一氧化氮與催產(chǎn)素在大鼠下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中的作用

一氧化氮與催產(chǎn)素在大鼠下丘腦神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)中的作用

廣泛深入地研究了大細(xì)胞內(nèi)收率（ot）免疫陽(yáng)性因子的分布以及纖維投影。這些研究成果為進(jìn)一步研究腦癱神經(jīng)垂體的分泌調(diào)節(jié)機(jī)制提供了詳細(xì)的力學(xué)數(shù)據(jù)。近十年來(lái)的研究證實(shí),一氧化氮合酶(NOS)陽(yáng)性神經(jīng)元在腦內(nèi)分布十分廣泛,合成與釋放的一氧化氮(NO)作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì)與氣體信息分子,具有極強(qiáng)的彌散性與滲透作用,可通過(guò)非突觸方式發(fā)揮信息傳遞作用,從而在一定程度上改變了傳統(tǒng)的神經(jīng)遞質(zhì)突觸聯(lián)系進(jìn)行信息傳遞的作用方式。因此進(jìn)一步研究NO與其它神經(jīng)遞質(zhì)相互的分布范圍與共存關(guān)系,對(duì)構(gòu)建新型神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)學(xué)說(shuō)有著重要意義。本文詳細(xì)觀察了下丘腦大細(xì)胞分泌系統(tǒng)中一氧化氮合酶陽(yáng)性神經(jīng)元與催產(chǎn)素免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的分布與共存情況。為闡明有關(guān)NO、OT參與下丘腦對(duì)生殖與性行為的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制提供了基本的形態(tài)學(xué)證據(jù)。1在免疫組化染色中的表達(dá)雌雄兩性SD大鼠8只,體重180～250g。按常規(guī)免疫組織化學(xué)方法灌注、取材,將含下丘腦的組織塊行恒冷箱冠狀連續(xù)切片(厚15μm),分3組貼片(1)黃遞酶(NADPH-d)組織化學(xué)染色組;(2)NADPH-d+OT雙標(biāo)染色組;(3)OT免疫組織化學(xué)染色組。染色:(1)與(2)組切片加入反應(yīng)液37℃避光孵育45min,反應(yīng)液的組成:0.1MPBS,pH8.0,含0.3%TirtonX-100,0.6mg/ml硝基四氮唑藍(lán)(NBT,南京建成生物試劑公司),0.5mg/mlNADPH-d(Sigma產(chǎn)品),反應(yīng)后用pH7.4的PBS充分漂洗。(2)與(3)組一同進(jìn)行OT免疫組織化學(xué)反應(yīng):切片經(jīng)正常羊血清(1∶200)處理30min后入第一級(jí)兔抗OT血清(1∶1000)(Sigma產(chǎn)品)4℃孵育72h,經(jīng)PBS漂洗,行ABC(Vector產(chǎn)品)免疫反應(yīng),DAB/H2O2溶液(0.05%/0.01%)室溫孵育約15min,再經(jīng)PBS漂洗終止反應(yīng)。對(duì)上述切片脫水、透明、封片、光鏡觀察、計(jì)數(shù)、攝片。對(duì)照試驗(yàn),另取一只鼠腦冠狀連續(xù)切片分4組分別作以下反應(yīng)。(1)抗蟲(chóng)試驗(yàn)①空白試驗(yàn):分別省去兩套染色中的NADPH-d、兔抗OT血清,分別孵育切片。②置換試驗(yàn):用正常兔血清代替第2套染色中的兔抗OT血清。(2)dab/h0的染色步驟在第1套染色程序結(jié)束后,切片經(jīng)PBS漂洗,洗后直接進(jìn)行第2套染色程序中的DAB/H2O2呈色步驟,證實(shí)在第1套染色程序后是否有殘余的NADPH-d、NBT與第2套程序中的DAB反應(yīng)而導(dǎo)致反應(yīng)產(chǎn)物混雜。