DB43-T 959.2-2023 異種移植用無(wú)指定病原體（DesignatedPathogen Free,DPF）醫(yī)用供體豬 第2部分：微生物、寄生蟲學(xué)等級(jí)與監(jiān)測(cè)

ICS

70.080CCS

B

43湖 南 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB43/T

959.2—2023代替

異種移植用無(wú)指定病原體（

Free,

DPF）醫(yī)用供體豬第Medical

grade

DPF

donor

pig

for

xenotransplantationPart2:mircrobiological

parasitological

standards

and

surveillance2023

-

11

-

09

發(fā)布

2024

-

-

實(shí)施湖南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局

發(fā)

布DB43/T

959.2—2023 前言························································································································

Ⅲ引言························································································································

Ⅴ1

·····················································································································12

規(guī)范性引用文件······································································································13

術(shù)語(yǔ)和定義············································································································14

微生物學(xué)等級(jí)·········································································································35

檢測(cè)要求···············································································································36

檢測(cè)程序···············································································································37

檢測(cè)方法···············································································································38

檢測(cè)規(guī)則···············································································································59

結(jié)果判定···············································································································610判定結(jié)論··············································································································611 樣本保存··············································································································6附錄

A（規(guī)范性）牛分枝桿菌

PCR

檢測(cè)方法····································································7附錄

B（規(guī)范性） 細(xì)胞內(nèi)鳥型分枝桿菌

PCR

檢測(cè)方法························································

8附錄

C（規(guī)范性） 新型隱球菌

DNA

實(shí)時(shí)熒光定量

PCR

··················································9附錄

D（規(guī)范性） 抗莢膜組織胞漿菌抗體

ELISA

檢測(cè)方法················································

10附錄

E（規(guī)范性） 豬蘭氏類圓線蟲病鏡檢法診斷····························································

11附錄

F（規(guī)范性） 布氏姜片吸蟲鏡檢法診斷··································································

12附錄

G（規(guī)范性） 豬腦心肌炎病毒間接

ELISA

·························································

13附錄

H（規(guī)范性） 人流感病毒多重

PCR

檢測(cè)··································································

14附錄

I（規(guī)范性） 豬巨細(xì)胞病毒

·································································

15附錄

J（規(guī)范性） 皰疹病毒核酸檢測(cè)···········································································

17附錄

K（規(guī)范性） 豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐）RT‐PCR

檢測(cè)··························

19附錄

L（規(guī)范性） 豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）巢式

PCR

檢測(cè)·············································

20附錄

M（規(guī)范性） 豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測(cè)·······························································

21附錄

N（規(guī)范性） 豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒

C（）

···········································

24附錄

O（規(guī)范性） 豬嗜淋巴細(xì)胞皰疹病毒

3

型

熒光定量

檢測(cè)

····························

25附錄

P（規(guī)范性） 新型冠狀病毒肺炎防控方案（第七版）················································

26DB43/T

959.2—2023 本文件按照

GB/T

—《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第

1

部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件是DB43/T

959《異種移植用無(wú)指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫(yī)用供體豬》的第2部分。DB43/T

959已發(fā)布了以下部分：——第1部分：遺傳質(zhì)量控制；——第2部分：微生物、寄生蟲學(xué)等級(jí)與監(jiān)測(cè)；——第3部分：配合飼料；——第4部分：病理學(xué)診斷規(guī)范；——第5本文件替代DB43/T

959.2—2014《異種移植用無(wú)指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫(yī)用供體豬

第2DB43/T

959.2—2014外，主要技術(shù)變化如下：a）

將本文件“標(biāo)題”由“異種移植用無(wú)指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫(yī)用供體豬

第

2

Pathogen

DPF）醫(yī)用供體豬

第

2

部分：微生物、寄生蟲學(xué)等級(jí)與監(jiān)測(cè)”；b）

增加了“引言”一章；c）

1新型冠狀病毒的檢測(cè)及檢測(cè)方法（見(jiàn)

7，2014

7）；d）

更改了“檢測(cè)頻率”（見(jiàn)

，2014

8.1）；e）

2

抽樣數(shù)量”（見(jiàn)

8.2.2，2014

8.2.2請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由湖南省科學(xué)技術(shù)廳提出并歸口。本文件起草單位：中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南賽諾生物科技股份有限公司。本文件主要起草人：王維、羅敏華、李桑、蔡亮、胡鵬志、馬小倩、徐暢、王佳、石興勇。本文件及其所替代文件的歷次版本發(fā)布情況為：——2014年首次發(fā)布為

959.2—2014；——本次為第一次修訂。IIIDB43/T

959.2—2023 異種移植用無(wú)指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

）醫(yī)用供體豬標(biāo)準(zhǔn)化能更好的促進(jìn)異體系中，DB43/T

《異種移植用無(wú)指定病原體（Designated

Pathogen

Free,

DPF）醫(yī)用供體豬》是指導(dǎo)湖南省異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬培育的基礎(chǔ)性和通用性的標(biāo)準(zhǔn)。DB43/T

959旨在確立普遍適用于標(biāo)準(zhǔn)化異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬遺傳質(zhì)量控制、微生物檢測(cè)、飼料、病理學(xué)檢測(cè)、環(huán)境設(shè)施的準(zhǔn)則，擬由五個(gè)部分構(gòu)成。——第1——第2部分：微生物、寄生蟲學(xué)等級(jí)與監(jiān)測(cè)。目的在于保證異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬生物安全性。——第3部分：配合飼料。目的在于保障異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬飼料的安全和營(yíng)養(yǎng)?！?部分：病理學(xué)診斷規(guī)范。目的在于標(biāo)準(zhǔn)化異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬病理學(xué)檢測(cè)內(nèi)容和方法。——第5部分：環(huán)境與設(shè)施。目的在于標(biāo)準(zhǔn)化異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬環(huán)境條件控制和設(shè)施建設(shè)。2014生蟲學(xué)監(jiān)測(cè)的地方標(biāo)準(zhǔn)。DB43/T

