復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病合并缺血性腦損傷大鼠vegf蛋白表達(dá)的影響

復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病合并缺血性腦損傷大鼠vegf蛋白表達(dá)的影響

腦梗死是糖尿病的致命和致命并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì),糖尿病性腦血管病變的發(fā)生率是非糖尿病患者的3倍以上。臨床運(yùn)用復(fù)元醒腦湯治療2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死,可以明顯提高臨床療效,并能顯著改善胰島素抵抗。為進(jìn)一步研究復(fù)元醒腦湯的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)建立了糖尿病合并缺血性腦損傷大鼠模型,觀察復(fù)元醒腦湯對(duì)糖尿病大鼠血糖、腦組織含水量、腦血管通透性及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)表達(dá)的影響。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心健康SD大鼠,SPF級(jí),雌雄各半,體質(zhì)量(320±20)g,由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滬)2008-005。1.1.2sds-東南角復(fù)元醒腦湯:人參10g,生天南星15g,石菖蒲12g,三七10g,水蛭10g,益母草30g,制大黃10g,由本院制劑室生產(chǎn)提供,生藥含量388g/L。鏈脲佐菌素(STZ),Sigma,批號(hào):040105;膠原酶Ⅶ,Sigma,批號(hào):036k8600;VEGFantibody,Abcam,批號(hào):08100109;PMSF,AMRESCO,批號(hào):990801;Tris、AP、TEMED,BBI;Western及IP細(xì)胞裂解液、蛋白濃度的定量試劑盒、SDS凝膠配制試劑盒、Marker、Western轉(zhuǎn)膜液、Western一抗稀釋液、Western封閉液,碧云天公司;異丙醇,蘇州振亞化工廠,批號(hào):20070523。1.1.3酶標(biāo)儀強(qiáng)生快速血糖檢測(cè)儀,美國強(qiáng)生公司;電泳儀,BIO-RADPOWER/PAC200;搖床,上海精密儀器制造公司;半干轉(zhuǎn)膜儀,Bio-Rad;酶標(biāo)儀,MultiskenMK3Thermo;UV-3000紫外分光度計(jì),UNICO,USA。1.2大鼠腦損傷組織病理學(xué)檢測(cè)1.2.1動(dòng)物分組及藥物干預(yù)SPF級(jí)SD大鼠60只,根據(jù)隨機(jī)原則分為2組,分別為:正常組15只,糖尿病模型組45只。糖尿病造模成功后不進(jìn)行治療,所有大鼠普通飼料喂養(yǎng)2周后,將糖尿病大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組3組。分別灌胃,治療組每日以復(fù)元醒腦湯灌胃10.4g/kg(參照陳奇主編《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》依實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比計(jì)算),正常組、假手術(shù)組、模型組予等容量的0.9%NaCl溶液灌胃,每天2次,連續(xù)5d。末次灌胃后,將各組大鼠隨機(jī)分成血糖、VEGF蛋白檢測(cè)組及腦組織含水量、腦血管通透性檢測(cè)組2組。1.2.2糖尿病大鼠模型制備大鼠禁食不禁水12h后,腹腔注射1%STZ(臨用時(shí)用0.1mol,pH4.2的檸檬酸緩沖液配制),注射劑量為60mg/kg,在注射STZ72h后測(cè)大鼠尾靜脈血糖≥16.7mmol/L者為糖尿病大鼠。1.2.3糖尿病合并缺血性腦損傷大鼠模型制備末次灌胃1h后,將大鼠以0.4%戊巴比妥鈉(10ml/kg)麻醉,仰臥固定,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用無創(chuàng)小動(dòng)脈夾夾閉兩側(cè)頸總動(dòng)脈2h,造成不完全性腦缺血,假手術(shù)組只分離不夾閉雙頸總動(dòng)脈,其余各組夾閉動(dòng)脈2h后,松開動(dòng)脈夾,再灌注2h。