細(xì)胞基本培養(yǎng)技術(shù)常規(guī)培養(yǎng)

八、常規(guī)組織培養(yǎng)法

消化培養(yǎng)法組織塊培養(yǎng)法1整理ppt1．消化培養(yǎng)法【用品】取自人或動(dòng)物體的新鮮組織1～5cm3Hanks液100ml胰蛋白酶(O.025％)50～100ml培養(yǎng)液(含血清10％～20％)50ml吸管(直頭)和膠帽各10個(gè)平皿(直徑6厘米)4套培養(yǎng)瓶假設(shè)干2整理ppt燒杯(50m1)2個(gè)電磁攪拌器1個(gè)三角燒瓶(100m1)1個(gè)不銹鋼篩(20μm、100μm、200μm)各1個(gè)眼科剪2把眼科鑷2個(gè)計(jì)數(shù)板1塊3整理ppt【步驟】(1)準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面，紫外線(xiàn)消毒20分鐘；注意：組織塊、胰蛋白酶、培養(yǎng)液等易受紫外線(xiàn)傷害的物品，最好在培養(yǎng)時(shí)再攜入操作野；如預(yù)先置入，需用紙張覆蓋，以免受射線(xiàn)影響；開(kāi)始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部；(2)布局：點(diǎn)燃酒精燈(或煤氣燈)，安裝吸管帽(應(yīng)通過(guò)火焰)；4整理ppt(3)處理組織：把組織塊置入燒杯中，用Hanks液漂洗2～3次，去除血污；如疑心組織可能污染，可先置于含有青鏈霉素的混合液中30～60分鐘；(4)剪切：用眼科剪把組織塊切成2～3毫米大小的塊(用手術(shù)刀切割亦可)，以便于消化；參加比組織塊總量多30～50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角燒瓶中，結(jié)扎瓶口或塞以膠塞；5整理ppt(5)消化：或用恒溫水浴，或置)37~C溫箱消化均可，消化中每隔20分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次，如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨?消化前瓶中需置一無(wú)菌攪棒)；消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定。6整理ppt(6)別離：在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí)，．可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察，如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，立即終止消化，隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩，濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊(必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化)；低速(500～1000轉(zhuǎn)／分)離心消化液5分鐘，吸出上清，參加適量含有血清的培養(yǎng)液(如用其它酶或EDTA等消化，需用Hanks液洗脫一兩次后，再參加培養(yǎng)液)；7整理ppt(7)計(jì)數(shù)：用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大，再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后，分裝入培養(yǎng)瓶中；對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，pH要求在7．2～7．4范圍，培養(yǎng)液呈微紅色，如顏色偏黃，說(shuō)明液體變酸，可用NaHCO3調(diào)整；8整理ppt(8)培養(yǎng)：置入37~C溫箱培養(yǎng)；如用CO2溫箱培養(yǎng)，瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞，紗布塞易生霉菌，每次換液時(shí)需更換新塞。評(píng)價(jià)：胰蛋白酶消化培養(yǎng)法，能把組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞，便于細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物，細(xì)胞能較快地長(zhǎng)成單層。本法尤適用于培養(yǎng)大量組織，細(xì)胞產(chǎn)量高；但用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣，無(wú)菌操作不良時(shí)且易污染。9整理ppt10整理ppt組織塊培養(yǎng)法

