蛋白質及氨基酸的顯色反應

實驗二、蛋白質及氨基酸

的顯色反響1.實驗二、蛋白質及氨基酸的顯色反響目的和要求

1.學習和了解常用的幾種鑒定蛋白質與氨基酸的方法。2.進一步認識氨基酸是蛋白質的根本組成單位。2.Ⅰ、雙縮脲反響(Biureareaction)原理:雙縮脲反響:在堿性條件下，雙縮脲與二價銅離子作用，生成紫紅色配合物的反響。當加熱至180℃左右時，兩分子尿素縮合脫去一分子氨，生成雙縮脲。在肽和蛋白質分子中具有肽鍵，其結構與雙縮脲類似，也能發(fā)生此反響，生成藍紫色或紫紅色的配合物。該反響常用于蛋白質的定性或定量測定。此反響所產生顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關。3.紫紅色銅雙縮脲復合物分子結構為：4.操作步驟一、取少量尿素結晶，放入枯燥試管中，用微火加熱使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時，停止加熱，尿素放出氨，形成雙縮脲。冷卻后，加10%NaOH溶液約1mL，振蕩混勻，再參加1%CuSO４溶液1滴，振蕩之。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色?！卜乐固砑舆^量硫酸銅，生成的藍色氫氧化銅能掩蓋粉紅色〕。二、取另一支試管，加1mL蛋白質溶液和10%氫氧化鈉溶液2mL，搖勻，再加1%硫酸銅溶液兩滴，隨加隨搖，觀察紫玫瑰色的出現(xiàn)。5.Ⅱ、茚三酮反響(Ninhydrinreaction)原理:除脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反響生成黃色物質外，所有的α-氨基酸及一切蛋白質都能和茚三酮反響生成藍紫色物質。該反響分兩步進行，首先是氨基酸被氧化，產生CO２、NH3和醛，而水合茚三酮被復原成復原型茚三酮；第二步是所生成之復原型茚三酮與另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。

6.Ⅱ、茚三酮反響(Ninhydrinreaction)此反響的適宜pH為5-7，同一濃度的蛋白質或氨基酸在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時甚至不顯色。該反響十分靈敏，1：1500000濃度的氨基酸水溶液即能顯示反響，因此是一種常用的氨基酸定量方法。7.操作步驟一、取2支試管分別參加蛋白質溶液和0.5%甘氨酸溶液1mL，再加0.5mL0.1%茚三酮水溶液混勻，在沸水浴中加熱1~2min，觀察顏色由粉色變成紫紅色再變藍。二、在一小片濾紙上滴上一滴0.5%的甘氨酸溶液，風干后，再在原處滴0.1%的茚三酮乙醇溶液一滴，在微火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點的出現(xiàn)。8.Ⅲ、黃色反響(Xanthoproteicreaction)原理但凡含有苯環(huán)的化合物都能與濃硝酸作用產生黃色的硝基苯衍生物。該化合物在堿性溶液中進一步轉化成深橙色的硝醌酸鈉。在蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基易發(fā)生上述反響，而苯丙氨酸不易硝化，需加少量濃硫酸催化才能呈明顯的正反響。皮膚、指甲、頭發(fā)等遇濃硝酸變黃即為這一反響的結果。9.操作步驟:一、取一支試管加4滴0.5%苯酚溶液，再加濃硝酸2滴，觀察黃色出現(xiàn)，冷卻后逐滴參加10%氫氧化鈉溶液，觀察顏色轉變?yōu)槌?。二、取一支試管加蛋白質溶液4滴及濃硝酸2滴，由于強酸的作用，開始蛋白質形成白色沉淀，小火加熱，那么沉淀變?yōu)辄S色，冷卻之，逐滴參加10%氫氧化鈉溶液，顏色由黃色轉變成深橙黃色。三、剪少許指甲或頭發(fā)放入試管中，參加數滴濃硝酸，觀察顏色變化。10.管號1234材料0.5％苯酚雞蛋清液指甲頭發(fā)量（滴)44少許少許濃硝酸（滴）422020現(xiàn)象加入NaOH后現(xiàn)象變化黃色反響11.Ⅳ、坂口反響(Sakaguchireaction)原理在次溴酸鈉或次氯酸鈉存在的條件下，許多含有胍基的化合物(如胍乙酸、甲胍、胍基丁胺等)能與α-萘酚發(fā)生反響生成紅色物質。在20種氨基酸中唯有精氨酸含有胍基，所以只有它呈正反響。12.Ⅳ、坂口反響(Sakaguchireaction)生成的氨被次溴酸鈉或次氯酸鈉氧化生成氮。該反響中過量的次溴酸鈉或次氯酸鈉是不利的，因其能進一步緩慢氧化，使產物破裂分解，引起顏色消失。但參加適量尿素可破壞過量的次溴酸鈉。酪氨酸、色氨酸和組氨酸也能降低產生顏色的強度。甚至會阻止顏色的生成。該反響靈敏度達1：250000。因此常用于定量測定精氨酸的含量和定性鑒定含有精氨酸的蛋白質。13.操作步驟取2支試管，分別參加1mL0.3%精氨酸溶液和蛋白溶液，各加20%氫氧化鈉溶液5滴，1%α-萘酚酒精溶液2滴，次氯酸鈉溶液6滴，搖勻，放置片刻，觀察出現(xiàn)的顏色。14.試劑（滴）管號H2O0.3％精氨酸蛋白質溶液20％NaOHα－萘酚NaClO現(xiàn)象記錄１005536２050536３500536坂口反響15.Ⅴ、乙醛酸反響(Adamkiewica-Hopkins-Colereaction)原理在濃硫酸存在下，色氨酸與乙醛酸反響生成紫色物質，色氨酸在濃硫酸中與一些醛類反響也形成有色物質。很多人用含有少量醛雜質的冰醋酸或芳香醛等進行此反響。硝酸根、亞硝酸根、氯酸根及過多的氯離子均能阻礙此反響，有微量硫酸銅或Fe３＋離子存在時，可以加強色氨酸的陽性反響。16.操作步驟