1.2.4標(biāo)本取材分別于結(jié)扎頸總動(dòng)脈之前,缺血再灌2h后測(cè)血糖1次,頸總動(dòng)脈取血,按實(shí)驗(yàn)需要分別留取血清及血漿,并迅速取腦組織在冰臺(tái)上分離前腦皮質(zhì)和海馬,以冰生理鹽水沖洗除去殘?jiān)蠓Q重,分別加冰生理鹽水及無水乙醇用勻漿器在冰上制成10%腦勻漿液,勻漿液于4000r/min4℃離心15min,分離上清液,于-20℃貯存?zhèn)溆?。其?腦含水量、腦血管通透性檢測(cè)組在分離頸總動(dòng)脈前先經(jīng)股靜脈注入伊文斯藍(lán)。1.2.5觀察指標(biāo)(1)血糖:采用電化學(xué)法血糖儀測(cè)定。(2)各組大鼠腦含水量的測(cè)定:分別取血腫側(cè)大腦前外側(cè)部分,稱取重量(濕重),然后置入100℃恒溫箱中,24h后取出再稱重(干重)。以(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算腦含水量,以此代表腦水腫的程度。(3)各組大鼠腦血管通透性的檢測(cè):采用伊文斯藍(lán)(EB)法。各組大鼠麻醉后,經(jīng)股靜脈注入2%EB(20mg/kg),大鼠眼球結(jié)膜、四肢幾秒鐘后變藍(lán)。2h后開胸通過左心室灌注0.9%NaCl溶液,直到右心房流出無色液體。斷頭取腦,分別取血腫側(cè)大腦后外側(cè)部分血腫周圍組織5mm,稱重后加入3ml甲酰胺,54℃恒溫水浴箱中孵育24h。1000r/min離心5min,分光光度計(jì)(λ=632)測(cè)定上清液OD值。腦組織EB含量以O(shè)D/g濕腦組織表示,用EB含量(OD/g)代表腦血管通透性。(4)VEGF蛋白檢測(cè):用Westernblot法?？偟鞍?0μg用10%SDS凝膠電泳(恒流,40mA,150min)后轉(zhuǎn)移至PVDF膜(恒壓,40V,過夜),TBST洗膜10min×3次后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉(4℃,8h),VEGFantibody(1∶1000)孵育,TBST洗膜10min×3次后抗鼠IgG-HRP(1∶5000)孵育,再用TBST洗膜20min×3次及TBS洗膜10min×1次后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL,SantaCruz公司)孵育,并使膠片曝光、洗片。膠片用圖像分析系統(tǒng)(Labwork圖像分析系統(tǒng),美國UVP公司)掃描和條帶密度分析。1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析。2結(jié)果2.1兩組血糖值的比較與正常組比較,其余各組血糖值明顯升高(P<0.01)。治療前假手術(shù)組、模型組、治療組血糖無明顯差異(P>0.05)。與治療前比較,治療組治療后血糖值下降明顯(P<0.01);且與模型組比較,治療組血糖下降非常顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。缺血再灌2h后,與假手術(shù)組比較,模型組血糖明顯升高(P<0.01),而治療組血糖與模型組比較下降明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明復(fù)元醒腦湯能有效抑制血糖升高(表1)。2.2大鼠腦損傷模型大鼠腦損傷模型大鼠腦損傷模型的腦損傷模型比較正常組與假手術(shù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常組、假手術(shù)組比較,糖尿病合并缺血性腦損傷模型組的大鼠腦組織含水量及伊文斯藍(lán)含量差異顯著(P<0.01)。與模型組比較,治療組大鼠腦組織含水量及伊文斯藍(lán)含量均顯著降低(P<0.01)(表2)。2.3糖尿病合并考慮各組大鼠血腫周圍腦損傷模型大鼠vegf蛋白水平表達(dá)比較正常組與假手術(shù)組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),與正常組、假手術(shù)組比,糖尿病合并缺血性腦損傷模型大鼠血腫周圍腦組織VEGF蛋白水平表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組相比,治療組VEGF蛋白水平表達(dá)上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(表3)。