《基于皮膚模型化妝品舒緩功效試驗(yàn)方法》征求意見稿

1DB61/T××××—××××基于皮膚模型化妝品舒緩功效試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了一種化妝品舒緩功效測試體外重組表皮模型IL-1α含量測定的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、技術(shù)原理、試驗(yàn)條件、材料與試劑、儀器設(shè)備、試驗(yàn)步驟、試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、結(jié)果判定、以及試驗(yàn)報(bào)告的要求。本文件可作為化妝品舒緩功效測試替代方法之一，也可結(jié)合其他方法對化妝品舒緩功效進(jìn)行評價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅改日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489-2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求SN/T3899—2014化妝品體外替代試驗(yàn)良好細(xì)胞培養(yǎng)和樣品制備規(guī)范SNT3898-2014化妝品體外替代試驗(yàn)方法驗(yàn)證規(guī)程《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》《化妝品功效宣稱評價(jià)規(guī)范》《化妝品分類規(guī)則和分類目錄》3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用本標(biāo)準(zhǔn)。陰性工作液（Negativeworkingfluid）在試驗(yàn)過程中選擇SLS（月桂醇硫酸酯鈉，sodiumlaurylsulfate）作為刺激體外重組表皮模型的刺激物。3.2陽性工作液（Positiveworkingfluid）在試驗(yàn)過程中選擇具有顯著舒緩功效的樣品作為陽性參考，將陽性標(biāo)準(zhǔn)品地塞米松溶于EpiGrowth培養(yǎng)液中，配置成地塞米松陽性工作液。3.3樣品工作液（Sampleworkingfluid）將一定濃度的待測樣品溶于培養(yǎng)基中形成樣品工作液。3.42DB61/T××××—××××ELISA檢測（Enzymelinkedimmunosorbentassay）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的一項(xiàng)定性/定量檢測抗體(抗原)的免疫酶技術(shù)。3.5體外重組表皮模型（Reconstructedhumanepidermismodel）采用人原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，通過組織工程技術(shù)在體外重組的皮膚組織，具有與正常皮膚高度相似的復(fù)層化結(jié)構(gòu)、生理及代謝功能。4技術(shù)原理使用SLS刺激重組表皮模型模擬皮膚刺激性狀態(tài)：刺激物SLS滲進(jìn)活細(xì)胞層，一方面與細(xì)胞表面的受體如胞內(nèi)感應(yīng)受體NLR等發(fā)生相互作用，介導(dǎo)炎癥因子的產(chǎn)生；另一方面誘導(dǎo)角質(zhì)層中儲存的IL-1α釋放，釋放的IL-1α進(jìn)一步激活炎癥相關(guān)的信號通路如核因子κB（NF-κB），介導(dǎo)表達(dá)更多的炎癥因子，從而使得炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大，使皮膚發(fā)生刺激性反應(yīng)。通過ELISA法檢測IL-1α蛋白含量來評價(jià)受試物舒緩功效。5試驗(yàn)條件無菌室的等級達(dá)到十萬級，溫度控制在20～24℃,濕度控制在50%～70%，防震動(dòng)，防電磁干擾。6材料和試劑6.1材料6.1.1重組表皮模型：選用角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的重組皮膚模型注：其他角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)建的重組皮膚模型也可用于本試6.2試劑6.2.1體外重組表皮模型培養(yǎng)液（EpiGrowth培養(yǎng)液）。6.2.2SLS粉末：純度應(yīng)達(dá)到分析純級別。6.2.3磷酸鹽緩沖液（PBS）：0.01M的磷酸鹽緩沖液（含氯化鉀），pH=7.4。6.2.4二甲基亞砜（Dimethylsulfoxide,DMSO）：CAS號：67-68-5；單位：毫升。6.2.5地塞米松粉末:純度應(yīng)達(dá)到分析純級別。6.2.6IL-αELISA試劑盒：檢測范圍應(yīng)達(dá)到0.18-12ng/mL。注：以上試劑可采用相同類型的試劑進(jìn)行替代7儀器設(shè)備7.1超凈工作臺：潔凈度達(dá)到100級。7.2CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：37℃±1℃,5±1%CO2，95%相對濕度。7.3分析天平：精度0.1mg。7.4酶標(biāo)儀：檢測波長范圍200-999nm。7.5-80℃超低溫冰箱：用于收樣培養(yǎng)液凍存。3DB61/T××××—××××7.6移液器：連續(xù)加樣器和相應(yīng)吸頭、M25活塞排代式移液器和相應(yīng)吸頭、2μL~10μL、10μL~100μL、20~200μL、100~1000μL移液器及相應(yīng)吸頭。8樣品8.1體外重組表皮模型的準(zhǔn)備該步驟在超凈工作臺中進(jìn)行。