編制說(shuō)明+水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測(cè)定+液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（征求意見稿）1

3《水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中地西泮的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》編制說(shuō)明計(jì)劃的通知》（湘市監(jiān)標(biāo)函〔2023〕25），1）的臨床上應(yīng)用主要有抗焦慮、鎮(zhèn)靜、催眠、抗驚厥、抗癲癇及中樞性肌肉松去甲西泮和去甲羥基西泮即奧沙西泮(Ⅰ相代謝物）以及羥基地西泮葡萄糖醛酸苷和去甲羥基地西泮葡萄糖醛酸苷(Ⅱ相代謝物）。代謝物與地西泮具有類似的4圖1地西泮分子結(jié)構(gòu)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政監(jiān)管部門近幾年多省份地區(qū)水產(chǎn)品產(chǎn)地監(jiān)督監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示：淡水養(yǎng)殖魚類中地西泮殘留的現(xiàn)象在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)、活體暫養(yǎng)運(yùn)輸及市場(chǎng)銷售流通環(huán)節(jié)均頻繁出現(xiàn)。結(jié)合淡水養(yǎng)殖環(huán)境中地西泮的污染來(lái)源、風(fēng)險(xiǎn)排查發(fā)現(xiàn)：陽(yáng)性淡水魚樣品養(yǎng)殖環(huán)境中(水質(zhì)、底質(zhì))也同樣存在不同濃度的地西泮殘留，且被抽檢養(yǎng)殖單位采集的部分漁用投入品中地西泮違規(guī)添加濃度達(dá)到幾十個(gè)mg/kg。本檢測(cè)中心為全面分析追蹤和掌握本省漁業(yè)環(huán)境中地西泮污染情況，2020~2022年共采集長(zhǎng)沙、常德、郴州、益陽(yáng)、岳陽(yáng)等主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)域水體和底泥試樣200批次，檢測(cè)結(jié)果顯示：水體地西泮污染水平介于6.05ng/L~487ng/L;底泥樣品中地西泮含量范圍為0.0793分養(yǎng)殖場(chǎng)來(lái)源水也有一定程度的地西泮污染，可能來(lái)源于人類生活污水或生產(chǎn)活2023年湖南省例行監(jiān)測(cè)地西泮風(fēng)險(xiǎn)專項(xiàng)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，有些釣養(yǎng)用途的魚塘養(yǎng)殖環(huán)境、淡水魚中檢出高水平的地西泮殘留，同時(shí)魚肉樣品中也檢出地西泮的代謝物?，F(xiàn)場(chǎng)采集的多種釣魚餌料發(fā)現(xiàn)高濃度地西泮違法添加，初步排查出地西泮通過釣魚者使用的餌料途徑直接被魚攝食或者進(jìn)入魚塘水體、底泥持續(xù)污染養(yǎng)殖環(huán)境。然而，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用違規(guī)添加地西泮作為漁用治療藥物、促生長(zhǎng)飼料等投入品，不僅造成養(yǎng)殖環(huán)境中違禁藥物地西泮的污染，而且影響?zhàn)B殖水產(chǎn)品質(zhì)量安全和養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)安全。如果要合理監(jiān)管和精準(zhǔn)監(jiān)控地西泮違規(guī)用藥情況，除加強(qiáng)監(jiān)控水產(chǎn)動(dòng)物活體中地西泮殘留外，還需加強(qiáng)養(yǎng)殖環(huán)境中地西泮污染溯源和風(fēng)險(xiǎn)排查。因此，亟需建立養(yǎng)殖環(huán)境中地西泮殘留測(cè)定方法。5中多類禁用藥物殘留量檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》；二是飼料中地西泮殘留測(cè)定，2005年9月由農(nóng)業(yè)部發(fā)布的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布的地方標(biāo)準(zhǔn)《DB13/T家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中地西泮和安眠酮多殘留的測(cè)定氣相色譜-6因此，本標(biāo)準(zhǔn)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）結(jié)合固相萃取凈化技術(shù)學(xué)、魚類營(yíng)養(yǎng)、特種水產(chǎn)、漁業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息等專業(yè)。本單位“中心”擁有TripleQuad5500+超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀、ThermoTSQ72023年1~4月標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)下達(dá)后，湖2024年1~2月：標(biāo)準(zhǔn)起草組就征求意8序號(hào)姓名性別職務(wù)從事專業(yè)項(xiàng)目分工1李小玲女高級(jí)農(nóng)藝師水產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目負(fù)責(zé)人、項(xiàng)目總體協(xié)調(diào)安排、修改審查2萬(wàn)譯文男副研究員環(huán)境分析化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)文本編寫、編制說(shuō)明編寫、檢測(cè)方法開發(fā)設(shè)計(jì)及優(yōu)化3楊霄男助理研究員分析化學(xué)項(xiàng)目總體協(xié)調(diào)安排、修改審查4索紋紋女助理研究員分析化學(xué)項(xiàng)目總體協(xié)調(diào)安排、修改審查5謝仲桂男研究員水產(chǎn)品安全監(jiān)管項(xiàng)目總體協(xié)調(diào)安排、修改審查6謝玉昆男初級(jí)研究員分析化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)文本修改7何詠女助理研究員分析化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)文本修改8陳湘