhì)通過實(shí)驗(yàn)也已得到確定，納豆是日本的傳統(tǒng)食品,已食用千年.但從197酶,同時(shí)納豆激酶還具有很強(qiáng)的纖溶作用之后,納豆及其酶制劑便引起普遍關(guān)注.很多學(xué)者對其進(jìn)行了藥理學(xué)和治療或預(yù)防疾病的研究[1抗氧化等作用.與此同時(shí)一些食品生產(chǎn)和制造公司也對納豆作了深加工.如日本的大和制藥公司從納1.1納豆激酶的生物1.1納豆激酶的生物學(xué)特1.1.1納豆激酶的形態(tài)特枯草(納豆)桿菌(BacillussubtilisNatto)發(fā)酵而成的日本傳統(tǒng)食品。Sumi(1987)從納豆中發(fā)現(xiàn)了一種具高效溶纖活性的酶——納豆激酶(Nattokinase,NK),它是由枯草桿菌在納豆發(fā)酵過程中產(chǎn)生的一種t-PA,從而表現(xiàn)出很強(qiáng)的溶血栓作用。此外,它還具半衰期長,無毒副作用,分子量小,可以口服,N07,其納豆激酶酶活相當(dāng)于1384.73U/mL尿激酶酶活。N07,pro-NK)381個(gè)氨基酸組成,在分泌過程中切除N端106個(gè)氨基酸殘基而形成275個(gè)氨基酸的成熟分子，納豆激酶等電點(diǎn)為8.6±0.3。1.1.2納豆激酶的理化性1.2豆的主要成k21.2豆的主要成k2k21.3納豆激酶的提取方法425％飽和度，低溫過夜，4000rpm30min60％，低溫過夜，4000rpm30minSuperdex75SPSepharoseFastFlow[8］，發(fā)現(xiàn)經(jīng)硫析后，電泳可得到單一條帶的納豆蛋白產(chǎn)品，Mr27700。以上每一步都要進(jìn)行酶的活性測定。測定方法為：纖維蛋白塊溶解時(shí)間(CLT)1.6激酶的生物活1.6.1血栓溶1.6激酶的生物活1.6.1血栓溶納豆激酶的一個(gè)顯著功能便是具有溶解血栓的作用．MimuguF等人用血凝塊溶解分析法涮定PlasminPlasmin4倍；1.6.2提高免疫400-1570-1110-144病原性大腸桿菌以及其它病原菌諸如，金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、李斯特菌1.6.3降血1.6.4降低膽固醇預(yù)防動(dòng)脈硬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，納豆菌食品可以抑制血中的LDL氧化，有效降低總膽固醇以及三酸甘油酯的濃度，進(jìn)而減少粥狀動(dòng)脈硬化的發(fā)生，納對遺傳性高血壓的老鼠，對照組（大豆）血壓逐漸升33.3Pa(250mmHg),合用納豆的老鼠維持正常的 是因?yàn)榧{豆菌食品中含有angiotensinconvertingenzyme(ACE)的inhibitor，它會(huì)阻止angiotensin變成activeform1.6.5防止骨質(zhì)疏1.6.5防止骨質(zhì)疏納豆輔助補(bǔ)鈣的機(jī)理是：骨質(zhì)是由維生素K2和優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)先形成骨元蛋白，再與K2。大豆異黃酮能防止骨中鈣的溶解，而維生K2則能夠?qū)⑩}固定于骨中。也就是說，大豆異黃酮和維生素K2的組合能相互協(xié)力，起到強(qiáng)骨的作用緩型減肥直觀降低餐后血糖納豆菌在腸內(nèi)大約能堅(jiān)持1周左右，可以促進(jìn)其它有益菌增殖。腸內(nèi)細(xì)菌，重量約為1公斤。當(dāng)然它需要餌食供給。人體吸收的營養(yǎng)就成為腸內(nèi)細(xì)菌的餌食而被吞噬，再加上納豆激酶可燃燒脂肪,由此就能減肥。還有納豆粘物質(zhì)發(fā)揮了浸溶、包裹的作用。因而納豆減肥是緩型有效的,不會(huì)反彈。然而餐后血糖值出現(xiàn)明顯下降趨勢，是非常直觀的。一是納豆菌吞噬葡萄糖和粘物質(zhì)的作用,二是納豆中的高彈性蛋白酶（或稱胰肽酶E，Elastase）,抑制了血糖增加。它具有與豬胰臟所含的這種酶的作用，而豬胰腺的彈性蛋白酶已用于高血糖的治療藥物。解酒、保護(hù)肝臟納豆酶進(jìn)入人體后，通過三重渠道構(gòu)建酒精防護(hù)屏障：進(jìn)入人體肝臟系統(tǒng)，分解肝臟解酒壓力，協(xié)助解酒；進(jìn)入人體血管系統(tǒng)，在腦血管區(qū)域形成重點(diǎn)防護(hù)屏障，抵制酒精對大腦的抑制效應(yīng)；進(jìn)入人體消化道系統(tǒng)，迅速形成保護(hù)屏障，加速消化道酸性分泌，促進(jìn)解酒。服用納豆能迅速解決酒后不良反應(yīng)，并能預(yù)防隔日醉。此外，納豆中豆菌食品之所以具有這些功效，據(jù)推測應(yīng)該是來自於其高含量的抗氧化成份。