中國(guó)gilmann綜合征患者ug1a1基因突變位點(diǎn)的遺傳分析

中國(guó)gilmann綜合征患者ug1a1基因突變位點(diǎn)的遺傳分析

吉爾伯特綜合征是臨床上最常見(jiàn)的遺傳膽紅素代謝障礙疾病。主要臨床表現(xiàn)為非溶血性非結(jié)合性高膽紅素血癥。病變的原因是肝臟微粒體中二磷酸葡萄糖乙酸鹽（b-ugt）的代謝。近20余年,分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展推進(jìn)了UGT1A1基因結(jié)構(gòu)異常和功能改變的研究。目前已發(fā)現(xiàn)不同人群的Gilbert綜合征存在遺傳背景差異,但這些研究多來(lái)自歐美和日本,國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道極少。本研究通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和直接DNA測(cè)序法,對(duì)1例中國(guó)Gilbert綜合征家系作詳細(xì)的UGT1A1基因突變篩查,確定突變位點(diǎn),并通過(guò)檢測(cè)血清膽紅素水平對(duì)基因型與表現(xiàn)型的相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證,旨在明確其遺傳規(guī)律。對(duì)象和方法一、肝胰腺組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。在功能先證者男,57歲,已婚,漢族。自幼即有間歇性黃疸,既往多次實(shí)驗(yàn)室檢查顯示除血清非結(jié)合性膽紅素增高外,其他肝功能指標(biāo)均正常。甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒標(biāo)志物均陰性。網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)正常,紅細(xì)胞形態(tài)分析未見(jiàn)異常,紅細(xì)胞脆性試驗(yàn)正常。肝臟B超檢查正常。根據(jù)肝功能試驗(yàn)和低熱量試驗(yàn)結(jié)果診斷為Gilbert綜合征。同時(shí)調(diào)查相關(guān)家系成員5名,所有受檢者均簽署知情同意書。采集外周靜脈血,行肝功能試驗(yàn)。二、ust1a1基因?qū)押塑账嵋锏闹峦蛔冃詸z測(cè)OLYMPUSAU600全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司);基因組DNA提取試劑盒(北京天為時(shí)代科技有限公司);UGT1A1基因9對(duì)寡核苷酸引物(上海賽百盛基因技術(shù)有限公司);EppendorfMastercyclerPCR儀(德國(guó)Eppendorf公司);FR-980生物電泳圖像分析系統(tǒng)(上海復(fù)日科技有限公司);ABI3700型DNA測(cè)序儀(美國(guó)PE公司);三磷酸脫氧核苷(dNTP)和高保真PCR酶(KOD-Plus-)(日本Toyobo公司)。三、ugt11a基因的遺傳分析1.提取的dna參照試劑盒說(shuō)明,抽取先證者及其5名家系成員的外周靜脈血,提取全血白細(xì)胞基因組DNA,-20℃保存。2.pcr擴(kuò)增體系根據(jù)人類基因文庫(kù)數(shù)據(jù),采用Primer3.0軟件,設(shè)計(jì)UGT1A1基因上游苯巴比妥反應(yīng)增強(qiáng)元件(PBREM)、啟動(dòng)子TATA盒和5對(duì)外顯子(其中1號(hào)和5號(hào)外顯子因片段較長(zhǎng),分別設(shè)計(jì)了2對(duì)引物)共9對(duì)引物(見(jiàn)表1)。