藝女助理研究員環(huán)境工程標(biāo)準(zhǔn)文本編寫9女助理研究員分析化學(xué)征求意見匯總女高級(jí)工程師水產(chǎn)養(yǎng)殖征求意見匯總黃向榮男研究員水產(chǎn)養(yǎng)殖項(xiàng)目總體協(xié)調(diào)安排、修改審查9據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中地西泮標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制方法，參照SN/T3235-2012標(biāo)準(zhǔn)溶液的由于地西泮含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，極性較小，采用反相C18色譜柱能夠獲得良好使用核殼制備工藝的KinetexC18色譜柱基礎(chǔ)背壓底、背景峰信號(hào)干擾少、分離為有機(jī)相，分別與水、5mM乙酸銨溶液及0.1%甲酸-水溶液等組成流動(dòng)相體系），為獲得藥物準(zhǔn)確定性和提高檢測(cè)方法靈敏度，用甲醇稀釋的0.1mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液直接泵入電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式一級(jí)質(zhì)譜全掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正離子模式響應(yīng)值明顯優(yōu)于負(fù)離子掃描模式，各目標(biāo)物豐度最高的準(zhǔn)分子離子均為[M+H]+離子。地西泮和地西泮-Ds的準(zhǔn)分子離子峰分別是質(zhì)荷比m/z285和m/z290。手動(dòng)調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、離子源溫度及脫溶劑氣量等參數(shù)，對(duì)上述準(zhǔn)分子離子誘導(dǎo)碰撞解離，為每種化合物選擇兩個(gè)特征性的碎片離子，與母離子組成MRM離子對(duì)，用于目標(biāo)藥物的定性和定量分析。質(zhì)譜條件：離子源：電噴霧電離(ESI);掃描模式：正離子掃描；分辨率：?jiǎn)挝环直媛剩浑x子源溫度：150℃;去溶劑氣溫度：400℃;毛細(xì)管電壓：3.0kV;）；吸附效率/%吸附效率/%3.2.1固相萃取柱的選擇根據(jù)藥物理化性質(zhì)和文獻(xiàn)報(bào)道的固相萃取柱，本實(shí)驗(yàn)比較了MCX(150mg,150mg裝填量MCX和HLB小柱對(duì)加標(biāo)水樣中藥物的絕對(duì)吸附效率均超過了90%以上，如圖3所示，吸附保留效果穩(wěn)定，目標(biāo)物流出率低，都能滿足水體中SPE小柱圖3固相萃取小柱對(duì)目標(biāo)物的回收率HLB小柱雖然對(duì)藥物有很好的保留，缺點(diǎn)是淋洗液中甲醇已經(jīng)含量很低，均未發(fā)現(xiàn)藥物有漏出。1%甲酸水溶液淋洗小柱時(shí)，能質(zhì)子化藥物使得保留作用甲醇乙腈二氯甲烷丙酮3.2.3洗脫劑用量的選擇進(jìn)一步研究了5%氨水-乙腈溶液的洗脫效率，第1mL的洗脫過程中藥物幾乎未流出，洗脫回收率小于3.94%。小柱上90%以上的藥物洗脫過程都出現(xiàn)在第2mL和第3mL,第4mL的洗脫回收率均低于6.4%。為保證藥物的充分回收和3.3底泥樣品提取條件的優(yōu)化取率高于94.6%。1%氨水-乙酸乙酯提取液不適合直接上小柱凈化，需要濃縮后圖4不同溶劑的提取回收率的準(zhǔn)確度和精密度發(fā)生改變的現(xiàn)象[27]?；|(zhì)效應(yīng)是LC-MS/MS分影響，會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度產(chǎn)生很大影響。因此，在建立LC-MS/MS分析方法時(shí)應(yīng)評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，并采用適當(dāng)?shù)姆椒ń档突蜓a(bǔ)償基質(zhì)效式。本研究采用離子抑制率對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，即ME=過考察研究沉積物提取液中藥物MCXSPE凈化前后的基質(zhì)效應(yīng)（ME），結(jié)果化的提取液中所有藥物都表現(xiàn)出明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME為41%~75%。經(jīng)優(yōu)提取液中藥物基質(zhì)抑制效應(yīng)的影響明顯改善，ME為82%~99%提取溶劑地西泮1%甲酸1%氨水1%甲酸1%氨水1%甲酸-乙酸乙酯1%氨水-乙酸乙酯乙酸乙酯未凈化464843555347625351MCX凈化7773787977769398b—空白樣品(或接近空白的），空白測(cè)試魚塘養(yǎng)殖水體試樣中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使加標(biāo)濃度分別為2.0ng/L、20ng/L和50ng/L,每個(gè)加標(biāo)水平測(cè)試6平行，各加標(biāo)樣品中加入濃度為10ng混合內(nèi)標(biāo)物，按照優(yōu)化的步驟處理和測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果表明，在3個(gè)加標(biāo)水平下的平均回收率范圍為100%~105%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表6)。表6魚塘養(yǎng)殖水樣中加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)化合物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(2)底泥樣品采集空白養(yǎng)殖池塘底泥作為測(cè)試樣品，準(zhǔn)確稱取5.00g底泥樣品，待測(cè)樣品加標(biāo)水平測(cè)試6平行，各加標(biāo)樣品中加入濃度為10ng混合內(nèi)標(biāo)物，按照建議稿優(yōu)化的步驟處理和測(cè)定底泥加標(biāo)樣品。結(jié)果顯示，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率范圍為99.2%~101%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為5.1%~8.2%(見表7)。