大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)八

大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的

制備與轉(zhuǎn)化1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學(xué)研究中的意義。2.學(xué)習(xí)氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的方法。3.學(xué)習(xí)將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細(xì)胞并篩選轉(zhuǎn)化體的方法。2.實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化(Transformation)是將異源DNA分子引入另一細(xì)胞品系，使受體細(xì)胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的根本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3.轉(zhuǎn)化中的受體細(xì)胞

轉(zhuǎn)化過程所用的受體細(xì)胞一般是限制性修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，常用RM符號(hào)表示。4.實(shí)驗(yàn)原理轉(zhuǎn)化方法：電擊法、CaCl2、RuCl等化學(xué)試劑法感受態(tài)細(xì)胞：的處理后，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源DNA分子通過時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞(轉(zhuǎn)化子)：帶有異源DNA分子的受體細(xì)胞(Transformant)。5.實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)以E.coliDH5α菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。pUC18質(zhì)粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質(zhì)粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用Apr符號(hào)表示。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞經(jīng)過適應(yīng)稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未受轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞那么因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。6.抗Amp宿主細(xì)菌含Amp培養(yǎng)基7.影響轉(zhuǎn)化率的因素細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度。轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度。試劑的質(zhì)量。防止雜菌和其它外源DNA的污染。8.實(shí)驗(yàn)儀器9.超凈工作臺(tái)10.臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)11.恒溫空氣搖床12.恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿13.實(shí)驗(yàn)試劑

大腸桿菌DH5α

LB培養(yǎng)基，

0.1mol/LCaCl2溶液〔預(yù)冷〕

氨芐青霉素pUC18質(zhì)粒14.實(shí)驗(yàn)步驟

菌株活化感受態(tài)細(xì)胞制備外源DNA的轉(zhuǎn)化15.實(shí)驗(yàn)步驟菌株活化用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板外表劃線，于37℃培養(yǎng)16小時(shí)挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到3－5mlLB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時(shí)將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時(shí)，到OD600＝0.3－0.416.實(shí)驗(yàn)步驟感受態(tài)細(xì)胞制備將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min4000rpm離心5min,棄上清參加0.8ml預(yù)冷的0.1mol/lCaCl2,懸浮沉淀，冰上預(yù)冷10min4000rpm離心5min,棄上清參加0.2ml預(yù)冷的0.1mol/lCaCl2,懸浮沉淀，即可使用。也可參加總體積15％的甘油可－70℃長(zhǎng)期保存17.實(shí)驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)化取目的DNA參加大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，于冰上放置30min

于42℃水浴90S冰上放置2min參加800μlLB液體培養(yǎng)基于37培養(yǎng)1小時(shí)將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個(gè)小時(shí)，然后觀察結(jié)果18.對(duì)照組

對(duì)照組1:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。

對(duì)照組2:以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。19.轉(zhuǎn)化率統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。

轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：

轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×轉(zhuǎn)化反響原液總體積／涂板菌液體積

轉(zhuǎn)化頻率〔轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA〕＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA參加量(mg)

感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組２菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×菌液總體積／涂板菌液體積

感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)

20.實(shí)驗(yàn)結(jié)果21.實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫明實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?shí)驗(yàn)原理、儀器、材料與試劑詳細(xì)列出實(shí)驗(yàn)步驟；