959.2發(fā)布實(shí)施已九年，這期間國(guó)際異種移植領(lǐng)域取得了突破性成果，2018DB43/T

959.2DB43/T

高質(zhì)量、高安全性異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬的穩(wěn)定發(fā)展。測(cè)內(nèi)容與方法，以保證異種移植用無(wú)指定病原體醫(yī)用供體豬穩(wěn)定發(fā)展。本次對(duì)

959.2

的修訂，高異種移植的成功率，從而全面提升我國(guó)異種移植發(fā)展水平。DB43/T

959.2—2023Designated

DPF

1

本文件規(guī)定了異種移植用無(wú)指定病原體（Designed

Pathogen

Free,

DPF）醫(yī)用供體豬微生物學(xué)等級(jí)分類、檢測(cè)要求、檢測(cè)程序、檢測(cè)方法、檢測(cè)規(guī)則、結(jié)果判定、判定結(jié)論、樣本保存等。本文件適用于異種移植用

DPF

醫(yī)用供體豬微生物學(xué)等級(jí)監(jiān)測(cè)。2

規(guī)范性引用文件文件。GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物沙門菌檢驗(yàn)方法GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚病原真菌檢測(cè)方法GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 支原體檢測(cè)方法GB/T

14926.27 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠腺病毒檢驗(yàn)方法GB/T

14926.30 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 兔輪狀病毒檢測(cè)方法GB/T

14926.46實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 鉤端螺旋體檢測(cè)方法GB/T

14926.47 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 志賀菌檢測(cè)方法GB/T

14926.48 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)合分枝桿菌檢測(cè)方法GB/T

14926.56 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物狂犬病病毒檢測(cè)方法GB/T

16551 豬瘟診斷技術(shù)GB

17013 包蟲病診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則GB/T

18090豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體外寄生蟲檢測(cè)方法GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 弓形蟲檢測(cè)方法GB/T

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 蠕蟲檢測(cè)方法GB/T

18648 非洲豬瘟診斷技術(shù)GB/T

18638 流行性乙型腦炎診斷技術(shù)GB/T

18641 偽狂犬病診斷技術(shù)GB/T

18646 動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)GB/T

18647 動(dòng)物球蟲病診斷技術(shù)GB/T

18935 口蹄疫診斷技術(shù)GB/T

19200 豬水泡病診斷技術(shù)GB/T

豬鏈球菌

2

型平板和試管凝集試驗(yàn)操作規(guī)程DB43/T

959.2—2023GB/T

豬鏈球菌

2

型分離鑒定操作規(guī)程GB/T

豬鏈球菌

2

型

定型檢測(cè)技術(shù)GB/T

豬鏈球菌

2

型熒光

檢測(cè)方法GB/T

21674 豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法GB/T

22333 日本乙型腦炎病毒反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法GB/T

22915 口蹄疫病毒熒光

檢測(cè)方法GB/T

22917 豬水泡病病毒熒光

RT-PCR

檢測(cè)方法GB/T

27517 鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經(jīng)典毒株復(fù)合

方法GB/T

27536 豬流感病毒分離與鑒定方法GB/T

21674豬圓環(huán)病毒聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)方法GB/T

34757 豬流行性腹瀉

RT-PCR

檢測(cè)方法GB/T

35912 豬繁殖與呼吸綜合征病毒熒光

檢測(cè)方法GB/T

36871 豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒和豬輪狀病毒多重

檢測(cè)方法NY/T

豬傳染性胸膜肺炎診斷技術(shù)NY/T

獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范NY/T

豬痢疾診斷技術(shù)NY/T

豬傳染性萎縮性鼻炎診斷技術(shù)NY/T

豬傳染性胃腸炎診斷技術(shù)NY/T

動(dòng)物和動(dòng)物產(chǎn)品沙門氏菌檢測(cè)方法NY/T

豬巴氏桿菌病診斷技術(shù)NY/T

豬繁殖和呼吸綜合癥免疫酶試驗(yàn)方法SN/T

0420 出口豬肉旋毛蟲檢驗(yàn)方法

磁力攪拌集樣消化法SN/T

豬瘟單克隆抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)SN/T

1396 弓形蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T

豬傳染性胃腸炎阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)SN/T

1699 豬流行性腹瀉檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T

1919豬細(xì)小病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T

2708 豬圓環(huán)病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T

3499 新孢子蟲病檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T

4235 豬戊型肝炎檢疫技術(shù)規(guī)范SN/T

5124 豬

Delta

冠狀病毒檢疫技術(shù)規(guī)范3

術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。異種移植用

DPF

醫(yī)用供體豬

grade

DPF

pig

for

經(jīng)人工飼養(yǎng)與培育，遺傳背景明確或者來(lái)源清楚，

月齡體重宜不超過(guò)

50kg，不攜帶世界衛(wèi)生組織（World

Health

Organization，WHO）指定供體動(dòng)物應(yīng)排除的潛在感染或條件致病和感染性人畜共患體、科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)和質(zhì)量控制鑒定以及其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)的小型豬。DB43/T

959.2—20234

微生物學(xué)等級(jí)異種移植用

DPF

醫(yī)用供體豬微生物學(xué)等級(jí)為醫(yī)用供體無(wú)指定病原體級(jí)。5

檢測(cè)要求5.1 臨床觀察外觀檢查無(wú)異常。5.2 微生物檢測(cè)項(xiàng)目異種移植用

DPF

醫(yī)用供體豬病原微生物檢測(cè)項(xiàng)目見(jiàn)表

1。6

檢測(cè)程序檢測(cè)程序見(jiàn)圖

1。圖

1 異種移植用

醫(yī)用供體豬檢測(cè)程序結(jié)合臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果，需要進(jìn)一步確證時(shí)，可取特定樣本進(jìn)行檢測(cè)。7

