快速測(cè)試片在凝固劑中的應(yīng)用

快速測(cè)試片在凝固劑中的應(yīng)用

在通常的正常和堅(jiān)固的培養(yǎng)溫度下，固體培養(yǎng)基被稱為固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基的凝固劑一般不是微生物的營(yíng)養(yǎng)成分,只起固化或粘合作用。常見(jiàn)凝固劑有瓊脂、明膠、無(wú)機(jī)硅膠等。此外,由于微生物快速檢測(cè)的巨大需求而研制的微生物快速測(cè)試片,是通過(guò)凝固劑將營(yíng)養(yǎng)成份和特異顯色物質(zhì)粘附在塑料載體上而成,使用前不需進(jìn)行培養(yǎng)基制備和加熱而可直接應(yīng)用,如美國(guó)3M公司的Petrifilm和廣東環(huán)凱科技有限公司的微生物計(jì)數(shù)卡。測(cè)試片中凝固劑有瓜爾膠、黃原膠、刺槐豆膠、聚丙烯酸系高分子化合物等。1瓊斯1.1瓊脂糖和有效組分子瓊脂(agar)產(chǎn)自石花菜或其他幾種紅海藻,包含有兩個(gè)組分:一個(gè)是可以形成結(jié)實(shí)而強(qiáng)力的凝膠,稱“瓊脂糖”(agarose);另一個(gè)則是不會(huì)發(fā)生凝膠化的組分,稱“瓊脂膠”(a-garopectin)。瓊脂糖約占天然瓊脂80%,瓊脂膠是瓊脂糖的硫酸酯。由于瓊脂的來(lái)源不同,瓊脂糖和瓊脂膠的含量也隨之變化。瓊脂糖分子以線型鏈的形式存在,它是紅海藻的一個(gè)成分,與iota-和kappa-卡拉膠成鏡像關(guān)系。這一線型分子鏈包含有以(1→3)聯(lián)結(jié)的β-D-吡喃半乳糖基單元(A單元)與以(1→4)聯(lián)結(jié)的3,6-失水α-D-吡喃半乳糖基單元(B單元)相聯(lián)結(jié)。A單元及B單元構(gòu)成二糖單元,因3,6-失水環(huán)接近于每個(gè)B單元,它可以很容易變化而發(fā)生水解。瓊脂糖的二糖單元及二級(jí)結(jié)構(gòu)可表示如圖1:1.2脂肪體的性質(zhì)1.2.1獼猴桃的色,指牛為洋菜成品瓊脂一般分為細(xì)長(zhǎng)條狀和粉末狀。細(xì)長(zhǎng)條狀的瓊脂在市場(chǎng)上常被稱為“洋菜”,色類白或淡黃色;半透明,表面皺縮,微有光澤,質(zhì)輕軟而韌,不易折斷;完全干燥后,則脆而易碎;無(wú)嗅無(wú)味。1.2.2收水分的溶脹高純度的瓊脂在常溫下實(shí)際上不溶于水,只吸收水分發(fā)生溶脹和微微地溶于乙醇胺和甲酰胺,在接近沸騰的情況下可分散到中水形成溶膠。其濃度達(dá)到15g/L的溶液時(shí)仍清澈透明。1.2.3凝固劑和酸液溫度的影響瓊脂的凝膠化溫度遠(yuǎn)低于凝膠融化溫度,其可用于微生物固體培養(yǎng)基的凝固劑也是因?yàn)檫@一點(diǎn)。由不同種類的原料所制取的瓊脂,明顯地具有不同的凝固溫度,但來(lái)自相同原料的瓊脂,其凝固溫度基本上是一致的。用于微生物固體培養(yǎng)基凝固劑瓊脂的凝膠化溫度一般在35℃~40℃,而凝膠熔點(diǎn)應(yīng)在75℃~85℃。酸堿度對(duì)瓊脂的凝固性影響很大,而高溫高壓(1.1kg/cm2,1×105Pa)的影響很小。酸堿度是瓊脂在正常濃度范圍內(nèi)能否凝固的關(guān)鍵因素。當(dāng)4.30<pH<10.05時(shí),瓊脂水溶液均可正常凝固,超過(guò)此范圍,培養(yǎng)基不能正常凝固。