2雙標(biāo)神經(jīng)元的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)下丘腦大細(xì)胞分泌系統(tǒng)各核團(tuán)內(nèi)的OT神經(jīng)元的分布已有文獻(xiàn)報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似,不作重復(fù)敘述;我們既往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦已詳細(xì)的報(bào)道了下丘腦各核團(tuán)NOS神經(jīng)元分布與形態(tài)。本實(shí)驗(yàn)著重觀察下丘腦大細(xì)胞分泌系統(tǒng)中NOS與OT分布相互關(guān)系及其共存情況。雙標(biāo)染色結(jié)果顯示下丘腦大細(xì)胞分泌系統(tǒng)各核團(tuán)中均含有三種陽(yáng)性標(biāo)記神經(jīng)元:紫藍(lán)色的NOS單標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元,呈棕黃色的OT單標(biāo)記免疫陽(yáng)性神經(jīng)元,細(xì)胞核周圍的胞質(zhì)呈棕黃色、外周的細(xì)胞質(zhì)與突起呈紫藍(lán)色的NOS/OT雙標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元。上述三種陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞數(shù)目及比例關(guān)系在各核團(tuán)存在一定的差異,具體分布與形態(tài)如下:室旁核(PVN):NOS/OT雙標(biāo)神經(jīng)元的胞體呈圓形或橢圓形,突起為雙極或單極,多呈背外腹內(nèi)向,集中分布于PVN的外側(cè)大細(xì)胞部,內(nèi)側(cè)部偶見(jiàn),但在靠近第三腦室處,亦見(jiàn)少許嵌于室管膜細(xì)胞之間呈倒置梨形的大型雙標(biāo)神經(jīng)元(圖1,2)。對(duì)4套染色最佳的雙標(biāo)的切片PVN主部平面三種陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),結(jié)果顯示:雙標(biāo)神經(jīng)元約占72.3%;OT單標(biāo)記神經(jīng)元約占8.6%,散在分布PVN的外側(cè)部;NOS單標(biāo)記神經(jīng)元約占19.1%,一部分為大細(xì)胞型NOS神經(jīng)元(胞體平均直徑≥20μm),集中分布于PVN的外側(cè)部的腹側(cè),突起較長(zhǎng),相互交,另一部分為散在分布于內(nèi)側(cè)部的小細(xì)胞型NOS神經(jīng)元(胞體平均直徑≤10μm)(圖2)。視上核(SON):NOS/OT雙標(biāo)神經(jīng)元的胞體多為圓形和卵圓形,少數(shù)呈梭形,突起短小,胞體直徑一般都較PVN內(nèi)的雙標(biāo)神經(jīng)元大。在SON主部NOS-OT雙標(biāo)神經(jīng)元多位于背內(nèi)側(cè)部(圖3);SON交叉后部,雙標(biāo)神經(jīng)元呈薄帶狀位于下丘腦的腹側(cè)邊緣,直至正中隆起平面。對(duì)4套染色最佳的雙標(biāo)的切片SON主要平面的三種陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù),結(jié)果顯示:雙標(biāo)神經(jīng)元約占64.2%;OT單標(biāo)記神經(jīng)元約占28.7%,集中分布SON的腹側(cè)部;NOS單標(biāo)記神經(jīng)元約占7.1%。室周部(Pe):在視前區(qū)至PVN后大細(xì)胞亞核平面的第三腦室鄰近區(qū)域可見(jiàn)三種類型的陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞,其中絕大部分為NOS/OT雙標(biāo)神經(jīng)元,極少部分為OT、NOS單標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元(圖1,4,5)。NOS/OT雙標(biāo)神經(jīng)元,大部分胞體直徑較大,呈倒置梨形或多角形、嵌入室管膜或于室管膜下層排列,突起伸向室腔(圖5);少部分為棱形細(xì)胞,較小,位于室管膜下層或距室管膜一定距離(圖1)。下丘腦前區(qū):環(huán)狀核(NC)有少量NOS/OT雙標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元。