檢測(cè)方法檢測(cè)方法見(jiàn)表

1。類型序號(hào)測(cè)項(xiàng)測(cè)方菌類Bacterium

Brucella

sppGB/T

18646

Leptospira

sppGB/T

14926.46

SerpulinahyodysenteriaeNY/T

545

Mycobacterium

bovis附錄A

Mycobacterium

tuberculosisGB/T

14926.48細(xì)胞內(nèi)鳥型結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物Mycobacterium

avium-intracelluare

complex附錄B

Mycoplasma

hyopneumoniaeGB/T

14926.8

Salmonella

typhiGB/T

14926.1NY/T

550

ShigellaGB/T

14926.4710

Bordetella

bronchisepticaNY/T

546

Pasteurella

multocidaNY/T

546NY/T

56412

Actinobacillus

pleuropneumoniaeNY/T

53713

2

型Streptococcus

suis

type

2GB/T

19915.1-3GB/T

19915.7真菌類Fungi14

Pathogenic

dermal

fungiGB/T

14926.415

Cryptococcus

neoformans附錄C16www.bzfxw.

Histoplasma

capsulatum附錄D生蟲Parasites17

EctozoaGB/T

18448.118

Ascaris

suumGB/T

18448.619

Echinococcus

sp.GB

1701320

Isospora

spGB/T

1864721

Strongyloides

ransomi附錄E22

Toxoplasma

gondiiGB/T

18448.2SN/T

139623

Trichinella

spiralisSN/T

042024

NeosporaSN/T

349925

Fasciolopsis

buski附錄F病毒類26

Adenovirus(porcine)GB/T

14926.2727

Encephalomyocarditis

virus附錄G28

porcine

Influenza

virusGB/T

2753629

Human

Influenza

viruses附錄H30

Porcine

cytomegalovirus附錄I31

Porcine

gama-herpesvirus附錄J32Porcine

reproductiveandrespiratory

syndrome

virusGB/T

27517DB43/T

959.2—2023表

表

1異種移植用

醫(yī)用供體豬病原微生物檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法類型序號(hào)測(cè)項(xiàng)測(cè)方病毒類33繁殖與呼吸綜合征病經(jīng)典毒Porcine

reproductive

andrespiratory

syndrome

virusGB/T

3591234

Procine

parvovirusSN/T

191935

RotavirusGB

/T

14926.3036

Pseudorables

virusGB/T

1864137

Rabies

virusGB/T

14926.5638

Foot

and

mouth

disease

virusGB/T

18935GB/T

2291539

Classical

swine

fever

virusGB/T

16551SN/T

1379.140

Japaneses

encephalitis

virusGB/T

18638GB/T

2233341

Porcine

circovirus

type

GB/T

21674

2708422型Porcine

circovirus

type

GB/T

21674

270843傳染性胃腸炎病毒Porcine

transmissible

gastroenteritis

virusGB/T

36871NY/T

548SN/T

1446.144

Porcine

epidemic

diarrhea

virusGB/T

36871GB/T

34757SN/T

169945

Porcine

deltacoronavirusSN/T

512446急性腹瀉綜合征冠狀病毒Swine

acute

diarrhea

syndrome

coronavirus附錄47www.bzfxw.

Porcine

Respiratory

Coronavirus附錄48血凝性腦脊髓炎病毒Porcine

hemagglutinating

encephalomyelitis

virus附錄49

Swine

vesicular

disease

virusGB/T

19200GB/T

2291750內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒Porcine

endogenous

retrovirus

(PERV-C)附錄51

Porcine

lymphotropic

herpesvirus(PLHV)附錄52

Hepatitis

virus

(HEV)SN/T

4235-201553

Severe

Acute

Respiratory

SyndromeCoronavirus

SARS-CoV-2附錄54

Diagnostic

techniques

for

African

swinefeverGB/T

18648DB43/T

959.2—2023表

1表

1異種移植用

醫(yī)用供體豬病原微生物檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)方法（續(xù)）8.1 檢測(cè)頻率每

3

個(gè)月至少檢測(cè)一次。8.2 抽樣8.2.1 選擇

3

月齡以上的異種移植用

醫(yī)用供體豬用于檢測(cè)，隨機(jī)抽樣。體大小樣數(shù)量5050-100100-5001050025100DB43/T

959.2—20238.2.2根據(jù)異種移植用

DPF

醫(yī)用供體豬群體大小，抽樣數(shù)量見(jiàn)表

2。表

2 表

2 抽樣數(shù)量 按病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲檢測(cè)要求聯(lián)合采樣。 采樣方法按照