每輪測試中按照實(shí)驗(yàn)分組（空白對照組、陰性對照組、陽性對照組和各待測物組）數(shù)量，每組各準(zhǔn)備1塊6孔板并進(jìn)行標(biāo)記，在每個(gè)6孔板的第一排孔中各加入0.9mLEpiGrowth培養(yǎng)液。每組各3個(gè)體外重組表皮模型，將模型轉(zhuǎn)移至6孔板第一排中，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h（37±1℃、5±1%CO2、95%相對濕度）。8.2液體配置配置陰性工作液：稱取0.024gSLS溶于6mLPBS溶液中，0.22μm過濾，配置成0.4%SLS母液，備用。配置陽性工作液：將地塞米松整瓶置于玻璃皿中開口干燥，105℃干燥2h，干燥后將粉末收集于1.5mL離心管中并稱重，根據(jù)重量按照100mg加1000μLDMSO的量等比例放大，震搖2h，充分混勻得到濃度為100mg/mL濃度的地塞米松母液。配置樣品工作液：需稀釋至相應(yīng)濃度的樣品：根據(jù)樣品濃度，采用0.2%SLS作為溶劑，稀釋樣品至相應(yīng)工作濃度；原液給藥樣品：按照體積比1:1將樣品與濃度為0.4%的SLS渦旋混勻。8.3給藥陰性對照及陽性對照表面涂抹25μL0.2%SLS的工作液；樣品組表面涂抹25μL樣品工作液（含SLS和樣品）。陽性對照組給藥方式為液下給藥，將其母液與培養(yǎng)液混合稀釋后換液；空白對照組、陰性對照組、樣品組更換正常培養(yǎng)基。之后將孔板轉(zhuǎn)移至CO2培養(yǎng)箱中，孵育培養(yǎng)24h（37±1℃、5±1%CO2、95%相對濕度）。8.4收樣24h孵育結(jié)束后，收集培養(yǎng)液儲存于-80℃保存。8.5ELISA檢測IL-1α檢測前提取將樣本從-80℃室溫解凍，按照ELISA檢測說明書進(jìn)行IL-1α檢測。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理9.1IL-1α含量計(jì)算推薦使用專業(yè)制作曲線軟件，以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)，OD450值為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣本的OD450值，查出相應(yīng)的濃度?；蛴脴?biāo)準(zhǔn)品的濃度與OD450值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式。將樣本的OD450值代入方程式，計(jì)算樣本的IL-1α含量。最終取各組3個(gè)復(fù)孔的平均值作為最終的IL-1α結(jié)果。9.2IL-1α抑制率計(jì)算公式4DB61/T××××—××××抑制率（%）=()×100%式中：T—受試物IL-1α含量平均值；C—空白/溶劑對照IL-1α含量平均值。9.3統(tǒng)計(jì)分析各組間采用t-test檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，所有的統(tǒng)計(jì)分析均為雙尾。p<0.05被認(rèn)為具有差異顯著性，其中p<0.05表示為*，p<0.01表示為**，p值越小越顯著。9.4結(jié)果判定以下條件說明待測物具有舒緩功效：對于受試物抑制IL-1α釋放的表述，應(yīng)包含受試濃度。與陰性對照組相比，待測物的IL-1α含量顯著下調(diào)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，說明待測物可以抑制重組皮膚模型釋放IL-1α,具有舒緩功效。10精密度和測量不確定度10.1精密度10.1.1當(dāng)批次實(shí)驗(yàn)中，統(tǒng)計(jì)酶標(biāo)儀測得的每個(gè)組別復(fù)孔間光密度的標(biāo)準(zhǔn)差（StandardDeviation，SD并計(jì)算變異系數(shù)（CoefficientofVariation，C.V），C.V值≤20%。變異系數(shù)（%）=×100%式中：標(biāo)準(zhǔn)差Relativeopticaldensityrate——相對光密度標(biāo)準(zhǔn)差平均值Relativeopticaldensityrate——相對光密度平均值10.1.2每批次試驗(yàn)均需設(shè)置空白對照、陰性對照和陽性對照。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的各種對照應(yīng)符合如下標(biāo)準(zhǔn)。如任一種對照出現(xiàn)非下述標(biāo)準(zhǔn)，則視為質(zhì)控不合格。1）與空白對照組相比，IL-1α含量出現(xiàn)顯著性上調(diào)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2）與陰性對照組相比，陽性對照（地塞米松）組的IL-1α含量顯著下調(diào)且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。10.1.3在相同條件下，經(jīng)過3次以上測試，陽性對照均能檢出IL-1α含量下調(diào)的效果，且與陰性對照相比IL-1α含量下調(diào)率需≥20%，則認(rèn)為試驗(yàn)系統(tǒng)有效。10.2測量不確定度10.2.1進(jìn)行ELISA時(shí)需對待測測上清液進(jìn)行稀釋以確定適當(dāng)稀釋比例，保證檢測數(shù)值落在試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。10.2.2計(jì)算時(shí)應(yīng)對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，剔除數(shù)據(jù)落于平均值±（3×標(biāo)準(zhǔn)差）以外的異常值。11質(zhì)量保證和控制11.1SLS劑量不