力竭運動過程中大鼠紋狀體內神經遞質的動態(tài)變化

力竭運動過程中大鼠紋狀體內神經遞質的動態(tài)變化

根據(jù)初步研究，運動疲勞后，大鼠圖像高信號放電源的比例顯著增加，金元爆發(fā)放電活動增多，金元興奮增強。初步證實，條紋體參與了運動的調節(jié)，也是導致運動疲勞的重要中風因素之一。神經元間的信息傳遞主要通過神經遞質實現(xiàn),故推測電變化與腦內神經遞質變化有關。因此,圍繞運動疲勞與神經遞質之間的關系展開研究成為新近關注的熱點。然而,由于受到研究技術的限制,目前的研究結果多以斷頭取腦的方法獲得,只能通過運動結束后腦神經遞質的變化特征間接反映運動中的狀況,有一定的時間滯后性。為此,本研究采用微透析和高效液相色譜(highpressureliquidchromatographytechniques,HPLC)聯(lián)用技術,對一次性力竭運動過程中大鼠紋狀體細胞外液神經遞質谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)變化規(guī)律進行活體動態(tài)觀察,探討紋狀體內神經遞質在運動疲勞產生、發(fā)展和恢復過程中的變化規(guī)律,并進一步解釋運動疲勞過程中紋狀體神經元電活動改變的可能機制。1材料和方法1.1實驗動物及原料選用清潔級健康雄性wistar大鼠8只,8周齡,體重250g±10g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2002-2003,京ICP備05076685號。常規(guī)分籠飼養(yǎng),自由飲水進食,自然光照,動物房內溫度20℃±3℃,相對濕度為40%~60%。1.2試劑與標準液主要儀器:微量注射泵(BAS,MD-0250),微透析探針(BAS,MD-2204),微透析探針套管(BAS,MD-2251),三維立體定位儀(日本成茂,SN-3N),高效液相色譜儀(日本島津LC-20A),熒光檢測器(日本島津,RF-10AXL),色譜工作站(日本島津),色譜分析柱(日本島津,BDSC18柱,4-6mm×250.0mm,5μm),顱骨鉆(MF-5362,SiliteCorporation)。主要試劑:鄰苯二甲醛(OPA,Sigma),β-巰基乙醇(β-MCE,Sigma),Glu和GABA標準品(Sigma),甲醇色譜醇(MeOH,Baker),磷酸二氫鉀,四硼酸鈉,無水碳酸鈉等,高效液相所用試劑均為國產分析純。所有溶液均用超純水(Millipore)配制,并以0.2μM無菌過濾器過濾,冷藏備用。VVGlu和GABA標準溶液:精密稱取Glu和GABA標準品,分別配置成0.4mmol/L的Glu和0.2mmol/L的GABA標準溶液;衍生試劑:精密稱取OPA125mg,用2.5ml甲醇溶解后,加入25ml濃度為0.4mol/L的硼酸緩沖液(pH9.5),渦旋混勻,再加入100μlβ-巰基乙醇;人工腦脊液(aCSF):NaCl(126mM),KCl(2.4mM),KH2PO4(0.5mM),MgCl2(0.85mM),NaHCO3(27.5mM),Na2SO4(0.5mM),CaCl2(1.1mM)。1.3骨性標志的設置大鼠以戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔麻醉,俯臥固定于腦立體定位儀上,沿大鼠頭頂正中線做矢狀切口,暴露前、后囟及冠、矢狀縫等骨性標志。調整門齒高度,使前囟和后囟處在同一水平面上。依照大鼠腦立體定位圖譜,在紋狀體對應的顱骨部位鉆孔,掀去硬腦膜。將透析套管定植入左側紋狀體(P:0.2,L:3,H:3.2),并用小螺釘和牙科水泥固定,保證導軌不隨動物的正?；顒佣苿踊蛩蓜印Ｐg后4~5d,手術引起的不良反應即可消失,大鼠飲食和行為恢復正常,開始進行恢復性的遞增負荷運動訓練。1.4增加負荷跑臺運動方案待大鼠能夠以20m/min的速度跑30min,并未見不良反應,即可進行正式實驗。一次性力竭運動采用本實驗室建立的遞增負荷跑臺運動方案,跑臺坡度為0°,負荷分為3級:I級,8.2m/min,15min;II級,15m/min,15min;III級,20m/min,運動至力竭。