NY/T

以及醫(yī)學(xué)采樣程序進(jìn)行。8.3樣本標(biāo)識(shí)要求達(dá)實(shí)驗(yàn)室。9

結(jié)果判定

9.1 合格判定

10

判定結(jié)論所有項(xiàng)目的檢測(cè)結(jié)果均合格，判為符合

等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。否則，判為不符合

等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。11

樣本保存11.1 間為

1

年。11.2 存規(guī)范。DB43/T

959.2—2023附

錄 A（規(guī)范性）牛分枝桿菌

PCR

檢測(cè)方法A.1 原理以牛分枝桿菌

基因和

PCR

方法。A.2 樣品采集A.2.1 樣品類型健康樣本A.2.2 樣品采集用無(wú)菌剪刀剪取病料組織約

1.5mL

EP

μL

的組織消化液和蛋白酶

K（終濃度為

l

mg/mL）；55℃，水浴

8h，其間間隔半小時(shí)顛倒

EP

管幾次，以使病料組織與消化液充分反應(yīng)；，離心

5min，取上清液置另一無(wú)菌

1.5mL

EP

管中；加入等體積的苯酚：：24：ll2000rpm

EP

1

℃

30min；

10min，棄上清；沉淀用

70％乙醇清洗，并置

37℃，至乙醇揮發(fā)完全；加入

30μLTE，并加入

37℃，放置

40min；將所得液體作為模板，并置-20℃保存。A.3 操作步驟A.3.1引物的設(shè)計(jì)參照

Mycobacterium

bovis

AF2122/97

基因序列設(shè)計(jì)出

基因和

IS6110

基因引物。引物序列如下：16SrRNA

P1:5’-CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG-16SrRNA

P2:5’-GCCCGTATCGCCCGCACGCT-3’

擴(kuò)增片段大小約為

584bp。IS6110P1:5’3’

IS6110P2:5’-TTTGTCACCGACGCCTACGCT-3’

擴(kuò)增片段大小約為

。A.3.2

L2μ

（1.75pg-1.75μg），L10×

buffer

2.5μL，dNTPs

2μL，IS6110

引物各

0.5μL（5pM

引物各

μL（15pM蒸餾水

14μL，Taq

酶

μL（2.5U）；體系總體積為

25μL。PCR

擴(kuò)增的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性

10min，℃變性

，59.5℃退火

30s，72℃延伸

，30

環(huán)，最后延伸

7min，4℃保存。A.3.3

0.8％的瓊脂糖，電壓

，電泳

12-15min，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。A.4 結(jié)果判定按照設(shè)定的雙重309bp的IS6110基因和約584bp的

16SrRNA

基因的目的片段說(shuō)明

PCR

結(jié)果陽(yáng)性。DB43/T

959.2—2023附

錄 B（規(guī)范性）細(xì)胞內(nèi)鳥型分枝桿菌

PCR

檢測(cè)方法B.1 以鳥型分枝桿菌特異性插入序列

IS1245分枝桿菌。B.2樣品采集B.2.1 樣品類型豬皮膚組織B.2.2 樣品采集無(wú)菌條件下取上述組織

左右，置入

1.5mL

管。B.3 操作步驟B.3.1 組織處理

2mL上清液，2

倍連續(xù)稀釋后裝于微量離心管中。B.3.2

擴(kuò)增和檢測(cè)擴(kuò)增插入序列

：引物

1

為

5’

ACGATCTAC-3’引物

2

為

5’’50μL

PCR

反應(yīng)體系含

10×PCR

緩沖液

5μL，25mmol/L

MgCl2

5μL，dNTPs

μmol/L，引物各1μmol/L，模板

DNA10μL，TaqDNA

聚合酶

1U。循環(huán)條件：94℃預(yù)變性

5min，其后按

94℃

30s，65℃30s，℃

45s，擴(kuò)增產(chǎn)物于

1.5％瓊脂糖凝膠電泳，花青素染色，用紫外檢測(cè)儀觀察結(jié)果并攝影。B.4 結(jié)果判定。出現(xiàn)

427bp

擴(kuò)增帶為陽(yáng)性，未見(jiàn)

427bp

擴(kuò)增帶為陰性。DB43/T

959.2—2023附

錄 C（規(guī)范性）新型隱球菌

DNA

實(shí)時(shí)熒光定量

C.1 以新型隱球菌的

基因序列中一段高度保守序列為目的序列，設(shè)計(jì)出特異引物和探針，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量

PCR

技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。C.2 樣品采集C.2.1 樣品類型豬肺部分泌物C.2.2 樣品采集

取上清，加入雙抗保存?zhèn)溆谩.3操作步驟C.3.1引物的設(shè)計(jì)根據(jù)新型隱球菌的基因序列設(shè)計(jì)引物為：FP:5’-TTACCTGTTGGACTTGGATTTGG-RP:5’-CATAGGCCCAGCGAAACTTATT-3’C.3.2

的提取取氣管分泌物上清加入

和蛋白酶

K，50℃水浴

分鐘搖一次。用酚及酚氯仿抽提，乙醇沉淀，用

20ul

無(wú)菌雙蒸水溶解備用。在反應(yīng)體系中加入

5ul

模板，總量為

50uL。C.3.3 目的基因的擴(kuò)增以

50μL

PCR

反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)：10×PCR

Buffer（含

15mmol/L

MgCl2）5μL，dNTP

mixture（10μmol/L）1μL，Taq

5U/μL）μL、DNA

2μL

3μL

dd

H2O至

50μL，于擴(kuò)增儀擴(kuò)增，循環(huán)條件：94℃

5min，94℃

、58℃

1min

共

個(gè)循環(huán)。C.4 結(jié)果判定取

5μLPCR

產(chǎn)物于

％瓊脂糖（含

10％

）中，5V/cm

電壓電泳

60-75min，紫外透視儀上檢測(cè)，熒光條帶在

處即為陽(yáng)性。DB43/T

959.2—2023附

錄 D（規(guī)范性）抗莢膜組織胞漿菌抗體

檢測(cè)方法D.1 用中

國(guó)

