氯氨酮和l名字對(duì)急性高原低氧大鼠下丘腦一氧化氮合酶和生長(zhǎng)抑素mrna表達(dá)的影響

氯氨酮和l名字對(duì)急性高原低氧大鼠下丘腦一氧化氮合酶和生長(zhǎng)抑素mrna表達(dá)的影響

缺氧可導(dǎo)致大腦中的興奮性氨基酸，尤其是谷氨酸和天冬氨酸的大量釋放，并通過nsda受體影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理和病理反應(yīng)。一氧化氮(NO)作為一種非典型性信息分子介導(dǎo)了與NMDA受體激活相關(guān)的生理過程,并發(fā)現(xiàn)下丘腦內(nèi)源性NO參與下丘腦多種神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。本文主要探討NMDA受體激活是否參與急性高原低氧后下丘腦一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)和生長(zhǎng)抑素mRNA(somatostatinmRNA,SSmRNA)的表達(dá),及下丘腦內(nèi)源性NO是否介導(dǎo)SSmRNA的表達(dá)。1材料和方法1.1動(dòng)物的低氧化Wistar大鼠66只,體重150～200g,由本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。如下隨機(jī)分為:(1)對(duì)照組(室溫20℃,常氧);(2)低溫低氧組(1、7d),將動(dòng)物置于模擬海拔6000m的低壓艙內(nèi)(溫度為4℃),每天6h;(3)單純低氧組(1、7d),艙內(nèi)溫度為20℃。(4)單純低溫組(1、7d),室內(nèi)溫度4℃,常氧。(5)氯氨酮+低溫低氧組(1、7d)。(6)L-NAME+低溫低氧組(1、7d)。1.2原位雜交前、雜交和雜交實(shí)驗(yàn)畢,按常規(guī)進(jìn)行大鼠腦組織灌流、固定,取出下丘腦,行冠狀連續(xù)切片(35μm),然后以地高辛標(biāo)記的反義cRNA探針(400bp)按文獻(xiàn)敘述步驟進(jìn)行原位雜交前、雜交和雜交后處理(雜交過程中的溫度是恒定的,不需要調(diào)節(jié))?？沟馗咝量贵w工作濃度為1∶1000,以NBT∶BCIP(400μg/ml∶200μg/ml)反應(yīng)液顯色。對(duì)照實(shí)驗(yàn)包括用2μg/mgRNA酶A預(yù)處理切片30min和用不含探針雜交緩沖液雜交,結(jié)果均檢測(cè)不到明顯的雜交信號(hào)。1.3u3000添加nadph-d后nt,游離的組織切片,經(jīng)0.1mol/LPB緩沖液(pH7.3)漂洗后與含有0.1%NADPH-d,0.01%NBT和0.3%TritonX-100的0.1mol/LPB緩沖液(pH7.3)孵育60min(37℃)。該反應(yīng)用冷的TBS終止。1.4ssrna的測(cè)定在每一動(dòng)物同一部位的下丘腦切片隨機(jī)抽樣4片,經(jīng)圖像分析儀,作陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(整個(gè)核團(tuán)),取均數(shù)作為該動(dòng)物的SSmRNA數(shù)或NOS數(shù)。數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,用電子計(jì)算機(jī)經(jīng)雙樣本t檢驗(yàn)程序(PDA-2)進(jìn)行處理。2結(jié)果2.1室旁核、視神經(jīng)再生、nmda受體阻滯劑nos正常大鼠下丘腦內(nèi)NOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布彌散,數(shù)量較少,而在低溫低氧及單純低氧大鼠下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)的大細(xì)胞部,視上上核(supraopticnucleus,SON)有密集深染的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元,室旁核的小細(xì)胞部、背內(nèi)側(cè)核、腹內(nèi)側(cè)核、弓狀核、外側(cè)區(qū)、室周區(qū)、乳頭體前核可見深淺不一、疏密不等的NOS陽(yáng)性細(xì)胞。從表1可以看出下丘腦室旁核、視上核NOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)在低溫低氧1d即達(dá)峰值,7d仍維持較高的水平。而單純低溫對(duì)大鼠下丘腦NOS陽(yáng)性神經(jīng)元的分布及數(shù)量無(wú)明顯影響,與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。用NMDA受體阻滯劑氯氨酮(ip,40mg/kg;ketemine),NOS抑制劑N-nitro-l-argininemethylester(ip,30mg/kg;L-NAME),對(duì)高原低氧大鼠進(jìn)行預(yù)處理,30min后置于低壓氧艙內(nèi)6h,觀察到大鼠下丘腦NOS陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)較相應(yīng)時(shí)間的高原低氧組明顯減少(表1,圖1A、B、C、D,見圖版Ⅰ)。