復(fù)元膠囊對實驗性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型病理形態(tài)、血清型膠原羧基端肽及基質(zhì)金屬蛋白酶-13的影響

復(fù)元膠囊對實驗性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型病理形態(tài)、血清型膠原羧基端肽及基質(zhì)金屬蛋白酶-13的影響

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是一種常見的由多種因素引起的關(guān)節(jié)退變形式。其特點是關(guān)節(jié)軟骨遭到破壞，微細(xì)胞外基質(zhì)，以及軟骨下骨的正常合成和分解。目前對OA的早期診斷和治療未取得突破性進(jìn)展,CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原降解產(chǎn)物,被認(rèn)為是早期OA的關(guān)節(jié)損害進(jìn)程的預(yù)測指標(biāo)之一。研究證實中醫(yī)藥對OA療效顯著。復(fù)元膠囊由長期運(yùn)用臨床的治療骨關(guān)節(jié)炎的有效經(jīng)驗復(fù)方制成,前期研究顯示其對動物模型骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病有抑制作用,但其靶點尚未完全闡清。本研究通過檢測膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)模型血清中的Ⅱ型膠原羧基端肽(CTX-Ⅱ)含量、膝軟骨免疫組化測定基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)水平變化,探討復(fù)元膠囊對軟骨降解的保護(hù)作用以及對CTX-Ⅱ的影響。1材料和方法1.1膠囊的制作①雄性老年SD大鼠72只(300～350g),由重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心提供。②試驗藥物:復(fù)元膠囊由鹿茸、淫羊藿、人參、黃芪、川芎、枸杞、當(dāng)歸等組成,委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊,供實驗使用;抗骨增生膠囊由江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:090704。③試劑:大鼠CTX-Ⅱ酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢華美生物提供),大鼠MMP-13多克隆抗體(北京博奧森生物提供),DAB顯色試劑盒(北京中杉)。1.2koa模型的建立72只SD大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、抗骨增生膠囊組及復(fù)元膠囊組(高、中、低劑量組)。除正常組外,其余各組均按照Hulth法復(fù)制KOA模型,10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,在無菌條件下切斷右側(cè)膝蓋內(nèi)側(cè)半月板、內(nèi)側(cè)副韌帶及前后交叉韌帶,逐層縫合。術(shù)后每天肌注青霉素2×104U/kg,共5d。1w后驅(qū)趕大鼠跑步30min/d,共8w。1.3抗骨生成膠囊組根據(jù)Meeth-Rubner公式計算大鼠給藥量,復(fù)元膠囊0.72g/kg(相當(dāng)于生藥5.76g/kg)、抗骨增生膠囊0.83g/kg(相當(dāng)于生藥4.7g/kg),均配置成3ml溶液,正常組、模型組均給予生理鹽水3ml,手術(shù)后第2周開始灌胃,每天1次,共12w。1.4觀察指標(biāo)1.4.1軟骨組織病理學(xué)觀察于術(shù)后4、8、12w每組隨機(jī)取4只大鼠,抽血后處死,取軟骨內(nèi)髁全層軟骨標(biāo)本置于4%中性甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片,HE染色觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量和潮線完整性。根據(jù)Mankin法評分。0級為正常;1級為表層破壞;2級為血管翳及表層破壞;3級為淺層裂隙形成;4級為局限性深達(dá)骨質(zhì)的裂隙;5級為大面積深達(dá)骨質(zhì)的軟骨缺如;6級為負(fù)重區(qū)軟骨全部丟失。1.4.2mmp-13抗體的制備將軟骨標(biāo)本用4%中性甲醛溶液固定18h,脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋。連續(xù)切片5μm,貼片于防脫載玻片上,切片脫蠟至水,3%H2O2室溫10min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。滴加胰蛋白酶消化液,放入濕盒37℃消化20min修復(fù)抗原活性。山羊血清封閉,分別滴加1∶100稀釋抗大鼠MMP-13抗體,4℃過夜。按照SP法說明書步驟進(jìn)行。通過連接計算機(jī)的顯微攝影系統(tǒng)采集圖像,利用Image-proPlus2.0圖像分析軟件,半定量測定MMP-13平均光密度(AOD)。1.4.3試劑盒制作大鼠麻醉后腹主動脈采血5ml,室溫靜置2h后3500r/min離心20min,取上清液,標(biāo)本放于-20℃保存。標(biāo)本取出后室溫放置30min。嚴(yán)密按照試劑盒說明操作。根據(jù)光密度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算CTX-Ⅱ含量。1.5統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析,多組間兩兩比較,結(jié)果以ˉx±sxˉ±s表示。2結(jié)果2.1各組大鼠評分正常組軟骨表層光滑平整,細(xì)胞形狀及排列整齊,潮線清晰。模型組軟骨層變薄,表層有裂隙,細(xì)胞數(shù)目變少、排列紊亂,潮線嚴(yán)重斷裂模糊;抗骨增生膠囊組軟骨表面欠平整,細(xì)胞層數(shù)增多,排列稍顯凌亂,潮線呈斷裂或雙重;復(fù)元膠囊低劑量組表層裂隙形成,細(xì)胞排列紊亂,陷窩出現(xiàn)空泡樣變,潮線紊亂;復(fù)元膠囊中劑量組染色較為均勻,細(xì)胞層增生,細(xì)胞數(shù)目增多;復(fù)元膠囊高劑量組表層尚且平整,細(xì)胞略有增生,中深層有少量細(xì)胞簇聚,可見雙重潮線。根據(jù)Mankin評分結(jié)果,4w時各組評分高于正常組(P<0.01),其余各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義;8w時正常組評分低于模型對照組(P<0.01),復(fù)元膠囊中、高劑量組評分低于模型對照組(P<0.05);12w時,各實驗組評分低于模型組(P<0.01),復(fù)元膠囊中、高劑量組評分低于模型對照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1,表1。2.2各組小鼠骨陷窩及細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)比較MMP-13在正常組關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)呈弱陽性表達(dá),在4w模型對照組中呈強(qiáng)陽性表達(dá),高于同期其他組(P<0.01),可見軟骨基質(zhì)、軟骨陷窩及細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)陽性染色均加深,范圍向軟骨深層擴(kuò)展;在8w、12w反而表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。抗骨增生膠囊組關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)陽性細(xì)胞較少,染色淡;復(fù)元膠囊低劑量組陽性表達(dá)在胞質(zhì)和基質(zhì)中均勻分布,較正常組明顯增多,較模型組少(P<0.05)。復(fù)元膠囊中劑量組陽性表達(dá)與抗骨增生膠囊組差異不明顯(P>0.05);復(fù)元膠囊高劑量組與抗骨陽性表達(dá)較抗骨增生組少(P<0.05)。見圖2,表2。2.3復(fù)元膠囊對ctx-表達(dá)的影響見表3。4w各實驗組較模型組CTX-Ⅱ表達(dá)減少(P<0.01);與正常組比較,各組各期表達(dá)增多(P<0.01);8w、12w模型組含量表達(dá)增多,但增幅減緩(P<0.05);與模型組比較,復(fù)元膠囊中、高劑量組CTX-Ⅱ明顯減少(P<0.05);與抗骨增生膠囊組比較,各期復(fù)元膠囊中、高劑量組表達(dá)差異不明顯。3復(fù)元膠囊對小鼠血清ctx-表達(dá)的影響OA一直以來因其發(fā)病率高、致殘率高、療效不顯著而作為國內(nèi)外的研究熱點。研究發(fā)現(xiàn),在膝OA中,軟骨損傷的重點是基質(zhì)的退變?；|(zhì)的主要成分是膠原,而Ⅱ型膠原(CⅡ)是為軟骨特有的膠原主要形式,占有軟骨干重的60%,維持著軟骨的生物力學(xué)性能。CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原代謝的產(chǎn)物,首次被發(fā)現(xiàn)后即作為骨關(guān)節(jié)炎潛在生物學(xué)標(biāo)記物的研究熱點之一,通過測定體液中CTX-Ⅱ可以反映膠原的降解程度。