藥

品

生物

制

品

檢定

所

研

制

的莢

膜

組

織胞漿

菌

蛋

白

提取

物

（purified

protein

fromHistoplasma

capsulatum，P-HTPM吸附試驗(yàn)。D.2 樣品采集D.2.1 樣品類型豬血清D.2.2 樣品采集無(wú)菌條件下用一次性注射器取耳靜脈血

，置于試管中，分離血清，待檢。D.3 操作步驟D.3.1 用

1μ孔的抗原包被酶標(biāo)板，50μL/孔，℃孵育

2h。D.3.2 棄去孔中液體，加入洗滌液（含

0.05％

Tween-20

的

0.01mol/L

pH7.4

PBS、PBST），300μL/孔，洗滌

3

次，每次

3min。D.3.3 扣干。D.3.4 加入封閉液（含

5％犢牛血清的

PBST），μL/孔，℃封閉

30min。D.3.5

），100μ/37℃作用

30min。D.3.6

3

次（方法同前）。D.3.7 扣干。D.3.8

的酶標(biāo)抗體（二抗）100μL/37

45min。D.3.9

3

次。D.3.10 扣干。D.3.11 加入底物

顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色

10-15min。D.3.12 每孔加入

μL

2mol/L

H24終止反應(yīng)。D.3.13 測(cè)定吸光度值，按照下列公式計(jì)算

P/N

值=陽(yáng)性對(duì)照孔

OD

均值/陰性對(duì)照孔

OD

D.4 結(jié)果判定當(dāng)被檢樣品的

A

值＞0.135

時(shí)，判定為陽(yáng)性；當(dāng)樣品的

A

0.059-0.135

之間時(shí)，判定為可疑；當(dāng)樣品的

A

值＜0.059

時(shí)，判定為陰性。10DB43/T

959.2—2023附

錄 E（規(guī)范性）豬蘭氏類圓線蟲病鏡檢法診斷E.1 消化道蠕蟲糞學(xué)檢查E.2 樣品采集E.2.1 樣品類型豬糞便E.2.2 樣品采集從豬舍地面及豬直腸分別采集豬的糞樣。E.3 操作步驟E.3.1 飽和食鹽水漂浮法檢查取糞樣

10g

溶于飽和食鹽水中，用玻璃棒攪拌均勻后用

目的金屬篩反復(fù)過(guò)濾，除去大的糞渣，將濾液置于大試管中，讓液面突出于試管口，靜止

30min

后蘸取液面制壓片，在

倍顯微鏡下檢查。E.3.2 尼龍篩淘洗法檢查取糞樣

25

g

置于大燒杯中，用常水溶解并用玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，?jīng)金屬篩反復(fù)過(guò)濾，除去大

260

積物制壓片，在

10

倍和

倍顯微鏡下檢查。E.4 結(jié)果判定E.4.1 飽和食鹽水漂浮法殼薄，大小為（42-53m×（24-32）μm，內(nèi)有幼蟲。鑒定為蘭氏類圓線蟲卵。E.4.2 經(jīng)尼龍篩淘洗法對(duì)豬的糞便進(jìn)行檢查，從地面采集的糞樣中查到蟲體，蟲體細(xì)小，呈乳白色，毛發(fā)狀，鏡下透明，）mm）mm蟲的桿型幼蟲。11DB43/T

959.2—2023附

錄 F（規(guī)范性）布氏姜片吸蟲鏡檢法診斷F.1 消化道蠕蟲糞學(xué)檢查F.2 樣品采集F.2.1 樣品類型豬新鮮糞便F.2.2 樣品采集從豬舍地面及豬直腸分別采集豬的糞樣。F.3 操作步驟F.3.1直接涂片法先取

滴蒸餾水（或

％的甘油水）于載玻片上，再用火柴棒取新鮮的糞便混合均勻，去除污穢后，用低倍鏡檢查。F.3.2 沉淀法取

g

的糞便于燒杯中加

20

mL

水，用篩過(guò)濾后，裝入離心器然后倒上清液，再進(jìn)行離心，反復(fù)數(shù)次，取沉淀渣滴于玻片上，用低倍鏡檢查。F.4 結(jié)果判定看出，長(zhǎng)寬比約為

μm×85-97μm，鑒定為布氏姜片吸蟲陽(yáng)性。12DB43/T

959.2—2023附

錄 G（規(guī)范性）豬腦心肌炎病毒間接

檢測(cè)G.1 由于

2C

白并刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，通過(guò)重組

蛋白為包被抗原建立檢測(cè)豬腦心肌炎病毒抗體間接

ELISA

方法。G.2 樣品采集G.2.1 樣品類型豬血清G.2.2 樣品采集無(wú)菌條件下用一次性注射器取耳靜脈血

，置于試管中，分離血清，待檢。G.3操作步驟G.3.1將重組蛋白

2C

0.05mol/L、

100μL/孔包被酶標(biāo)板，37

1h

后

4℃過(guò)夜。G.3.2 棄去孔中液體，加入洗滌液（含

0.05％

Tween-20

的

0.01mol/L

pH7.4

PBS、PBST），300μL/孔，洗滌

3

次，每次

3min。G.3.3 扣干。G.3.4 加入封閉液（含

5％犢牛血清的

PBST），μL/孔，℃封閉

1h。G.3.5 棄去封閉液，加入待檢血清（一抗），100μL/孔，37

45min。G.3.6

3

次（方法同前）。G.3.7 扣干。G.3.8 加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體（二抗）100μL/37