力竭判定標準為:動物不能維持預定跑速,滯留于跑道后擋板不動,使用光、電、聲刺激驅趕仍無效,并伴有呼吸急促、俯臥跑臺、垂頭不起等行為表現(xiàn)。1.5glu和gaba的測定開啟透析灌流系統(tǒng),調節(jié)恒流泵控制液體流速為2μl/min,將透析探針插入預先植入腦內的探針導軌,并與人工腦脊液灌流系統(tǒng)直接相連(圖1)。灌流平衡60min后開始運動,在運動過程中和恢復期90min內收集透析液,采樣頻率為1次/30min,每次采集樣品量為60μl,并及時放入-20℃冰箱中保存待測。OPA柱前衍生:準確提取30μlGlu、GABA標準溶液或微透析樣品液,再加入0.05mol/L的碳酸鈉溶液15μl和15μl衍生試劑,混勻45s后靜置反應30s進樣,進樣量為25μl。Glu和GABA測定:采用高效液相色譜(熒光檢測)法(日本島津公司液相色譜儀)。色譜條件:激發(fā)波長(Ex)=357nm、發(fā)射波長(Em)=455nm,柱溫箱25℃,色譜柱為日本島津公司C18柱(5μm,250.0mm×4.6mm)。采用梯度洗脫,流動相為A相甲醇:B相磷酸二氫鉀緩沖液(pH6.6)=40:60;將30μl透析液樣品加入Na2CO3和衍生劑各15μl,混勻45s后靜置30s進樣,進樣量為20μl。標準曲線的測定:精密量取Glu和GABA標準品,分別配成10、1、0.1、0.01和0.001μmol/L的混合溶液,測定各濃度峰面積。以濃度為橫坐標、以峰面積為縱坐標,計算出樣品Glu的標準曲線為:Y=2681511.8302X+38573.3392(r=0.9994)(圖2A),樣品GABA的標準曲線為:Y=3170360.4892X+194408.5210(r=0.9999)(圖2B)。應用標準曲線計算微透析液中各物質的含量。采用高效液相色譜分析的方法檢測Glu和GABA標準樣品,確定待測物質的保留時間(如圖3A)。然后檢測大鼠紋狀體的透析液樣品,將Glu和GABA兩種神經遞質進行有效分離(如圖3B)。1.6大鼠造林大鼠微透析實驗結束后,用10%水合氯醛按0.35ml/kg劑量腹腔麻醉大鼠,仰臥位固定四肢。打開胸腔,用4%福爾馬林溶液經心臟常規(guī)灌流固定,取出腦組織,冠狀面做切片,對照大鼠腦立體定位圖譜鑒定探針尖端所在位置(圖4),探針未準確插入紋狀體的數(shù)據(jù)將被刪除。1.7實驗結果的描述實驗過程中,采樣是連續(xù)進行的,采樣速度是2μl/min,由于分析方法要求的最少進樣量為30μl,因此采樣時間至少需15min以上。本實驗選取30min為一個點,以在某一30min時間內收集到的60μl樣品中的神經遞質含量反映此時間段內遞質的水平。實驗過程中,大鼠不能都正好在整點或半點力竭。為此,將大鼠力竭點所屬的那個30min時間段命名為力竭期。大鼠運動至力竭的時間個體差異較大(163.00min±30.12min),但一般都在2h以上,故在力竭期前均至少可收集到2個或2個以上的30min樣品,這兩個點分別定義為力竭期前60min和力竭期前30min;力竭期后的時間點分別定義為力竭期后30min、力竭期后60min和力竭期后90min。即以力竭期所屬的時間段為參考,往前取2個點的樣、往后取3個點的樣進行統(tǒng)計。為便于區(qū)分大鼠在力竭運動過程中不同階段紋狀體胞外Glu和GABA水平的動態(tài)變化特征,將整個實驗過程劃分為4個階段:安靜狀態(tài)(0);運動狀態(tài)Ⅰ(30~60min);運動狀態(tài)Ⅱ(力竭期前60min~力竭)和恢復狀態(tài)(力竭~恢復90min),運動狀態(tài)Ⅰ與運動狀態(tài)Ⅱ之間的時間點忽略,以保證檢測樣本統(tǒng)計處理的一致性。以每只大鼠安靜時透析液物質的平均濃度為基礎值,以不同時間段樣品透析液物質濃度占基礎值濃度的百分比反映其變化規(guī)律。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差(ue0af±s)表示,應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行RepeatedmeasuresANOVA分析,P<0.05表示差異顯著性。