3復(fù)元覺腦湯治療大鼠血糖的作用機(jī)制糖尿病并發(fā)腦梗死,屬中醫(yī)學(xué)“消渴”“中風(fēng)”范疇。消渴以陰虛為本,燥熱為標(biāo)。正如《證治要訣》曰:“三消久之,精血既虧,或目無所見,或手足偏廢如風(fēng)疾,非風(fēng)也?！鼻宕t(yī)家沈金鰲也認(rèn)為:“元?dú)馓摓橹酗L(fēng)之根也?！遍L(zhǎng)期臨床總結(jié)發(fā)現(xiàn),腦梗死的發(fā)病主要以元?dú)馓摀p為根本,痰瘀互結(jié)、痰熱生風(fēng)為病機(jī)核心。痰、瘀為元?dú)馓撍鶎?dǎo)致的中間病理產(chǎn)物,痰瘀膠著貫穿于中風(fēng)之始終,痰瘀互阻致使生熱化風(fēng),風(fēng)火相煽,乃發(fā)“中風(fēng)”。據(jù)此,我們采取扶持元?dú)鉃橹?佐以逐瘀化痰、泄熱熄風(fēng)、醒腦開竅之法,以自擬復(fù)元醒腦湯治療腦梗死,在降低病死率、減輕腦水腫及改善患者神經(jīng)功能等方面有顯著療效。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,糖尿病大鼠發(fā)生腦缺血后,血糖繼續(xù)升高,而復(fù)元醒腦湯能有效降低血糖,抑制腦缺血后血糖進(jìn)一步升高,防止腦水腫,使腦組織減少高血糖所帶來的損害。采用伊文斯藍(lán)法觀察到缺血性腦損傷模型組大鼠血腫周圍腦組織EB含量明顯升高,提示腦缺血后血腦屏障遭到破壞,通透性增高。復(fù)元醒腦湯治療組的EB含量、腦含水量均低于模型組,表明復(fù)元醒腦湯治療可以有效地減輕血腦屏障損傷,有利于維持神經(jīng)元所處內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,減輕腦水腫,進(jìn)而改善神經(jīng)功能。VEGF是重要的血管生長(zhǎng)因子,其生物學(xué)功能不僅可選擇性增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂,刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)血管形成,而且還可升高血管尤其是微小血管的滲透性,使血漿大分子物質(zhì)外滲沉積在血管外的基質(zhì)中,進(jìn)而為細(xì)胞的生長(zhǎng)和新生毛細(xì)血管的建立提供營養(yǎng)。研究證實(shí):在缺氧因子的誘導(dǎo)下,不僅可以出現(xiàn)VEGF的高表達(dá),SDF-1的表達(dá)也可以明顯升高,而且增高比例明顯高于VEGF。多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究觀察到腦缺血時(shí)缺血周圍區(qū)VEGF表達(dá)上調(diào),并有微血管密度的增高,兩者間存在正相關(guān)關(guān)系,而缺血周圍區(qū)微血管增加的范圍與程度直接關(guān)系到血流的改善,影響神經(jīng)元生理功能的恢復(fù)。急性腦梗死后,VEGF通過與其受體結(jié)合,對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有多重保護(hù)作用,涉及血管形成、促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、直接的神經(jīng)營養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)及抗凋亡等多種機(jī)制。VEGF短暫的表達(dá)可保護(hù)血管系統(tǒng)避免缺血損傷,持續(xù)表達(dá)則促進(jìn)血管的生成,從而起到缺血缺氧腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,糖尿病合并缺血性腦損傷模型大鼠血腫周圍腦組織VEGF蛋白表達(dá)持續(xù)升高,與正常組和假手術(shù)組比較有顯著性差異。復(fù)元醒腦湯治療后VEGF蛋白表達(dá)上調(diào),與模型組比較有顯著性差異,提示復(fù)元醒腦湯