1.7納豆激酶的國內(nèi)1.7納豆激酶的國內(nèi)外研究進(jìn)迄今為止,NakamuraNK基因Puc19質(zhì)粒上,E.coliHB101受體菌中,該基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物具有胞外蛋研究還未見報(bào)道,但與納豆激酶同源性很高的枯草桿菌蛋白E和枯草桿菌蛋白酶克隆amylosacchariticus(apr)基因,3種不同的枯草桿菌中(ISW1214,M1111,1A274),現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌株(ISW1214/PTH1)20倍4倍。MarkEPBS42上,轉(zhuǎn)化枯草桿菌,表達(dá)的5倍。凌均建等[23]PBS1轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)E基因圖譜。研究表明,克隆化的枯草桿菌蛋白酶基因只在靜止生長期表達(dá),并且受37啟動(dòng)子的控制。Talagi等[24]E基因克隆到嗜熱2090年代開始,我國掀起了對納豆激酶的研究和開發(fā)熱潮,一的多種活性物質(zhì)活化肝細(xì)胞，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，提高肝功能，保護(hù)肝臟，有效預(yù)防改善脂肪肝。所以在日本廣為流行一個(gè)諺語：“喝酒時(shí)多吃納豆防二日醉酒”有400多家工廠生產(chǎn)納豆及納豆激酶產(chǎn)品,供應(yīng)國內(nèi)外。目前認(rèn)為日本大和制藥有限公產(chǎn)品(453GMP2有400多家工廠生產(chǎn)納豆及納豆激酶產(chǎn)品,供應(yīng)國內(nèi)外。目前認(rèn)為日本大和制藥有限公產(chǎn)品(453GMP2酶產(chǎn)品,為復(fù)方制劑,產(chǎn)品名稱為納豆激酶(65美元/盒),作為食品補(bǔ)劑和功能食品在國溶解作用試驗(yàn),具有明顯效果,其研制的納豆激酶制劑恩開膠囊已處于中試階段納豆激酶的基因工程菌,表達(dá)量可達(dá)40%以上,建立了用工程菌生產(chǎn)納豆激酶的純化工納豆激酶菌種庫的建立的研納豆激酶（菌種2.1.22.1.3主要試劑的配2.1.4儀器設(shè)PH2.2目的以菌種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中的最2.1.4儀器設(shè)PH2.2目的以菌種驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中的最佳單 3#，擴(kuò)培制備原始種子庫，通過原始種子庫制備種子庫，再通過主種子庫制備工作種子庫原始種子庫制板培養(yǎng)基；配制LB液體培養(yǎng)基500ml，分裝：50ml/250ml8瓶，LBAmp/IPTG//100ml/500ml2100ml/500ml2瓶。另準(zhǔn)備潔凈的50ml離心管（裝液量5ml），30支1.5ml離心300支，試管15支，培養(yǎng)皿10個(gè)，121℃滅20min，備用2.3.2.制備原始種子庫：過程:制備2瓶LB培養(yǎng)基各100ml，在平板上取表達(dá)最好的單LB1:1000AMP抗生素，放入搖床中600nmOD0.8~1.0時(shí)，停止20%）100支號，-20℃，保存主種子庫的制備：以原始種子庫菌種，擴(kuò)培制備主種子庫。（過程:制備2瓶LB度波長下測量吸光值OD0.8~1.0時(shí)，停止培養(yǎng)0.3ml的菌液，0.2ml波長下測量吸光值OD0.8~1.0時(shí)，停止培養(yǎng)0.3ml的菌液，0.2ml甘油接到準(zhǔn)備好1001.5ml離心管中（20%）100支，編號，-20℃，保存）甘油濃度20%，數(shù)量100支，編號-20℃，保存2.6實(shí)驗(yàn)記一、配劑：培養(yǎng)基和設(shè)備名電子天設(shè)備編2011-4-24-名所需濃應(yīng)實(shí)定廠批2.6實(shí)驗(yàn)記一、配劑：培養(yǎng)基和設(shè)備名電子天設(shè)備編2011-4-24-名所需濃應(yīng)實(shí)定廠批培養(yǎng)瓊備二、物料及器具滅超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 LB種子液體積： ml/ 瓶數(shù)：加入 體積： 添加比例： 再儲(chǔ)存二、物料及器具滅超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 LB種子液體積： ml/ 瓶數(shù)：加入 體積： 添加比例： 再儲(chǔ)存IPTG液 復(fù)核人 復(fù)核人 ： 操作時(shí)間：共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間： ： 