45min。G.3.9

3

次。G.3.10 扣干。G.3.11 加入底物

顯色液，100μL/孔，室溫避光顯色

10-15min。G.3.12 每孔加入

μL

2mol/L

H24終止反應(yīng)。G.3.13

OD450

nm

光吸收值，按照下列公式計(jì)算

P/N

值：P/N

值=陽(yáng)性對(duì)照孔

/陰性對(duì)照孔OD

均值。G.4 結(jié)果判定當(dāng)被檢樣品的

0.27

時(shí)，判定為陽(yáng)性；當(dāng)樣品的

0.27

時(shí)，判定為陰性。13DB43/T

959.2—2023附

錄 H（規(guī)范性）人流感病毒多重

PCR

檢測(cè)H.1 根據(jù)流感病毒

HA

基因和

M

基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行

RT-PCR

方法檢測(cè)。H.2 樣品采集H.2.1 樣品類型鼻咽拭子H.2.2 樣品采集標(biāo)本采集后，冷凍

12

h

內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，24

h

內(nèi)進(jìn)行流感病毒分離培養(yǎng)和快速檢測(cè)試驗(yàn)。H.3 操作步驟H.3.1

引物設(shè)計(jì)分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物擴(kuò)增HA 全基因片段：H1F--agcaaaagcaggggaaaata-3’H1R--aacaagggtgtttttcctca-3’H3F-3’H3R-3’BF-5’-gggacatgaacaacaaagatgc-3’BR-5’-tgtcagctattatggagctg-H1、

431bp、210bp

和

390bp。H.3.2

提取病毒

模板，用于反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)或置-20℃保存?zhèn)溆?。H.3.3病毒逆轉(zhuǎn)錄用試劑盒進(jìn)行病毒

逆轉(zhuǎn)錄。H.3.4

反應(yīng)體系

25μL

×Buffer

2.5μL、MgCl2（25mM）2μL、dNTP

2μL、Taq（μL）μL、H

對(duì)引物（10mM

1.25μL、逆轉(zhuǎn)錄生成的

cDNA

4μL、加水到

25μL。反應(yīng)程序：94℃

3min，℃

、51℃1min、68℃1min

共

35

個(gè)循環(huán)，℃10min。H.3.5

產(chǎn)物的鑒定取

PCR

5μL

1％瓊脂糖凝膠電泳。H.4 結(jié)果判定出現(xiàn)

431bp、210bp

或

條帶，判定為陽(yáng)性。14DB43/T

959.2—2023附

錄 I（規(guī)范性）豬巨細(xì)胞病毒

I.1 原理TaqMan

技術(shù)，是利用

Taq

3'→5'外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。由于探針與模板是特異性結(jié)合，因此從熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就可以判斷模板數(shù)量。I.2 樣品采集I.2.1樣品類型病變組織I.2.2 樣品采集無(wú)菌條件下取上述組織

1

g

左右，置入

EP

I.3 操作步驟I.3.1 總

RNA

提取

1.5

1mLTrizol

5min

或馬上℃保存，12000rpm離心

15min

200ul

30s

3-5min分層，12000rpm

，取上清液至新

管，中間層和紅色下層

4℃保存，便于提取

DNA

和

0.5

15min，12000rpm

10min，棄上清，

沉淀管底，如沉淀不明顯，則再離心數(shù)秒吸出上清，加入

1

mL

75％乙醇（預(yù)冷），溫和震蕩懸浮沉淀，8000rpm

離心

5min，棄上清，短暫快速離心（5s），棄上清，室溫放置

2min

晾干，沉淀加入

15μL

DEPC

處理水，輕彈管壁溶解，少量樣品

55-60℃水浴孵育

10-15min

OD260/280

值后，樣品放置℃保存。I.3.2 反轉(zhuǎn)錄0.2mL

1μL

總

RNA，1μL

隨機(jī)引物

oligo（dt10μL

DEPC

處理水，混勻，瞬時(shí)離心

5s，70℃水浴

5min

2min，瞬時(shí)離心，加入

4μL

5×Buffer，2μL

0.1M

DTT，2μL

10MmdNTPs，混勻，溫浴

2min，加入

1μL

反轉(zhuǎn)錄酶，42℃溫育

50min，70℃孵育

10min

滅活，℃冰箱保存。I.3.3 引物與

TapMan

探針的設(shè)計(jì)與合成設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物

P1/P2

和

TapMan

探針：P1:5’-TGGCACTGATACTTGACAAGC-3’P2:5’-CTCCCGTGAAGCCGTAAA-3’TapMan

:

FAM-5’’-TAMRA。I.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用含

重組質(zhì)粒的溶液作標(biāo)準(zhǔn)品，

倍稀釋成

×1010

-1.0×

拷貝/μL，共

1115DB43/T

959.2—2023個(gè)稀釋度，以不同濃度的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行

敏感性試驗(yàn)。以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為

X

軸，以FQ-PCR

循環(huán)次數(shù)

Ct

值為

Y

軸作回歸曲線，建立

檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。I.3.5 FQ-PCR

反應(yīng)條件采用

5μmol/L

的引物濃度和

2.5μmol/L

的探針濃度對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，雙溫循環(huán)及

60退火溫度為最佳的循環(huán)條件。

反應(yīng)總體積為

25μL，其中

10×ExTaq

μL（Mg2+濃度為

2.0mmol/LdNTPs

2μL

ExTaq

酶

0.25μL，上下游引物各

0.5ul（10μmol/L），探針

0.25μL（10μmol/L），模板

1μL，dd

H2O

18.00μL，混合均勻，置熒光定量

PCR

儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性

4min，94℃變性

15s，60℃退火延伸

，40

FAM/TAMRA雙標(biāo)記模式。I.3.6 根據(jù)所得曲線作數(shù)據(jù)分析。I.3.7 取部分

PCR

產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。I.4 結(jié)果判定以電泳陰性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否有陽(yáng)性產(chǎn)物。16DB43/T

959.2—2023附

錄 J（規(guī)范性）皰疹病毒核酸檢測(cè)J.1 原理PHV

DNA

DNA聚合酶（

酶）作用下，配以

SD-Buffer（內(nèi)含

Mg2+、

等）、四種核苷酸單體（dNTPs成分，通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外擴(kuò)增法對(duì)豬皰疹病毒進(jìn)行體外擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，