實(shí)驗(yàn)引物濃度均為10μmol/L,以基因組DNA為模板行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中含50~200ng基因組DNA、上下游引物各10μmol/L、0.2mmol/LdNTP和KOD-Plus-1.0μl,PCR緩沖液補(bǔ)充雙蒸水至50μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min,94℃變性15s,退火30s(退火溫度:PBREM、啟動(dòng)子TATA盒、Ex2和Ex4為58℃,Ex1N1和Ex5N1為60℃,Ex1N2為64℃,Ex3為56℃,Ex5N2為62℃),68℃延伸30s,循環(huán)30次,68℃終延伸5min。3.瓊脂糖凝膠電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物4.0μl行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析,1.0μl溴化乙錠染色,1.5%瓊脂糖凝膠電泳,生物電泳圖像分析系統(tǒng)觀察DNA電泳條帶并攝影。檢測(cè)結(jié)果采用SmartView軟件分析。以pBR322DNA/HaeⅢ作為標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量。4.dna序列分析四、疾病史、良好并發(fā)癥家系調(diào)查問(wèn)卷內(nèi)容包括性別、年齡、是否近親婚配、健康狀況、有無(wú)慢性肝病、有無(wú)遺傳疾病史、既往肝功能檢查結(jié)果、膽紅素水平等。獲取全部家系成員UGT1A1基因DNA測(cè)序分析結(jié)果后,根據(jù)UGT1A1基因突變并結(jié)合膽紅素代謝障礙的表現(xiàn),按遺傳作圖方法標(biāo)記出UGT1A1基因突變家系成員的位置,分析突變基因的來(lái)源和遺傳方式。結(jié)果一、正常范圍和相對(duì)范圍先證者及其5名家系成員的血清結(jié)合膽紅素水平均在正常范圍內(nèi)。先證者(Ⅱ-2)和Ⅱ-3血清非結(jié)合膽紅素水平顯著升高,Ⅱ-4和Ⅲ-1輕度升高,Ⅰ-1和Ⅱ-1正常(見(jiàn)表2)。二、原引物測(cè)序以7對(duì)引物擴(kuò)增5對(duì)外顯子,得到特異性產(chǎn)物后,再以原引物進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與基因文庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析,排除了該家系UGT1A1基因5對(duì)外顯子區(qū)域的突變。三、t-339g突變對(duì)UGT1A1基因上游PBREM的測(cè)序結(jié)果顯示先證者及其4名家系成員存在T-3279G突變,其中Ⅱ-2以及Ⅰ-1、Ⅱ-3和Ⅱ-4為突變純合子,Ⅲ-1為突變雜合子,Ⅱ-1為正?；蛐?野生型)(見(jiàn)圖1)。四、ta插入突變對(duì)啟動(dòng)子TATA盒序列的掃描結(jié)果顯示該家系UGT1A1基因啟動(dòng)子存在TA插入突變,即由正常的A(TA)6TAA突變?yōu)锳(TA)7TAA。其中Ⅱ-2和Ⅱ-3為突變純合子,Ⅰ-1和Ⅲ-1為突變雜合子,Ⅱ-1和Ⅱ-4為正?；蛐?見(jiàn)圖2)。五、t1a1基因型根據(jù)測(cè)序結(jié)果,明確了每位家系成員的UGT1A1基因型,以A(TA)7TAA等位基因?yàn)榛A(chǔ),結(jié)合T-3279G和血清非結(jié)合膽紅素水平,繪制出家系圖譜(見(jiàn)圖3)。不同基因型患者的血清激素活性Gilbert綜合征的發(fā)病原因是位于染色體2q37位點(diǎn)的UGT1A1基因發(fā)生缺陷,導(dǎo)致B-UGT表達(dá)下降。