1.3瓊脂凝膠化過(guò)程分析凝膠化是指體型縮聚反應(yīng)進(jìn)行到一定程度,反應(yīng)體系的黏度突然增加,并且出現(xiàn)具有彈性凝膠的現(xiàn)象。此時(shí),體系中包含了兩部分:一部分是凝膠,它具巨型網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),不溶于一切溶劑;另一部分是溶膠,其分子量較小,被籠罩在凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。因此,凝膠是介于固體和液體之間的一種物質(zhì)狀態(tài)。根據(jù)交聯(lián)方式,凝膠可分為化學(xué)交聯(lián)和物理交聯(lián)兩種。化學(xué)交聯(lián)是高分子鏈段間以共價(jià)鍵交聯(lián)起來(lái),這種交聯(lián)很牢固,使高分子只發(fā)生溶脹,而不能熔融更不溶解。物理交聯(lián)包括有氫鍵、庫(kù)倫力、配位鍵及物理纏結(jié)等形成的線性分子間的交聯(lián)。瓊脂依靠高分子鏈段相互作用間可形成氫鍵而成為凝膠結(jié)構(gòu)。這種氫鍵會(huì)因加熱等而被破壞,使凝膠變?yōu)槿苣z。瓊脂的凝膠化主要是其瓊脂糖之間氫鍵結(jié)合的結(jié)果,其含有的大量的水在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上發(fā)揮了重要的作用。凝膠中水有幾種狀態(tài)存在,在高分子網(wǎng)絡(luò)附近的水與網(wǎng)絡(luò)有很強(qiáng)的相互作用。將緊挨著高分子網(wǎng)絡(luò)的,在極低溫度下也不凍結(jié)的水稱為不凍水;而將在-10℃~-20℃才凍結(jié)的水稱為束縛水;離網(wǎng)絡(luò)很遠(yuǎn)的水,顯示與普通水同樣的性質(zhì),稱作自由水。在溶膠狀態(tài),溫度接近水沸點(diǎn)時(shí),瓊脂分子是一種隨機(jī)卷曲狀態(tài)。溫度降至凝固點(diǎn),在凝膠狀態(tài)時(shí),瓊脂分子相互交聯(lián),形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),基本結(jié)構(gòu)為左手雙螺旋。沿著螺旋軸兩側(cè)有很大的空穴,使瓊脂能結(jié)合足夠多的水。瓊脂的流變性變化是瓊脂凝膠化過(guò)程中的一個(gè)重要特征。在溫度高時(shí),其流變行為與稀溶液中的聚合物流變行為相似;在溫度低至凝固點(diǎn)以下時(shí),流變行為像交聯(lián)的聚合物;溫度在溶膠和凝膠的變化過(guò)程中,流變性更為復(fù)雜。另外,瓊脂的流變性受瓊脂的濃度、分子量以及其它的物質(zhì)(如甘油)的影響。1.4半固體培養(yǎng)基瓊脂是微生物固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基中最常用的性能優(yōu)良的凝固劑。在液體培養(yǎng)基中加10~20g/L的瓊脂后加熱融化,凝固后即可得固體培養(yǎng)基,加5g/L的瓊脂可得半固體培養(yǎng)基。陳宏偉經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)后提出:用凝膠強(qiáng)度來(lái)計(jì)算瓊脂的用量更為科學(xué)。