研究發(fā)現(xiàn),骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變與金屬蛋白酶(MMPs)對細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解有關(guān)。在關(guān)節(jié)軟骨中,最具有活性的膠原蛋白酶有四種,即MMP-1、-8、-13、和14。而MMP-13是已知最有效的Ⅱ型膠原降解酶,Freemont等發(fā)現(xiàn)軟骨退變區(qū)可見Ⅱ型膠原降解,在統(tǒng)一區(qū)域MMP-13表達(dá)上調(diào),并且與病程呈正相關(guān)。根據(jù)本實驗的檢測結(jié)果,MMP-13在正常組表達(dá)較少,以及在4w模型對照組MMP-13的表達(dá)高于8w以及12w組,這與大多數(shù)前期研究結(jié)果是一致的。血清CTX-Ⅱ含量在4w時明顯增加,在8w、12w雖然含量增加,但增量明顯減小。與Mazièbres等在創(chuàng)傷性O(shè)A試驗中結(jié)果一致。這可能由兩個因素導(dǎo)致:①隨著關(guān)節(jié)軟骨損傷的加重,軟骨基質(zhì)的進(jìn)行性流失加劇使殘存的基質(zhì)與軟骨細(xì)胞減少,所降解釋放的CTX-Ⅱ也較少;②CTX-Ⅱ的釋放只在急性創(chuàng)傷或疾病急劇進(jìn)展增加,在恢復(fù)或緩解期釋放減少。骨關(guān)節(jié)炎在中醫(yī)中屬于“骨痹”范疇。近來一些學(xué)者通過血管造影、血液流變學(xué)的研究將其病因病機(jī)總結(jié)為:氣血不足,肝腎陰虛,風(fēng)、寒、濕侵入骨髓,痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致筋骨失養(yǎng),證型歸于肝腎虧虛、氣滯血瘀,治法采取補(bǔ)腎壯骨,益氣活血。復(fù)元膠囊由人參、鹿茸、黃芪、川芎、淫羊藿、當(dāng)歸、枸杞子等藥物組成的復(fù)方成藥。人參、黃芪益氣活血,在現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)都具有抗疲勞、抗缺氧,增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)能力的作用。川芎、當(dāng)歸行氣活血、止痛,其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循環(huán)和血液流變學(xué)等作用。鹿茸、淫羊藿補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨,有調(diào)節(jié)免疫、促性腺激素樣作用,而現(xiàn)代研究表明,性激素能促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。在復(fù)元膠囊防治OA的前期研究中發(fā)現(xiàn),其能下調(diào)凋亡基因P53和凋亡執(zhí)行因子caspase-3mRNA的表達(dá),以及抑制MMP-13的蛋和mRNA的水平,上調(diào)TIMP1,2的蛋白和mRNA的水平,一定程度上防止軟骨退變。近年臨床研究顯示抗骨增生膠囊在骨關(guān)節(jié)疾病方面有很好療效,基礎(chǔ)研究多集中在頸椎病等骨關(guān)節(jié)疾病上。宋永周等在研究中發(fā)現(xiàn),抗骨增生膠囊預(yù)防和治療骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制之一可能體現(xiàn)在:通過抑制軟骨細(xì)胞的凋亡以及基質(zhì)金屬蛋白酶13的產(chǎn)生,抑制細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅱ型膠原的降解,減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷與退變,因此本實驗選擇抗骨增生膠囊作為陽性對照組藥物。實驗結(jié)果顯示復(fù)元膠囊中劑量組與抗骨增生膠囊組療效相當(dāng),高劑量組療效略優(yōu)于抗骨增生膠囊組。本實驗從測定軟骨降解成分水平以及控制降解的主要酶MMP-13的表達(dá)水平證實,復(fù)元膠囊能夠通過抑制MMP-13的產(chǎn)生,使Ⅱ型膠原降解產(chǎn)物CTX-Ⅱ下調(diào),從而減輕了關(guān)節(jié)軟骨的破壞,延緩OA的發(fā)展進(jìn)程。骨關(guān)節(jié)炎的高致殘率源于早期沒有明顯的臨床表現(xiàn)以及輔助檢查,因而不能準(zhǔn)