UGT1A1基因的突變類型較多,且不斷有新的突變類型被發(fā)現(xiàn),血清非結(jié)合膽紅素增高幅度的差異也較大,某些突變純合子患者甚至可表現(xiàn)為Crigler-Najjar綜合征。本研究是國(guó)內(nèi)有關(guān)Gilbert綜合征UGT1A1基因T-3279G和A(T)7TAA的首例報(bào)道。本研究中,UGT1A1基因編碼區(qū)的5對(duì)外顯子均無(wú)突變,全部?jī)?nèi)含子/外顯子剪接邊界位點(diǎn)序列均遵守GT/AG法則,未檢測(cè)到相關(guān)突變。但UGT1A1基因啟動(dòng)子TATA盒發(fā)生了TA插入突變,上游PBREM存在T-3279G突變。其中Ⅱ-2和Ⅱ-3為A(TA)7/7TAA純合子,同時(shí)也是T-3279G純合子,其血清非結(jié)合膽紅素水平顯著高于正常值。Ⅰ-1和Ⅲ-1為A(TA)6/7TAA雜合子,Ⅲ-1的血清非結(jié)合膽紅素水平略高于正常值,而Ⅰ-1雖處于正常范圍內(nèi),但該家系成員長(zhǎng)期服用苯二氮卓類藥物,推測(cè)此藥物可能對(duì)B-UGT的表達(dá)有一定影響。Ⅱ-1和Ⅱ-4為正常野生型A(TA)6/6TAA純合子,Ⅱ-1的血清非結(jié)合膽紅素水平在正常范圍內(nèi),而Ⅱ-4略高于正常值,推測(cè)后者與T-3279G突變純合子的作用有關(guān)。由此可見(jiàn),本例Gilbert綜合征家系發(fā)病是UGT1A1基因啟動(dòng)子TATA盒與PBREM多態(tài)性改變共同作用的結(jié)果,且UGT1A1基因啟動(dòng)子A(TA)7TAA等位基因?qū)δ懠t素的影響更為重要。就遺傳方式而言,本例Gilbert綜合征家系發(fā)病符合常染色體隱性遺傳。人類不同種屬Gilbert綜合征的遺傳背景存在差異。白種人Gilbert綜合征啟動(dòng)子TATA盒TA插入突變的發(fā)生率約為30%~40%,幾乎均為A(TA)7/7TAA純合子,不存在編碼區(qū)突變。日本人群Gilbert綜合征TA插入突變的發(fā)生率為11%,僅1/3為A(TA)7/7TAA純合子,沒(méi)有編碼區(qū)突變;其余2/3存在編碼區(qū)突變。研究顯示日本Gilbert綜合征患者基因突變的類型主要是編碼區(qū)錯(cuò)義突變,如G71R、P229Q、Y486D等,其中第一外顯子的G71R錯(cuò)義突變最為常見(jiàn)。有關(guān)中國(guó)人群Gilbert綜合征遺傳背景的研究極少,因此,本研究發(fā)現(xiàn)的PBREM和TATA盒突變而無(wú)外顯子編碼區(qū)堿基突變的致病特點(diǎn)在中國(guó)Gilbert綜合征患者中是否具有代表性,尚有待進(jìn)一步研究。事實(shí)上,TATA盒TA插入突變并不是Gilbert綜合征發(fā)病的唯一原因。Bosma等的體外表達(dá)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)A(TA)7TAA突變者的B-UGT轉(zhuǎn)錄活性為正常者的1/3。Beutler等的研究結(jié)果顯示A(TA)7TAA突變者的UGT1A1基因轉(zhuǎn)錄活性為正常者的60%~80%。研究顯示日本Gilbert綜合征患者和正常對(duì)照者中,基因型為A(TA)7/7TAA突變純合子者的平均膽紅素水平分別為37.7μmol/L和16.2μmol/L,基因型為A(TA)6/7TAA突變雜合子者的平均膽紅素水平分別為30.6μmol/L和10.7μmol/L,正常野生型A(TA)6/6TAA純合子者的平均膽紅素水平分別為19.6μmol/L和9.5μmol/L。提示除受TATA盒控制外,UGT1A1基因的表達(dá)水平亦受其他調(diào)控區(qū)域的影響,這解釋了相同基因型患者的血清膽紅素水平存在顯著差異的原因。一般認(rèn)為,Gilbert綜合征患者的UGT1A1基因活性為正常者的30%。