操作時(shí)間：共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間： 菌液體積： 0.5ml/ 超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 LB種子液體積： ml/ 瓶數(shù)：加入 體積： 添加比例： 再儲(chǔ)存搖床編號： 搖床設(shè)置溫度： 搖床設(shè)置轉(zhuǎn)速： 培養(yǎng)結(jié)束 ： 操作時(shí)間：共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間： 菌液體積： 0.5ml/ 搖床編號： 搖床設(shè)置溫度： 搖床設(shè)置轉(zhuǎn)速： 培養(yǎng)結(jié)束 級菌種庫之間的聯(lián)系。（表達(dá)最佳單顆→原始種子庫→主種子庫→工作種子庫樣原始種子庫（一級），主種子庫（二級），工作種子庫（三級級菌種庫之間的聯(lián)系。（表達(dá)最佳單顆→原始種子庫→主種子庫→工作種子庫樣原始種子庫（一級），主種子庫（二級），工作種子庫（三級 ： 操作時(shí)間：共計(jì)培養(yǎng)時(shí)間： 菌液體積： 0.5ml/ 超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 LB種子液體積： ml/ 瓶數(shù)：加入 體積： 添加比例： 再儲(chǔ)存搖床編號： 搖床設(shè)置溫度： 搖床設(shè)置轉(zhuǎn)速： 培養(yǎng)結(jié)束 3.1.2藥結(jié)晶紫，碘液，95％乙醇3.1.2藥結(jié)晶紫，碘液，95％乙醇，蕃紅，香柏油，Tryptone,乳糖，0.04％溴甲紫，氯化鈉，柯凡克試劑，K2HPO4.3H2O,葡萄糖，甲基紅，萘酚乙醇試劑40%KOH,無水Mgso4，檸檬酸三納，磷酸二氫銨，0.4%溴麝香草酚藍(lán)3.1.3主要試劑的配2.1.4儀器設(shè)PH3.2種庫的檢原始種子庫檢2.1.LB瓊脂平板：LB50-60Amp四、原始種子庫檢主種子庫LB瓊脂平板：LB50-60Amp至終濃度主種子庫LB瓊脂平板：LB50-60Amp至終濃度四、主種子庫檢超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 超凈臺(tái)編號 再儲(chǔ)存 超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 超凈臺(tái)編號 接種后菌種處理方法：銷毀□ 再儲(chǔ) 工作種子庫檢LB瓊脂平板：工作種子庫檢LB瓊脂平板：LB50-60Amp至終濃度四、工作種子庫檢超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 超凈臺(tái)編號 再儲(chǔ)存 革蘭氏染色原理：革蘭氏染色是1884年丹麥的醫(yī)生發(fā)明的。其染色的原理是：①結(jié)養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基（50ug/mlKana）、養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基（50ug/mlKana）、LB液體培養(yǎng)基（50ug/mlAmp），37℃過夜培養(yǎng)。觀察生長情況，應(yīng)與原始菌種相符。（Amp產(chǎn)生AmpKana抗生素沒有抗性，況下無法生長）LB液體培養(yǎng)基，37℃、200rpmOD6000.8~1.0超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 超凈臺(tái)編號：EQ-2010-超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間 LB種子液體積： ml/ 加入 體積： 37 開始培養(yǎng)時(shí)間 次日0h3h1-1,1-2.3h2-1,2-1.3h1,3-2.沉淀用純水復(fù)溶，（還原膠），15ulmark進(jìn)行分子標(biāo)記。分析其目的蛋白表達(dá)附件一圖譜信息SDS-電泳圖譜(還原超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間： 超凈臺(tái)編號 加入1mM/mlIPTG體積： ul/0h3h1-1,1-2.3h2-1,2-1.3h1,3-2.沉淀用純水復(fù)溶，（還原膠），15ulmark進(jìn)行分子標(biāo)記。