2.2大鼠ssrna陽(yáng)性神經(jīng)元的變化從原位雜交組織切片觀察到正常大鼠下丘腦僅有少量的SSmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元,低溫低氧組大鼠下丘腦室周核(periventricularnucleus,PeN)、室旁核(PVN)和弓狀核(arcuatenucleus,ARC)SSmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)較正常對(duì)照組明顯增多(P<0.01),且在1d即達(dá)峰值,7d仍維持這一較高水平(表2;圖2A,B,見圖版Ⅱ)。單純低氧組大鼠下丘腦室周核、室旁核和弓狀核SSmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元分布與數(shù)目與低溫低氧組相似,而單純低溫對(duì)大鼠下丘腦SSmRNA陽(yáng)性神經(jīng)元無(wú)明顯影響,與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。用NMDA受體阻滯劑氯氨酮(ip,40mg/kg)和一氧化氮合酶阻滯劑L-NAME(ip,30mg/kg)對(duì)低氧大鼠進(jìn)行預(yù)處理,觀察到下丘腦SSmRNA神經(jīng)元數(shù)較相應(yīng)時(shí)間低氧組大鼠明顯減少(P<0.01,表2,圖2C,D,見圖版Ⅱ)。3氨基酸激活nmda受體大量的研究表明缺氧可致腦內(nèi)氨基酸釋放增加,尤其是谷氨酸和天門冬氨酸大量釋放,可過度激活NMDA受體,從而介導(dǎo)了興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用,通過NMDA受體激活電壓門控Ca2+通道,促使Ca2+病理性內(nèi)流增加,細(xì)胞內(nèi)Ca2+的積聚導(dǎo)致神經(jīng)元發(fā)生退行性改變和壞死。NO作為一種非典型的神經(jīng)遞質(zhì)和信息分子,介導(dǎo)了許多與NMDA受體激活相關(guān)的生理、病理過程,如參與海馬和皮層的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和抑制及腦缺血、腦損傷的毒性作用。本文應(yīng)用模擬高原低氧模型觀察到下丘腦內(nèi)NOS的強(qiáng)烈表達(dá),NADPH-d組化法可見下丘腦室旁核、視上核密集深染的NOS陽(yáng)性神經(jīng)元,而NMDA受體阻滯劑氯氨酮可翻轉(zhuǎn)低氧誘導(dǎo)的大鼠下丘腦NOS的表達(dá),說明缺氧引起下丘腦NOS的激活依賴于谷氨酸激活NMDA受體。并且,該作用是通過增加細(xì)胞內(nèi)鈣激活NOS,從而引起NO的合成和釋放。大量的證據(jù)表明,NO的過量產(chǎn)生有神經(jīng)毒性作用。NMDA受體拮抗劑有神經(jīng)保護(hù)作用,目前認(rèn)為,ketamine具有神經(jīng)保護(hù)作用是由于它能較強(qiáng)地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平,抑制NMDA受體的過度激活,減少NO的產(chǎn)生,從而減輕神經(jīng)元的進(jìn)行性潰變和壞死。生長(zhǎng)抑素是一種作用廣泛、功效很強(qiáng)的神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)節(jié)物,它參與了機(jī)體多種生理功能的活動(dòng)和調(diào)節(jié)。在體實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)大鼠下丘腦正中隆起水平生長(zhǎng)抑素的釋放受各種應(yīng)激(寒冷、電休克、乙醚刺激、制動(dòng))因素影響,發(fā)生快速反應(yīng)性釋放增加。這些反應(yīng)是通過快神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的,谷氨酸是神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性快神經(jīng)遞質(zhì)。文獻(xiàn)報(bào)道,谷氨酸可快速而強(qiáng)烈刺激原代培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素的釋放。CGS19755,一種NMDA受體的特異拮抗劑,可翻轉(zhuǎn)該作用,表明谷氨酸可通過NMDA受體刺激生長(zhǎng)抑素的釋放。海馬腦片的電壓箝記錄表明谷氨酸激活NMDA受體增強(qiáng)生長(zhǎng)抑素神經(jīng)元的興奮性。目前研究證實(shí),NMDA可引起下丘腦神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素含量增加及穩(wěn)定狀態(tài)的生長(zhǎng)抑素mRNA升高。本文運(yùn)用NMDA受體阻滯劑ketamine對(duì)高原低氧大鼠進(jìn)行預(yù)處理,可見下丘腦SSmRNA神經(jīng)元數(shù)較高原低氧組大鼠明顯減少,說明谷氨酸激活NMDA受體與低氧大鼠下丘腦內(nèi)生長(zhǎng)抑素的合成密切相關(guān)。谷氨酸不僅可直接興奮下丘腦內(nèi)生長(zhǎng)抑素神經(jīng)元,而且可能通過NO調(diào)節(jié)生長(zhǎng)抑素能神經(jīng)元生長(zhǎng)抑素的合成與釋放。近來的研究結(jié)果表明下丘腦內(nèi)源性的NO刺激下丘腦生長(zhǎng)抑素的釋放。GRF(生長(zhǎng)抑素釋放抑制素)可激活NOS,NO大量釋放并彌散至相鄰的生長(zhǎng)抑素能神經(jīng)元激活鳥苷酸環(huán)化酶,使cGMP水平增高,進(jìn)而引起下丘腦室旁核SSmRNA含量增加。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用N