基于家系的家系wdr-aq-fop多態(tài)性與侵襲性牙周炎的關(guān)聯(lián)研究

基于家系的家系wdr-aq-fop多態(tài)性與侵襲性牙周炎的關(guān)聯(lián)研究

所謂牙周炎，是一種與慢性牙周炎顯著不同的牙周炎。臨床表現(xiàn)為早牙、早牙、早葉牙，具有一定的家族聚集能力。病因包括復(fù)雜的外源因素(微生物因素與環(huán)境因素等)和遺傳因素。流行病學(xué)研究顯示,人群中不同個(gè)體的易感性有很大差異,這種差異可能主要是由遺傳因素決定的。目前已發(fā)現(xiàn)人類多個(gè)基因序列的多態(tài)性同牙周炎的易感性和牙周組織破壞程度相關(guān),其中維生素D受體(vitaminDreceptor,VDR)是1,25(OH)2D3發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的核內(nèi)生物大分子,其本質(zhì)是一種調(diào)控細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。VDR廣泛分布于體內(nèi)各組織細(xì)胞中,參與骨代謝和免疫炎癥反應(yīng)。一些研究表明,1,25(OH)2D3及其受體VDR的基因多態(tài)性不僅與骨關(guān)節(jié)疾病有關(guān),而且與牙周炎關(guān)系密切。學(xué)者們發(fā)現(xiàn),與骨代謝有關(guān)的VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)有4個(gè),分別為BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ。近年來,國內(nèi)外學(xué)者對這些位點(diǎn)的多態(tài)性與牙周炎易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究,但結(jié)果不一,可能與樣本量、疾病表型定義、種族差異、環(huán)境暴露以及人群分層等因素有關(guān)。家系研究可以較好地避免人群分層等因素的影響,被用于多因素疾病的研究中。本課題組以往的研究結(jié)果表明,VDRTaqⅠ和FokⅠ位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphisms,SNP)可能與中國AgP患者的易感性有關(guān),但這種關(guān)聯(lián)性有待于在家系人群中得到證實(shí)。本研究擬用家系研究的方法對AgP患者及其親屬VDRTaqⅠ和FokⅠ位點(diǎn)的多態(tài)性與AgP的易感性進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。1數(shù)據(jù)和方法1.1agp的診斷以2001年7月至2009年6月間在北京大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科門診確診的93例AgP先證者及先證者引薦法(probandinitiatedenrollment)納入的155例一級親屬作為研究對象。本研究已通過北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有研究對象均簽署知情同意書。AgP的確診參照1999年國際牙周病分類研討會(huì)所制定的標(biāo)準(zhǔn),納入條件包括:年齡小于36歲;快速的牙槽骨破壞和附著喪失;全口至少有2顆牙(其中一顆為第一磨牙)的探診深度≥5mm,鄰面附著喪失≥3mm,每名患者均拍攝全口根尖片證實(shí)有鄰面牙槽骨吸收;患者除患牙周炎外,全身健康,無糖尿病、心血管疾病和血液疾病等系統(tǒng)性疾病,女性未懷孕或哺乳。親屬的診斷參照1999年牙周病分類法和現(xiàn)狀與回顧性相結(jié)合(thecurrentandretrospectivediagnosisandreportedcasehistory)的評分標(biāo)準(zhǔn)對其牙周破壞狀況作出評估診斷,即利用現(xiàn)有臨床證據(jù)(包括全口根尖片、全口牙周檢查大表),并結(jié)合其口腔既往診療記錄或牙周疾病史對是否患有AgP的可能性進(jìn)行評分后做出評估。根據(jù)其可以診斷為AgP可靠程度的不同,定義為確定、較確定和可能3種診斷類型。由于可能型患者患病的證據(jù)相對較少,故在本研究中將可能型患者歸為非AgP。1.2引物和病毒的合成小量外周血基因組DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)、PCR反應(yīng)相關(guān)試劑(包括TaqDNA聚合酶、dNTP、10×PCRbuffer、2000bpDNAmarker,均來自TaKaRa寶生物工程有限公司)、限制性內(nèi)切酶(TaKaRa寶生物工程有限公司)。用于擴(kuò)增VDR基因的引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成,TaqⅠ序列為:Fw5′CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG3′,Rv5′GCAACTCCTCATGGCTGAGGTCTC3′;FokⅠ序列為:Fw5′AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGGCTCT3′,Rv5′ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC3′。1.3方法1.3.1保存管理表1圖4采取外周靜脈血1mL,加入含EDTA的抗凝管中,4℃保存。采用上述DNA提取試劑盒提取外周血總基因組DNA,測定濃度和純度,D260nm/D280nm在1.8～2.0之間,-20℃保存。