固體培養(yǎng)基的適宜凝膠強(qiáng)度為250~450g/cm2之間,這樣硬度的固體培養(yǎng)基,既有利于物質(zhì)的擴(kuò)散和微生物對(duì)物質(zhì)的吸收,又有一定的硬度,有利于劃線、涂布和影印等技術(shù)的操作。而半固體培養(yǎng)基的適宜凝膠強(qiáng)度為90g/cm2左右,這樣的培養(yǎng)基既可以凝固而不流動(dòng),又不影響菌體的運(yùn)動(dòng),用手輕輕敲打試管即可使培養(yǎng)基破碎。2氨基酸的結(jié)構(gòu)明膠(gelatin)是膠原蛋白經(jīng)適度降解變性而得到的產(chǎn)物。作為一種蛋白質(zhì),明膠的氨基酸組成較為特殊,其含硫氨基酸很少,而甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸四種氨基酸含量很高,約占總氨基酸的67%。明膠大分子是由若干種氨基酸以肽鍵和次級(jí)鍵連接而成,肽鍵和次級(jí)鍵決定了大分子的結(jié)構(gòu),次級(jí)鍵有氫鍵、鹽鍵、疏水鍵、酯鍵和二硫鍵等。明膠溶液的溫度在熔點(diǎn)以上時(shí)其分子呈無(wú)規(guī)則線團(tuán)構(gòu)象。當(dāng)溫度降至凝固點(diǎn)以下時(shí),明膠分子的某些鏈段復(fù)旋為左手螺旋。相鄰3條左手螺旋鏈間產(chǎn)生氫鍵交聯(lián),復(fù)性為類似膠原的右手超螺旋結(jié)構(gòu)。明膠成品為無(wú)色或淡黃色的透明薄片或微粒。明膠不溶于冷水,但可緩慢吸水膨脹軟化,明膠可吸收相當(dāng)于其重量5~10倍的水。明膠可溶于熱水,形成熱可逆性凝膠。明膠是最早用來(lái)作為凝固劑的物質(zhì),用量為液體培養(yǎng)基的5%~12%?？墒怯捎诿髂z的融化溫度(約25℃)和凝固溫度(約20℃)相差不大、比較容易被微生物分解、不適于較高溫度下長(zhǎng)期使用,以及耐加壓滅菌較差等缺點(diǎn),已逐漸被瓊脂所代替。3xh20的結(jié)構(gòu)硅膠(silicagel)是由多聚硅酸經(jīng)分子內(nèi)脫水而形成的一種多孔性物質(zhì),其化學(xué)組Si02·XH20,屬于無(wú)定性結(jié)構(gòu)。硅膠不溶于水和任何溶劑,無(wú)毒無(wú)味。由于硅膠為多孔性物質(zhì),具有較大的比表面,而且表面的羥基具有一定程度的極性,所以有很好的吸水性。用于固體培養(yǎng)基的硅膠是由無(wú)機(jī)的硅酸鈉及硅酸鉀被鹽酸及硫酸中和時(shí)而形成的膠體,它不含有機(jī)物,主要用于分離與培養(yǎng)自養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基。4混合成分和混溶膠瓜爾膠(guargum)是一種高純化多糖,就分子結(jié)構(gòu)來(lái)說(shuō)是一種非離子化的半乳甘露聚糖,它以β-(1→4)鍵連接的聚D-吡喃甘露糖為主鏈,D-吡喃半乳糖支鏈以α-(1→6)鍵連接在主鏈上,其中甘露糖與半乳糖的摩爾比約為2∶1。瓜爾膠極易溶于冷水和熱水、無(wú)毒、在一般情況下不形成凝膠,不過(guò)在高壓滅菌鍋滅菌冷卻后可以形成凝膠。并且形成的凝膠在70℃以下是不可溶的。瓜爾膠在固體培養(yǎng)基的用量為30~40g/L,根據(jù)其高溫不溶的特性,可用于嗜熱菌的分離和保藏。細(xì)菌和真菌在其上面有良好的生長(zhǎng),真菌還要比在瓊脂上長(zhǎng)得更好一些,而且瓜爾膠要比瓊脂便宜8倍,所以其有巨大的應(yīng)用價(jià)值。