最近研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因上游PBREMT-3279G突變也可使轉(zhuǎn)錄活性下降60%。由此推測(cè),A(TA)7/7TAA突變合并T-3279G突變可使UGT1A1的轉(zhuǎn)錄活性降至30%或更低。PBREM約位于TATA上游3kb區(qū)域-3483/-3194,大小為290bp。Maruo等的研究對(duì)基因型為A(TA)7/7TAA的11例白種人和12例日本Gilbert綜合征患者的研究發(fā)現(xiàn),這些患者均為T-3279G突變純合子。對(duì)日本和韓國(guó)人群的研究發(fā)現(xiàn),T-3279G突變與UGT1A1基因轉(zhuǎn)錄活性下降和膽紅素水平升高顯著相關(guān)。但白種人T-3279G突變對(duì)UGT1A1基因的基礎(chǔ)活性和誘導(dǎo)活性均無(wú)影響。本研究中,家系成員Ⅱ-4為T-3279G突變純合子,TATA盒和外顯子均無(wú)突變,但其血清膽紅素水平高于正常范圍,符合Gilbert綜合征的診斷標(biāo)準(zhǔn),與Sugatani等的研究中的1例患者完全相同,推測(cè)這很有可能是東西方人種Gilbert綜合征遺傳特征的差異之一。不同人種PBREMT-3279G的TT、TG和GG三種基因型的頻率差異非常顯著。日本人群中,這三種基因型的頻率分別為53%、40%和7%,白種人分別為24%、58%和18%,非洲裔美國(guó)人分別為3%、24%和73%。Kitagawa等的研究發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因-3279位點(diǎn)與TATA盒間存在高度連鎖不平衡,TATA盒為A(TA)7TAA時(shí),-3279位點(diǎn)多為G;TATA盒為A(TA)6TAA時(shí),-3279位點(diǎn)可能為G,也可能為T。本研究中,UGT1A1基因-3279位點(diǎn)與TATA盒間也存在類似的連鎖不平衡。但這種連鎖不平衡在白種人和非洲裔美國(guó)人中并不顯著,TATA盒為A(TA)7TAA時(shí),-3279位點(diǎn)可能為G或T;而TATA盒為A(TA)6TAA時(shí),-3279位點(diǎn)多為T。提示這一特征很可能是東西方人種Gilbert綜合征遺傳特征的又一差異。值得注意的是,UGT1A1基因有許多外源性底物。這些底物可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)UGT1A1基因而導(dǎo)致黃疸,影響某些物質(zhì)的代謝。這對(duì)UGT1A1基因活性僅為正常人30%的Gilbert綜合征患者顯得尤其重要。據(jù)報(bào)道,單一T-3279G突變雜合子患者出現(xiàn)伊立替康嚴(yán)重毒性反應(yīng)的危險(xiǎn)性較正?；蛐驼吒?.24倍,如T-3279G突變雜合子合并A(TA)6/7TAA,則危險(xiǎn)性高達(dá)6.2倍。因此,檢測(cè)腫瘤患者是否攜帶T-3279G突變和(或)A(TA)7TAA突變,可很好地預(yù)測(cè)抗癌藥物伊立替康可能發(fā)生的嚴(yán)重不良反應(yīng)。Adegoke等的研究認(rèn)為,A(TA)7TAA等位基因增加了中國(guó)漢族40歲以下女性患乳腺癌的危險(xiǎn)性。由此可見(jiàn),Gilbert綜合征并不是傳統(tǒng)概念上完全良性的疾病,研究UGT1A1基因多態(tài)性對(duì)其活性的影響至少具有遺傳藥理學(xué)和腫瘤遺傳學(xué)意義。有關(guān)UGT1A1基因的研究表明Gilbert綜合征與Crigler-Najjar綜合征Ⅱ型之間在膽紅素水平和基因突變位點(diǎn)均存在交叉,這對(duì)兩者的傳統(tǒng)診斷標(biāo)準(zhǔn)提出了挑戰(zhàn)。既往確診Gilbe