染色，紫外燈觀察，從而達(dá)到快速檢測(cè)之目的。J.2 標(biāo)本采集J.2.1 樣本類型血清或病毒液J.2.2 樣本采集發(fā)病豬腦、淋巴結(jié)、扁桃體、腎和脾等組織標(biāo)本：無(wú)菌條件下取上述組織

1

g

1.5

mL潔凈

管，立即送檢。血清：用一次性無(wú)菌注射器抽取受檢豬耳靜脈或者前腔靜脈靜脈血

mL，靜置斜放待血清析出，10000rpm

3min

μL無(wú)菌

EP

管，保存待檢。J.3 操作步驟J.3.1 引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)引物序列PHV-F:5’PHV-R:5’-CTTGGTGATCAGCAGCAGCTTG-3’J.3.2

血清或病毒液，常規(guī)市售

DNA

提取試劑盒提取

DNA，取提取液進(jìn)行

擴(kuò)增。J.3.3

反應(yīng)總體積為

μL，其中

10×Buffer

2.5μL（Mg2+濃度為

2.0mmol/LdNTPs

2μ

酶0.25μL，上下游引物各

μL（10μmol/L

模板

1μL，dd

H2O

19.00μL，混合均勻，置熒光定量

儀上進(jìn)行自動(dòng)化擴(kuò)增反應(yīng)。按照下列條件擴(kuò)增：循環(huán)條件：95℃預(yù)變性

3min，53℃退火

45s，72℃延伸

3min，共

個(gè)循環(huán)。J.3.4 電泳檢測(cè)J.3.4.1 2凝膠配制：稀釋

50×TAE

至

1×TAE，稱

4

g

瓊脂糖放于

500

mL

錐形瓶中，1×TAE

200

mL，置入微波爐中加熱溶解，再加入

20μL

充分混勻。在電泳槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后使用。17DB43/T

959.2—2023J.3.4.2

PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物

15μL

5V/cm

1×TAE

中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。J.4 檢測(cè)結(jié)果判定

242bp

疹病毒陽(yáng)性，否則為陰性。18DB43/T

959.2—2023附

錄 K（規(guī)范性）豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐CoV）RT‐

檢測(cè)豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒（SADS‐CoV）RT‐

檢測(cè)K.1 原理依據(jù)該病毒的保守

N

基因設(shè)計(jì)特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立

檢測(cè)方法。K.2 樣品采集K.2.1 樣品類型糞便K.2.2 樣品采集標(biāo)本采集后，在-80℃下保存，運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒核酸提取。K.3 操作步驟K.3.1 在樣品中加入磷酸鹽緩沖液（）（20％），冷凍并解凍三次，然后在

10,000

g

下離心10

分鐘。按照病毒核酸試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒核酸提取。-80℃保存?zhèn)溆?。K.3.2 根據(jù)豬急性腹瀉綜合征冠狀病毒

N

基因序列設(shè)計(jì)引物：FGGTCCCTGTGACCGAAGTTTTAG；RGCGTTCTGCGATAAAGCTTAAAACTATTA。K.3.3 參照一步法

RT‐

試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行

RT‐PCR

℃

30

94℃

3

分鐘，94℃變性

35

個(gè)循環(huán)，55℃退火

72℃延伸

秒，最后

72℃5

分鐘。K.3.4

PCR

產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)產(chǎn)物的特異性。K.4 結(jié)果判定以電泳陰性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否有陽(yáng)性產(chǎn)物。19DB43/T

959.2—2023附

錄 L（規(guī)范性）豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）巢式

PCR

檢測(cè)L.1 原理巢式

是一種變異的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，使用兩對(duì)（而非一對(duì)）

引物擴(kuò)增完整的片段。第一對(duì)

引物擴(kuò)增片段和普通

PCR

第二次

PCR

PCR

次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對(duì)并擴(kuò)增的概率極低。因此，巢式

的擴(kuò)增非常特異。L.2 樣品采集L.2.1 樣品類型糞便或鼻拭子L.2.2 樣品采集/糞便樣本保存于-80℃，鼻拭子樣本進(jìn)行冷凍處理后，快速轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。L.3 操作步驟L.3.1

RNA

提取試劑盒說(shuō)明書對(duì)糞便或鼻拭子樣本進(jìn)行

RNA

提取。： ：：L.3.2

PERV

： ：：

；巢式

，

。L.3.3

ISU-1（PRCVMEM-E

或

PRCV

陰性糞便或鼻拭子。L.3.4第一次反應(yīng)體系：將檢測(cè)樣品、陽(yáng)性和陰性對(duì)照的

5μL

RNA、5μL

PCR

緩沖液、5μL

25

mMMgCl2、1μL

10

mM

20

U

Rnasin、5U

逆轉(zhuǎn)錄酶、2.5

U

0.5μL

的引物

F1

和

R1

混合均勻。在

℃孵育

分鐘，℃

5

分鐘。L.3.5 第一次反應(yīng)條件：94℃，1

分鐘；1.5

分鐘；72

分鐘，

個(gè)循環(huán)，10

分鐘。L.3.6

產(chǎn)物以

1:10

稀釋并用作巢式

的模板。取

1μL

5μL

10×

緩沖液、5μL

25

MgCl2、1μL

2.5

U

聚合酶（美國(guó)威斯康星州普羅米加市麥迪遜）和各

0.5μL

50

pm

引物

F2

和

R2

混合。L.3.7 1

L.3.81.5％瓊脂糖凝膠上分析PCR產(chǎn)物。PRCV193–253

bp。L.4 結(jié)果判定以電泳陰性對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否有陽(yáng)性產(chǎn)物。20序列（5’3’）CCAGGATAAATTTCTGTGGAACCAGGACTAACCTTTGCTaqMan