1.3.2熱反應(yīng)taq和f濱水重性小體制備聚合式總反應(yīng)體系25μL,其中含模板DNA2ng,引物各10nmol,TaqDNA聚合酶1u,dNTPs各5nmol及相應(yīng)PCR緩沖液,無菌去離子水補(bǔ)足總體積。TaqⅠ反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10min后,進(jìn)行35次循環(huán),循環(huán)條件為:95℃變性30s,65℃復(fù)性30s,72℃延伸60s;最后72℃延伸7min,擴(kuò)增得745bp的產(chǎn)物。FokⅠ反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10min后,進(jìn)行35次循環(huán),循環(huán)條件為:95℃變性30s,65℃復(fù)性30s,72℃延伸60s;最后72℃延伸7min擴(kuò)增得267bp的產(chǎn)物。1.3.3fol制備酶切后fk酶切總體系10μL,其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4μL,相應(yīng)Buffer1μL,0.1%BSA1μL,內(nèi)切酶5u,加無菌去離子水補(bǔ)足總體積,于37℃水浴消化1h。FokⅠ酶切后,等位基因f顯示61bp、206bp2個(gè)片段,等位基因F無酶切位點(diǎn),仍為267bp。TaqⅠ酶切后,等位基因t顯示290、245和205bp3個(gè)片段,等位基因T顯示495和245bp2個(gè)片段。1.3.4凝膠成像分析酶切產(chǎn)物10μL,瓊脂糖凝膠電泳,凝膠含溴化乙錠(ethidiumbromide,EB)替代物GoldViewTM,凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并分析基因型。分型標(biāo)準(zhǔn):FF型為267bp1個(gè)片段,Ff型為267、206、61bp3個(gè)片段,ff型為206、61bp2個(gè)片段;TT型為495、245bp2個(gè)片段,Tt型為290、245、205和495bp4個(gè)片段,tt型為290、245和205bp3個(gè)片段。1.4系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,計(jì)數(shù)資料用百分比表示,分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)對這些資料進(jìn)行各診斷組分布差異的比較?；蚨鄳B(tài)性與AgP臨床表型的關(guān)聯(lián)采用以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)檢驗(yàn)(familybasedassociationtest,FBAT)的方法。應(yīng)用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件是SAS8.0。FBAT方法是以核心家系為單位計(jì)算每個(gè)核心家系數(shù)的基因型的分布概率和統(tǒng)計(jì)量“S”(統(tǒng)計(jì)量S為表型T與基因型X的乘積),然后累加各核心家系的統(tǒng)計(jì)量S及S的方差與協(xié)方差,進(jìn)行卡方檢驗(yàn),該方法適用于家系資料不完全及一些親代表型資料缺失的情況,需要用一定的遺傳模型描述遺傳表型中基因的效應(yīng),本研究分別采用顯性、隱性、加性遺傳模型進(jìn)行檢驗(yàn)。2重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果樣品提取、PCR擴(kuò)增和酶切均獲成功,隨機(jī)抽取10%的樣本(共25個(gè))進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示100%相同?；蛐蜏y定的典型電泳結(jié)果見圖1、2。2.1核心家系研究領(lǐng)域155例血緣親屬中的成員組成為:父親61例,母親51例,同胞43例,屬于核心家系研究。研究對象的基本資料如表1所示,先證者及其親屬的性別比均為女性偏高,先證者中男女性別比為1∶1.91(32/61),同胞中男女比例1∶1.39(18/25)。2.2研究對象的基因型分布研究人群的T和t等位基因頻率分別為94.6%和5.4%。未發(fā)現(xiàn)tt基因型,93個(gè)先證者中Tt基因型共有10人,其中3人父親為Tt基因型,母親為TT基因型,因此先證者的t等位基因來自父親;另外3人父親為Tt基因型,母親未知,但母親是Tt基因型的概率為3.3%(表1),因此t等位基因來自母親的概率小于或等于3.3%,而來自父親的概率大于或等于96.7%;其余4人未知。此外,AgP先證者父親t等位基因頻率顯著高于母親,9.8%vs1.6%,χ2=7.742,P=0.005,其余各親屬組以及先證者TaqⅠ等位基因/基因型的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。研究人群的F和f等位基因頻率分別為57.1%和42.9%。FokⅠ等位基因/基因型在各親屬組以及先證者中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。2.3隱性3種遺傳模型檢驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)VDR基因各位點(diǎn)的多態(tài)性與AgP存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián),即VDRTaqⅠ和FokⅠ各等位基因在加性、顯性及隱性3種遺傳模型的檢驗(yàn)中,P值均大于0.05(表2)。