2結果2.1glu對gaba和glu的影響圖5顯示,Glu從運動開始出現(xiàn)上升,力竭期前60min達到峰值,之后開始下降,在恢復期30min降到最低點,之后又回升。與安靜狀態(tài)相比,Glu水平在運動60min、力竭期前60min、力竭期前30min、力竭期及其后90min恢復期內均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。圖6顯示,GABA水平變化趨勢與Glu相反,從運動開始即緩慢下降,從運動狀態(tài)Ⅱ開始急劇下降,力竭期前30min下降至最低點,之后上升,并在力竭期幾乎達靜息水平。GABA水平在力竭期前60min、力竭期前30min及力竭期后60min的恢復期均顯著低于安靜狀態(tài)(P<0.05,P<0.01)。2.2東北部下降、下降、下降、下降由圖7可見,Glu/GABA比值從運動開始上升,力竭期前60min達到最高,之后下降,在恢復期30min降到最低,之后緩慢上升。與安靜狀態(tài)相比,Glu/GABA比值在力竭期前60min、力竭期前30min、力竭期及其后恢復60min和90min時均顯著升高(P<0.05,P<0.01)。3glu神經元自由基因子檢測紋狀體是基底神經節(jié)中接收皮層傳入信息的主要核團,皮層發(fā)出的Glu能神經纖維按一定的定位排列投射到紋狀體,再由紋狀體發(fā)出GABA能神經纖維,經直接或間接通路到達蒼白球內側部(GPi)/黑質網狀部(SNr),經丘腦返回皮層。其功能不僅與隨意運動的執(zhí)行和調節(jié)有關,而且在運動可塑性方面也起著關鍵作用。Glu是腦內含量較高的氨基酸,對神經元有興奮調控作用,屬興奮性神經遞質;GABA在腦組織中有抑制突觸傳導的作用,屬抑制性神經遞質。因此,腦組織Glu、GABA含量及其比值常被作為評定神經元興奮性的重要指標之一。本研究中,在運動狀態(tài)Ⅰ,大鼠紋狀體Glu水平及Glu/GABA比值上升,GABA水平下降;而在運動狀態(tài)Ⅱ至力竭后30min的恢復期內,大鼠紋狀體Glu水平及Glu/GABA比值均下降,GABA水平總體上升。我們發(fā)現(xiàn),神經遞質水平的動態(tài)變化與大鼠行為學表現(xiàn)基本一致。運動開始時大鼠體力充沛、精神飽滿;但運動約30min(運動狀態(tài)Ⅰ末)左右出現(xiàn)疲勞癥狀,不能按預定強度繼續(xù)運動;此時給予驅趕、聲、光、電等刺激,大鼠可繼續(xù)維持原有強度運動很長時間(運動狀態(tài)Ⅱ),直到力竭。Potts等研究發(fā)現(xiàn),長時間運動引起腦Glu含量增加和Glu/GABA比值下降;而Ishide等的研究發(fā)現(xiàn),短時間大強度劇烈運動引起腦Glu升高而GABA降低。這些結果與本研究結果基本一致。神經遞質Glu含量增加,一方面可能是神經系統(tǒng)對運動的一種代償性反應,增加運動神經元的興奮性,維持運動神經元的節(jié)律性活動,促進運動神經元突觸信號的傳遞及整合作用,滿足運動需要。另一方面,關于中樞神經系統(tǒng)缺血缺氧的相關研究證實,Glu具有興奮性毒性作用,即當細胞外液Glu持續(xù)增加到一定濃度時,神經系統(tǒng)會因過度興奮而損傷。本實驗發(fā)現(xiàn),大鼠運動疲勞后紋狀體內Glu含量明顯升高,說明Glu能神經元興奮性增強;而Glu能神經元與紋狀體神經元之間存在廣泛的突觸聯(lián)系,疲勞后Glu含量上升可能是導致紋狀體神經元高頻放電比例增加、神經元興奮性增強等電活動改變的原因之一。GABA則是紋狀體內抑制性遞質,主要通過影響Cl-通道、增加Cl-內流而降低運動神經元的興奮性。GABA從運動狀態(tài)Ⅱ開始急劇下降,力竭期前30min下降至最低,之后開始上升并在力竭時達到靜息水平。這表明大鼠力竭時紋狀體內興奮性氨基酸與抑制性氨基酸的代謝失衡,抑制性神經遞質GABA活動起了主導作用。由此推論,神經遞質Glu和GABA在運動疲勞不