表7底泥中加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差化合物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差地西泮00圖6空白水樣特征離子質(zhì)量色譜圖圖7空白水樣添加樣品(0.005μg/L)的特征離子質(zhì)量色譜圖Diazepam-ds(290.1/100圖8空白泥樣特征離子質(zhì)量色譜圖圖9空白泥樣添加樣品(0.1μg/kg)的特征離子質(zhì)量色譜圖長(zhǎng)沙市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心四家相關(guān)領(lǐng)域且具備檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定資質(zhì)的限均能符合本標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定值，不同基質(zhì)樣品加標(biāo)的回收率范圍為本標(biāo)準(zhǔn)建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中地西泮的[1]李存，皇甫偉國(guó)，楊挺，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定豬尿中10種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留量[J].分析化學(xué)，2010，38(7):1015-1018.[2]DekoskyST,WilliamsonJB.Thelongandtheshortofbenzodiazepinesandsleepmedications:short-termbenefits,long-termharms[J].Neurotherapeutics,2020,17(1):153-155.[3]TakaiY,TokusumiH,SatoM,etal.Combinedeffectofdiazepamandpolystyrenemicroplasticsonthesocialbehaviorofmedaka(Oryziaslatipes)[J].Chemosphere,2022,299134403.[4]LiuY,SuC,ZhangYY,etal.High-throughputandtraceanalysisofdiazepaminplasmausingDART-MS/MSanditspharmacokineticapplication[J].AnalBiochem,2021,635(15):114435.[5]張祖維，李木子，李雪蓮，等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定豬尿液中地西泮及其7種代謝物殘留[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2021，38(3):112-118.[6]DeSC,TallaricoM,PisanoM,etal.Liraglutidechronicteatmentpreventsdevelopmentoftolerancetoantiseizureeffectsofdiazepamingeneticallyepilepsypronerats[J].EurJPharmacol,2022,928(5):175098.[7]WuM,QiuX,ChenC,etal.ShorttermandpersistentimpactsofsublethalexposuretodiazepamonbehavioraltraitsandbrainGABAlevelsinjuvenilezebrafish(Daniorerio)[J].SciTotalEnviron,2020,740(20):140392.[8]王旭峰，王強(qiáng)，張英俠，等.固相萃取凈化/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖環(huán)境中地西泮及其代謝物[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2023，42(3):337-343.[9]桑麗雅，陳笑笑，王楊，等.基于免疫磁珠的膠體金免疫層析法快速檢測(cè)水產(chǎn)品中地西泮殘留[J].食品工業(yè)科技，2020，41(20):255-284.[10]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于監(jiān)督抽查發(fā)現(xiàn)的27批次問題農(nóng)產(chǎn)品/xw/bmdt/202207/t20220713_6404619.htm.[11]萬(wàn)宇平，吳小勝，臧永軍，等.飼料中地西泮殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒研制[J].貴州畜牧獸醫(yī)，2018，42(6):1-4.[12]張玉潔，張素霞，程林麗，等.GC-μECD法快速檢測(cè)豬肉地西泮殘留[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(18):8316-8317.[13]譚貴良，趙天珍，王文林，等.氣相色譜質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定臘腸中7種鎮(zhèn)靜劑類藥物殘留[J].現(xiàn)代食品科技，2014，30(2):274-278.[14]SruthiA,TejaswiP,ThanujaN,etal.SimpleRP-HPLCmethodforestimationofdiazepamintabletdosageform[J].JournalofPharmacyResearch,2013,6(1):140-144.[15]魏晉梅，羅玉柱，白云旭.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定羊肉中11種鎮(zhèn)靜劑類藥物[J].食品工業(yè)科技，2014，35(10):95-97.[16]于慧娟，錢蓓蕾，黃冬梅，等.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大菱鲆和鱖魚體中地西泮及其代謝物殘留的研究[J].中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2011，1(1):54-59.[17]OrfanidisA,GikaH,MastrogianniO,etal.DetermiantionofdrugsofabuseandpharmaceuticalsinskeletaltissuebyUHPLC-MS/MS[J].ForensicScienceInternational,2018,290:137-145.[18]張爍，周爽，陳達(dá)煒，等.畜肉中10種鎮(zhèn)靜劑殘留的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33(11):1213-1218.[19]馮靜,鄒淼,陳曦，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)