5半乳聚糖凝膠法卡拉膠(carrageenan)是從海藻中提取來(lái)的一種陰離子多糖,其結(jié)構(gòu)根據(jù)原料來(lái)源不同而不同,可溶于熱水,不溶于乙醇、異丙醇等,基本骨架是α-1,3和β-1,4糖苷鍵交替聯(lián)結(jié)形成的半乳聚糖重復(fù)單元。卡拉膠的粘度很大,在濃度低至2g/L時(shí)也能形成凝膠,不過(guò)形成凝膠時(shí)是離子(K+或Ca+)依賴性的。卡拉膠約60℃熔化,45℃凝固。由于卡拉膠是一種離子依賴型凝膠劑,所以無(wú)法完全代替瓊脂。但可用于某些微生物的培養(yǎng),其用量約為10g/L。6“五糖”重復(fù)單元黃原膠(xanthangum)是由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸組成的“五糖重復(fù)單元”結(jié)構(gòu)聚合體。主鏈和側(cè)鏈間通過(guò)氫鍵形成雙螺旋和多重螺旋結(jié)構(gòu)。黃原膠既能溶于熱水,又能溶于冷水;不能發(fā)生凝膠化;具有很強(qiáng)的粘性,具有高度的生物穩(wěn)定性,多數(shù)酶類不能對(duì)其降解。7半乳利用聚糖的凝膠特性刺槐豆膠(locustbeangum)是一種無(wú)色,無(wú)味的植物胚乳精制多糖。刺槐豆膠是以甘露糖為主鏈的半乳甘露聚糖,甘露糖與半乳糖的比例為1∶4,分子量大約為300kD。刺槐豆膠本身無(wú)凝膠特性,其最重要的特點(diǎn)是與瓊脂、卡拉膠及黃原膠等親水膠體有良好的凝膠協(xié)同效應(yīng),可使復(fù)合后的用量水平很低并改善凝膠組織結(jié)構(gòu)。普通刺槐豆膠在冷水中只有部分溶解,加熱至85℃保持10min以上才能充分水化。8高吸水性樹(shù)脂的吸水法聚丙烯酸系(PAA)高分子化合物是一種化學(xué)合成的高吸水性樹(shù)脂。高吸水性樹(shù)脂可以吸收自身質(zhì)量的幾百乃至上千倍的水,不但具有優(yōu)良的吸水性能,而且具有卓越的保水能力;即使加壓,所吸收的水也不溢出。自然界中能吸水的物質(zhì)很多,按其吸水的性質(zhì)來(lái)分,基本上分為兩類:一類是物理吸附,其吸水主要是毛細(xì)管的吸附原理,所以這類物質(zhì)吸水能力不高,只能吸收自重的幾十倍的水,一旦施壓,水就逸出。另一類是化學(xué)吸附,是通過(guò)化學(xué)鍵的方式把水和親水性物質(zhì)結(jié)合在一起成為一個(gè)整體。此種吸附結(jié)合很牢,加壓也不會(huì)失水。高吸水性樹(shù)脂是由三維空間網(wǎng)絡(luò)構(gòu)成的高聚物,它帶有大量親水基團(tuán)(如羧基、羥基、羧酸鹽、酰胺基等)。它的吸水,既有物理吸附,又有化學(xué)吸附。因此,它具有神奇的吸水能力以及較高的保水能力。9檢測(cè)片的改性雖然瓊脂已經(jīng)被應(yīng)用了100多年,它的可應(yīng)用性也得到了大家的充分認(rèn)可,可是由于其資源的過(guò)分開(kāi)采而導(dǎo)致價(jià)格上升,尋找一種較便宜的膠體來(lái)代替很有必要。另外,有些情況下瓊脂并不適用,如高溫培養(yǎng)。這樣,需要人們?nèi)ひ环N新的膠體來(lái)代替或兼而用之。過(guò)去一段時(shí)間里,雖然人們做了大量的嘗試,取得了一定的成果,但仍未找到一種可以完全代替之的物質(zhì)。所以,我們還要繼續(xù)努力,從瓊脂的可應(yīng)用原理出發(fā),來(lái)選擇新的膠體或來(lái)對(duì)現(xiàn)有的膠體改性,以達(dá)到應(yīng)用目的。快