DB43/T

959.2—2023附

錄M（規(guī)范性）豬血凝性腦脊髓炎病毒檢測(cè)M.1 原理根據(jù)

PHEV

S

基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，探針在

5’端標(biāo)記

FAM

熒光素作為報(bào)告熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記

TAMRA

熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)所吸收，儀器檢測(cè)不到熒光信號(hào)；而反應(yīng)進(jìn)行到延伸階段時(shí)，酶發(fā)揮

5’→3’的外切核酸酶功能，將探針降解。探針上的熒光基團(tuán)游離出來(lái)，所發(fā)出的熒光不再為

PCR

反應(yīng)的循環(huán)往復(fù)，

相應(yīng)增長(zhǎng)。M.2樣品采集M.2.1 樣品類型豬的腦、脊髓M.2.2 樣品采集/

2℃?8

℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)

24

h，若長(zhǎng)期保存應(yīng)置于

-70℃

超低溫冰箱中，且避免反復(fù)凍融。M.3 引物和探針序列信息引物和探針序列信息見(jiàn)表

1。表

M.1 表

M.1 引物和探針序列信息見(jiàn)M.4.1

稱取

g

待檢樣品于組織勻漿儀中，加入

mL

TRIzol

裂解液勻漿，使用微量移液器吸取至1.5

mL

無(wú)

RNase

離心管。另取

2

支

無(wú)

離心管，分別加入陽(yáng)性對(duì)照樣品、陰性對(duì)照樣品。向離心管中分別加入

1

mL

TRIzol

裂解液，劇烈振蕩

15

s，室溫靜置

min。采用其他等效的

提取方法，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。加入

μL

預(yù)冷氯仿，振蕩

s，冰上靜置

10

。21RNA1.0

OligodT18

μmol/L）1.0

5×MLV緩沖液4.0

dNTP

4.0

RNase

U/μL）0.5

M-MLV

U/μL）0.5

RNase

2

20.0

10×PCR緩沖液2.0

dNTP

2.0

10

1.0

10

1.0

TaqMan10

1.0

cDNA4.0-40.0

ngTaq

0.5

DB43/T

959.2—20234℃高速冷凍離心機(jī)

12

r/min

。使用微量移液器吸取上層無(wú)色水相于新的

1.5

mL

無(wú)

RNase

離心管中。加入等體積預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，-20℃

，靜置

。4℃高速冷凍離心機(jī)

12

r/min

，棄上清。加入

1

mL

預(yù)冷的

75％乙醇，4

℃

條件下，高速冷凍離心機(jī)

12000

r/min

5

。重復(fù)上一步操作一次。棄上清，濾紙吸干殘余液體，室溫干燥

2

min。加入

20

μL

無(wú)

RNase

H2O

溶解，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度。冰浴保存?zhèn)溆谩?℃冰箱保存不超過(guò)

8

h，長(zhǎng)期保存應(yīng)置于

℃

冰箱。M.4.2 cDNA

模板制備按表

2

中各組分依次加入

PCR

3

s，℃

水浴鍋中水浴

1

h；℃水浴鍋中水浴

2

，-20

℃

冰箱保存?zhèn)溆?。?/p>

M.2 表

M.2 反轉(zhuǎn)錄系配制表設(shè)定

PCR

n+23

n

1管，每個(gè)樣品設(shè)置

3

次重復(fù)反應(yīng)。按表

3

中各組分依次加入

反應(yīng)管，蓋緊管蓋后，500

r/min

瞬時(shí)離心

30

s。表

表

M.3

反應(yīng)體系配制表DB43/T

959.2—2023M.4.4 反應(yīng)參數(shù)將離心后的

PCR

反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光定量

PCR

TaqMan

熒光定量

PCR

PHEV

核酸的反應(yīng)參數(shù)：——第一階段，預(yù)讀

50℃

2

min；——第二階段，預(yù)變性

℃

3

；——第三階段，95℃

s、

℃

s，

60℃

30

s

時(shí)進(jìn)行。M.5 結(jié)果判定M.5.1結(jié)果分析條件設(shè)定根據(jù)收集的

Ct

性對(duì)照樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。M.5.2 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)M.5.2.1 陰性對(duì)照無(wú)

Ct

值并且無(wú)擴(kuò)增曲線。M.5.2.2 陽(yáng)性對(duì)照

Ct

30，并出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線。M.5.2.3 如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照不滿足以上條件，此次試驗(yàn)視為無(wú)效。M.5.3 結(jié)果描述及判定M.5.3.1 陰性判定無(wú)

Ct

值并且無(wú)擴(kuò)增曲線，表明樣品中無(wú)

PHEV

核酸，判定為陰性。M.5.3.2 陽(yáng)性判定Ct

值

≤35，且出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，表示樣品中存在

PHEV

核酸，判定為陽(yáng)性。M.5.3.3 有效原則M. Ct

值＞35，且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣品，建議復(fù)檢。M. 若復(fù)檢結(jié)果仍出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性。若無(wú)典型擴(kuò)增曲線，判定為陰性。23DB43/T

959.2—2023附

錄 N（規(guī)范性）豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒

C（PERV-C）

N.1 原理依據(jù)已公布的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒

基因差異，分別設(shè)計(jì)

、、PERV-C

3

種特異性引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立

PCR

檢測(cè)方法。N.2 樣品采集N.2.1 樣品類型血液樣本N.2.2 樣品采集/無(wú)菌條件下取上述樣本

PBS

豬

PBMC，℃保存?zhèn)溆?。N.3操作步驟N.3.1 提取和總RNA提取：去懸液加入等體積細(xì)胞裂解液及20

mg/mL蛋白酶K10ul，消化，按照

DNA/RNA

提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行

、

.N.3.2 3、、

3

種分型；（：；）（：；）；（：；R-A