分析其目的蛋白表達(dá)附件一圖譜信息SDS-電泳圖譜(還原超凈臺(tái)紫外燈開啟時(shí)間： 超凈臺(tái)編號 加入1mM/mlIPTG體積： ul/ 添加比例 LB種子液接種體積：8 ml/瓶 6支50ml離心管 接種后菌種處理方法：銷毀 搖床編號：ZHWY-211C- 搖床設(shè)置溫度： 開始培養(yǎng)時(shí)間 結(jié)束培養(yǎng)時(shí)間：孔 34567892為低分子量marker,從上自下分97400道爾頓、66200道爾頓、43000道爾頓、31000道爾頓、20100道爾頓、14400道爾結(jié)果分析：經(jīng)過誘導(dǎo)后目孔 34567892為低分子量marker,從上自下分97400道爾頓、66200道爾頓、43000道爾頓、31000道爾頓、20100道爾頓、14400道爾結(jié)果分析：經(jīng)過誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)含量平均在35%左右，不低于原始菌種的表達(dá)量2.5.生化反應(yīng)：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)，靛基質(zhì)試驗(yàn)，甲基紅實(shí)驗(yàn)，乙酰甲基甲醇生成實(shí)驗(yàn)，枸酸鹽利用試驗(yàn)，應(yīng)符合大腸桿菌生物學(xué)性狀如培養(yǎng)基變紅色或黃色，產(chǎn)氣（小導(dǎo)管管內(nèi)有氣泡，氣泡無論大?。楸芸仔?23456789名/M1-1-2-2-3-3-/處//0ul還min離0ul還min離0ul還min離0ul還min離0ul還min離0ul還min離0ul還min離/上樣//目的白純////的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽性，或適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間。5.生化實(shí)的細(xì)菌，可于24h出現(xiàn)陽性，或適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間。5.生化實(shí)5.1.乳糖發(fā)酵試氯化鈉2、培養(yǎng)：37℃,24h，4ml\支試管3（空白對照，（1#2#（3#4#244h為黃色，說明納豆激酶在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)出現(xiàn)了陽性。1、培養(yǎng)基的配制：tryptone1.4g；H2HPO4.3H2O0.8Gg；1.0g200ml，1#~9#B48ha1ml40l，充分h內(nèi)出現(xiàn)紅色應(yīng)判為陽性，無紅色反應(yīng)為陰性。3LB（1#~2#）， 作種子（7#~9#）后，培48h，接a1m400.4ml。在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色，說明納豆激酶在乙酰甲基甲醇生成試驗(yàn)中呈現(xiàn)陽性。第四果與討4.1結(jié)第四果與討4.1結(jié)4.2展科學(xué)研究表明,納豆激酶能夠有效的清除人體血液內(nèi)的血栓對高血壓,衰老,中風(fēng),肌痙攣和心腦血管疾病也有很好的療效。而血栓疾病是嚴(yán)重危害類健康的主要疾病之一,如急性心肌梗塞等全世界現(xiàn)有血栓塞用的及一些還在開發(fā)的治療心腦血管栓塞疾病的藥品,如鏈激(SKUkPA甲氧苯甲酰纖溶酶原鏈激酶激活劑復(fù)合物(APSAC)、尿激(proUK)等,均在不同程度上存在一定的缺陷,或者毒性比較強(qiáng)作用比較大;或在體內(nèi)半衰期比較短,藥效難以發(fā)揮;或來源緊缺價(jià)格昂貴,很難成為一種大眾藥品,因此口服性溶血栓藥物的開是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)由于納豆激酶的特殊溶栓作用,再加上它成低,來源于日本傳統(tǒng)的食物,安全性好,低,來源于日本傳統(tǒng)的食物,安全性好,同是一種分子量遠(yuǎn)的蛋白質(zhì),并可由腸道吸收,在體內(nèi)作用持續(xù)間長,最重要的一點(diǎn)是它還能激活人體RtPA,使之溫和、持續(xù)提高血液的纖溶活性,因而將納豆激酶用于開發(fā)新一代的溶栓或保健食品,具有極為誘人的廣闊前景我國對于納豆激酶的研究還剛剛起步，需要借鑒和學(xué)習(xí)的地方有很多，隨著醫(yī)學(xué)的的進(jìn)步和人類需要，相信對納豆激酶研究更加的深刻，納豆激酶也會(huì)在未來的醫(yī)學(xué)上發(fā)揮其重要的價(jià)值為人類帶來福音201552DatarRV,CartwrightT,RosenCG.[J].Biotechnology,1993,11(3):349.[2]FujtaM,HongK,IroY.].BiologicalandPharmaceuticalBulletin,1995,18(9):1194-[3]MitsyguF,KyongsuH.ThrombolyticEffectofNattokinaseona