下丘腦外側(cè)區(qū)(LPO):有數(shù)十個(gè)NOS/OT雙標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元,與小型NOS單標(biāo)記陽(yáng)性神經(jīng)元交錯(cuò)分布(圖3)。穹窿周核:穹窿前核(AFN)、穹窿后核(PFN)均有少量NOS-OT、NOS-AVP雙標(biāo)陽(yáng)性神經(jīng)元。對(duì)照試驗(yàn)分別省去NADPH-d、兔抗OT血清,不出現(xiàn)相應(yīng)的染色陽(yáng)性結(jié)果。用正常兔血清代替第2套染色中的兔抗OT血清,也不出現(xiàn)陽(yáng)性免疫反應(yīng),表明本實(shí)驗(yàn)無(wú)抗體交叉反應(yīng)存在。呈色混合試驗(yàn)陰性,表明兩套反應(yīng)程序之間互相不干擾,具有一定的特異性。3nos/ot觸液神經(jīng)元/運(yùn)動(dòng)能力pvn本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NOS與OT在下丘腦大神經(jīng)分泌系統(tǒng)內(nèi)的分布基本一致,并部分共存。NOS/OT雙標(biāo)記神經(jīng)元以PVN、SON為最多,在其它各神經(jīng)分泌副核亦有所分布。提示下丘腦大神經(jīng)分泌系統(tǒng)內(nèi)NO與OT的關(guān)系密切。生理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NO參與調(diào)節(jié)OT的合成與分泌;亦有文獻(xiàn)報(bào)道OT可以間接調(diào)節(jié)NO的釋放,如對(duì)下丘腦移植塊進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)OT、谷氨酸可激活底丘腦內(nèi)側(cè)區(qū)去甲腎上腺素能神經(jīng)元,后者經(jīng)α受體激活NOS神經(jīng)元,細(xì)胞內(nèi)游離鈣增加,與鈣調(diào)素結(jié)合,最終導(dǎo)致NO釋放,滲入鄰近的促性腺激素釋放激素(GnRH)神經(jīng)元細(xì)胞體或終未,再激活GnRH可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和環(huán)氧化酶介導(dǎo)GnRH的分泌與釋放。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果從形態(tài)學(xué)上支持了上述學(xué)者的研究結(jié)論。但是PVN與SON內(nèi)三種陽(yáng)性細(xì)胞的比例仍有所差異:雙標(biāo)神經(jīng)元:72.3%(VPN)、64.2%(SON);OT單標(biāo)記神經(jīng)元:8.6%(PVN)、28.7%(SON);NOS單標(biāo)記神經(jīng)元19.1%、7.1%(SON)。兩者共存率的差異主要是由于以下兩方面的因素造成的:PVN腹內(nèi)側(cè)部的有較集中的大細(xì)胞型NOS單標(biāo)記神經(jīng)元;而SON的腹側(cè)部亦有較集中OT單標(biāo)記神經(jīng)元。這一差異提示NO對(duì)PV懶情SON內(nèi)OT的合成與分泌的調(diào)節(jié)作用可能存在一定的差異。另外,本實(shí)驗(yàn)觀察到第三腦室室周區(qū)的室管膜下層或室管膜內(nèi)有NOS/OT雙標(biāo)記陽(yáng)性觸液神經(jīng)元分布。腦脊液與腦組織之間不存在血腦屏障,NO等可溶性氣體較易透過(guò)腦-腦脊液屏障發(fā)揮信息傳遞作用。故NOS/OT神經(jīng)元在腦與腦脊液神經(jīng)體液回路中可起“信息中轉(zhuǎn)站”作用。推測(cè)其作用信息交換方式包括接收與分泌兩方面,一方面能感受腦脊液與周圍環(huán)境中化學(xué)成分的變化;另一方面又可能分泌NO、OT入腦室,并對(duì)其鄰近細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。如向第三腦室注射左旋精氨酸(L-arg,NO供體),可促進(jìn)大鼠陰莖勃起、增加射精頻數(shù)與精子數(shù)目,而注射NOS抑制劑NG-L-精氨酸甲酯(L-NAME)則可逆轉(zhuǎn)上述