向試管中加數滴蛋白質溶液，再加冰醋酸(常含有少量乙醛酸或醛類)約1mL并混勻傾斜試管，謹慎地沿著管壁加濃硫酸(AR)約1mL，使其重迭，且勿搖勻。靜置后，觀察在兩液界面上出現(xiàn)的紅紫色環(huán)，于水浴中微熱，可加快色環(huán)形成。17.

試劑（滴）管號白明膠0.3％色氨酸（滴）蛋白質溶液（滴）冰醋酸（ml）濃硫酸（ml）現(xiàn)象記錄151125113511乙醛酸反響18.Ⅵ、偶氮反響(Azoreaction)原理偶氮化合物(Ehrlich氏偶氮試劑)與酚核或咪唑環(huán)結合產生有色物質。它與酪氨酸和組氨酸反響的產物分別為紅色和櫻桃紅色.含有酪氨酸和組氨酸的蛋白質也有此反響。19.操作步驟取2支試管，分別參加0.3%組氨酸溶液和純雞蛋清各4滴，再各參加新配制的重氮試劑8滴搖勻，參加2滴20%氫氧化鈉溶液，再搖勻。過幾分鐘，觀察顏色的形成，一般出現(xiàn)櫻桃紅色。20.

試劑（滴）管號0.3％組氨酸（滴）雞蛋清（滴）偶氮試劑20％NaOH溶液現(xiàn)象記錄14822482偶氮反響21.反應名稱反應基團反應產物及現(xiàn)象用途1、雙縮脲反應肽鍵Cu–Cu—雙縮脲絡合物（蘭紫色）測蛋白質含量鑒定蛋白質水解是否完全2、茚三酮反應α-氨基酸蘭紫色測AA含量檢驗AA及蛋白質3、黃色反應苯環(huán)、Trp、Tyr黃色硝醌酸生成鑒定Trp、Tyr4、坂口反應胍基玫瑰紅色產物生成鑒定Arg測定Arg含量5、乙醛酸反應吲哚環(huán)中間生成蘭紫色環(huán)鑒定Trp6、偶氮反應酚核、咪唑基有橙色和鮮紅色產物生成鑒定His、Tyr22.試劑和器材

一、試劑

1.蛋白質溶液：取5mL蛋清，用蒸餾水稀釋至100mL，攪拌均勻后，用紗布過濾。2.0.1%茚三酮乙醇溶液：稱取0.1g茚三酮，溶于100mL95%乙醇。臨用前配制。3.尿素粉末4.1%硫酸銅溶液5.10%氫氧化鈉溶液和20%氫氧化鈉溶液6.0.5%苯酚溶液23.7.濃硝酸和濃硫酸(A.R.)8.0.1%茚三酮水溶液9.0.3%精氨酸、0.3%組氨酸、0.5%甘氨酸10.純雞蛋清11.1%α-萘酚乙醇溶液，臨用時配制12.冰乙酸13.次氯酸鈉溶液14.Ehrlich氏重氮試劑：溶液A：溶解5g亞硝酸鈉于1000mL水中。溶液B：溶解5g對氨基苯磺酸于1000mL水中。溶解后，再參加5mL濃硫酸。A、B溶液分別保存于密閉瓶內。需用時，以1：1的比例混合。24.二、器材1.試管及試管架2.水浴鍋3.酒精燈4.濾紙片5.烘箱6.量筒〔10ml〕25.實驗本卷須知：1、本次實驗內容