將先證者按性別分組后進(jìn)行VDRFokⅠ位點(diǎn)多態(tài)性的FBAT檢驗(yàn),結(jié)果在加性、顯性及隱性3種遺傳模型的檢驗(yàn)中,差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)把所有AgP患者按照全口牙槽骨吸收特點(diǎn)進(jìn)行亞型分型(分為以局限型破壞為主型和廣泛型兩組)后進(jìn)行FBAT檢驗(yàn),結(jié)果兩組均未發(fā)現(xiàn)VDRFokⅠ基因多態(tài)性與AgP的關(guān)聯(lián)。3vdr基因多態(tài)性與agp關(guān)聯(lián)研究本研究中93例先證者的男女性別比為1∶1.91,存在較明顯的性別差異,可能與其他研究所報(bào)道的因牙齒原因就診的女性多于男性而導(dǎo)致研究對象選擇的偏倚有關(guān),而并非疾病所致。AgP先證者家屬的診斷一直是AgP家系研究的難題,本研究對于AgP先證者家庭成員的診斷,借鑒Hodge等現(xiàn)有檢查與病史回顧性相結(jié)合的評分標(biāo)準(zhǔn)對其牙周破壞狀況作出評估診斷。所有先證者都有全口牙周檢查記錄和X線片的全面診斷,絕大部分親屬也都有X線診斷、全口的牙周檢查記錄大表,在此基礎(chǔ)上結(jié)合病史對其進(jìn)行評分做出評估診斷,最大限度地提高診斷準(zhǔn)確性,使對結(jié)果的影響降到最低。侵襲性牙周炎作為一種多因素疾病,存在一定的家族聚集性,提示個(gè)體的遺傳因素是影響宿主反應(yīng)性的重要因素,所以對于牙周病遺傳因素的研究一直被廣為關(guān)注,而家系研究一直是遺傳學(xué)家及臨床醫(yī)師公認(rèn)的識(shí)別可疑致病因素及異質(zhì)性的最好的研究策略。以往的學(xué)者通過系譜分析、分離分析以及連鎖分析進(jìn)行了AgP遺傳模式的探索和基因定位,結(jié)論不一,主要原因是上述方法對于多基因疾病的檢測能力有限,并且受家系資料完整程度以及家屬診斷的準(zhǔn)確程度影響。復(fù)雜性疾病是多個(gè)微效基因協(xié)同作用并與環(huán)境因素共同導(dǎo)致的疾病,所以對于復(fù)雜性疾病中起微效作用基因的分析現(xiàn)在多傾向于采用效力較高的關(guān)聯(lián)研究。關(guān)聯(lián)研究根據(jù)對照組的不同分為群體關(guān)聯(lián)研究和以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究。群體關(guān)聯(lián)研究(population-basedassociationstudy)是基于群體中無親緣關(guān)系的病例組和表型正常的對照組在某個(gè)遺傳標(biāo)記位點(diǎn)上會(huì)出現(xiàn)不同的頻率,故也稱病例-對照研究(case-control),通過兩者頻率的差異就能推測所研究的遺傳標(biāo)記和某個(gè)遺傳病易感位點(diǎn)之間是否存在關(guān)聯(lián)?？隙ù嬖谶z傳標(biāo)記與疾病關(guān)聯(lián)的解釋可以歸納為兩種:一種是遺傳標(biāo)記位點(diǎn)本身就是疾病位點(diǎn),與多基因遺傳病的發(fā)生有關(guān);另一種是遺傳標(biāo)記位點(diǎn)與疾病發(fā)生無關(guān),但是與致病基因位點(diǎn)存在很強(qiáng)的連鎖不平衡(linkagedisequilibrium)。群體關(guān)聯(lián)易受人群分層的影響,產(chǎn)生假陽性結(jié)果,以家系為基礎(chǔ)的關(guān)聯(lián)研究可以很好的彌補(bǔ)這種不足,排查虛假關(guān)聯(lián)。以往的病例對照研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性可能與AgP有關(guān)聯(lián),但國內(nèi)外均沒有家系研究的結(jié)果對其進(jìn)行證實(shí),本研究的結(jié)果對于VDR基因多態(tài)性與AgP關(guān)聯(lián)的研究起到了驗(yàn)證和排查假陽性結(jié)果的作用。VDRTaqⅠ位點(diǎn)位于VDR基因的第9號(hào)外顯子,該位點(diǎn)的多態(tài)性改變是C/T改變,不影響氨基酸序列,但研究證實(shí)該位點(diǎn)與很多病生理過程有關(guān),例如骨代謝、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長分化凋亡等,因?yàn)樵撐稽c(diǎn)與VDR基因3′端存在較強(qiáng)的連鎖不平衡(linkagedisequilibrium,LD),并且與3′UTR在同一個(gè)單倍體域,該單倍體域長17kb,包括4～9外顯子和3′UTR。以往國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于VDRTaqⅠ位點(diǎn)基因多態(tài)性與AgP關(guān)聯(lián)的病例對照研究提示t等位基因可能與AgP易感性有關(guān)。早在2002年,本課題組孫靖林等關(guān)于中國人群的研究納入了24例成人牙周炎、37例早發(fā)性牙周炎和39例牙周健康者,結(jié)果發(fā)現(xiàn)早發(fā)性牙周炎中Tt基因型的檢出率顯著高于另外兩組。而Nibali2008年關(guān)于高加索人群的研究則提示吸煙組AgP患者TT基因型顯著高于健康對照,而非吸煙組AgP患者與健康對照基因型的分布無顯著差異。由于中國人群的t等位基因頻率低,因此本研究有遺傳信息可以進(jìn)行FBAT檢驗(yàn)的家系較少,只有10家,結(jié)果顯示TaqⅠ位點(diǎn)的多態(tài)性與AgP在3種遺傳模型中不存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián),因此,有必要擴(kuò)大樣本,做進(jìn)一步分析。另外,本研究的結(jié)果VDRTaqⅠ位點(diǎn)等位基因t的頻率