【用品】取自人或動(dòng)物體的新鮮組織1～5cm3Hanks液100mlNaHC032ml胰蛋白酶(O.025%)50～100ml培養(yǎng)液(含血清10％～20％)50ml吸管(彎頭和直頭)和膠帽各10個(gè)培養(yǎng)瓶假設(shè)干燒杯(20m1)或青霉素小瓶各1個(gè)眼科剪2把眼科鑷2把11整理ppt【程序】(1)剪切：把組織小塊(1cm3)置入小燒杯或青霉素小瓶中，用Hanks液漂洗2～3次以去掉外表血污，吸凈Hanks液，用眼科剪反復(fù)剪切成lmm3塊為止；(2)擺布：用彎頭吸管吸取假設(shè)干小塊，置入培養(yǎng)瓶中；用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上，小塊相互距離為0.5cm為宜，每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20～30塊；12整理ppt(3)輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，令瓶底向上；注意翻瓶時(shí)勿令組織小塊流動(dòng)，塞好瓶塞，置37℃溫箱2小時(shí)左右(勿超過(guò)4小時(shí))，使小塊微干涸13整理ppt(4)培養(yǎng)：從溫箱中取出培養(yǎng)瓶，開(kāi)塞，46度斜持培養(yǎng)瓶(瓶底仍向上)，向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液少許，然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊(組織小塊附著尚不牢，注意不要把組織塊沖走)；置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后，再補(bǔ)加培養(yǎng)液。14整理ppt評(píng)價(jià)：翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶的目的是為使組織塊微干涸，以利貼附和免從瓶壁流失，但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，超過(guò)三四小時(shí)以上可能對(duì)組織有不利影響。組織塊培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便，順利情況下，組織小塊貼壁培養(yǎng)后24小時(shí)，細(xì)胞即可從小塊邊緣向四周游出，通過(guò)生長(zhǎng)增殖，最終亦可連接成片；原組織小塊可完全散成細(xì)胞而消失。15整理ppt如組織塊過(guò)大，殘留小塊換液時(shí)棄掉或再置另瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。組織塊通過(guò)反復(fù)剪切可能受一定損傷，并非每塊組織都有生長(zhǎng)能力，但只要有一局部能生長(zhǎng)往往即可形成單層。16整理ppt17整理ppt3．初代培養(yǎng)意義的討論：組織初代培養(yǎng)是后續(xù)培養(yǎng)的關(guān)鍵階段。初代培養(yǎng)成功與組織污染與否、供體年齡、培養(yǎng)操作技術(shù)和方法、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān)初代培養(yǎng)是各種培養(yǎng)必經(jīng)階段；總的看，對(duì)某一組織進(jìn)行初代培養(yǎng)時(shí)，在未掌握規(guī)律和找到適宜培養(yǎng)條件之前，一是比較困難的。一旦成功和能進(jìn)行傳代培養(yǎng)成為細(xì)胞系后，細(xì)胞那么較易生存。但傳代后的細(xì)胞也并非總是一帆風(fēng)順，有時(shí)生長(zhǎng)一段時(shí)間，未達(dá)終極期便衰退死亡，說(shuō)明培養(yǎng)環(huán)境仍不理想。初代培養(yǎng)細(xì)胞剛離開(kāi)機(jī)體，生物學(xué)性狀與生物學(xué)性狀與原體內(nèi)細(xì)胞比較接近，適用于做藥物檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。18整理ppt九、特殊培養(yǎng)法

〔一〕、二倍體細(xì)胞培養(yǎng)法(DiploidCellCulture)所謂二倍體細(xì)胞培養(yǎng)，是培養(yǎng)的細(xì)胞始終維持二倍體生物學(xué)性狀的培養(yǎng)方法。因其與體內(nèi)細(xì)胞相似性大，在實(shí)驗(yàn)中有很大應(yīng)用價(jià)值。二倍體細(xì)胞來(lái)源體內(nèi)二倍體細(xì)胞，也即正常細(xì)胞的初代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)細(xì)胞成功后能始終保持二倍體細(xì)胞性狀，便成為二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。19整理ppt要點(diǎn)二倍體細(xì)胞雖不難培養(yǎng)，但欲求長(zhǎng)期呈旺盛地增殖生長(zhǎng)、并保持二倍體細(xì)胞性狀，亦非易事。為此必須采取一些有效的措施，一是低溫凍存，二是妥善的培養(yǎng)方法。用反復(fù)傳代的方法以求獲得大量細(xì)胞和維持細(xì)胞長(zhǎng)期生存的方法是不妥的。因?yàn)樵诜磸?fù)傳代中，難免由于培養(yǎng)條件的變化和其它不利影響，使細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生變化。隨時(shí)間延長(zhǎng)不僅能導(dǎo)致細(xì)胞停止生長(zhǎng)，并可失掉二倍體性狀或發(fā)生轉(zhuǎn)化．20整理ppt采取以下措施可能利于二倍體細(xì)胞培養(yǎng)：①?lài)?yán)格控制pH值，最好在5％CO2溫箱中培養(yǎng)；②換液時(shí)間不要間隔太長(zhǎng)，且不要全部更新，盡量保存一局部舊培養(yǎng)液，以棄掉1/2或2/3為妥；③傳代期不能過(guò)長(zhǎng)，不能讓細(xì)胞長(zhǎng)得過(guò)于密集，一旦細(xì)胞接近或剛剛連接成片，即進(jìn)行傳代；21整理ppt④要選用高質(zhì)量的培養(yǎng)基和血清，并盡量維持不變，每次傳代都按一分為二的原那么(細(xì)胞數(shù)量、營(yíng)養(yǎng)液量、培養(yǎng)瓶的空間和面積都一樣)進(jìn)行培養(yǎng)；⑤傳代后如細(xì)胞不用于實(shí)驗(yàn)，立即低溫凍存來(lái)源于胚胎的二倍體成纖維細(xì)胞平均分裂50次左右即進(jìn)入衰退期。22整理ppt不同種類(lèi)和來(lái)源的二倍體細(xì)胞生存期都不一樣，但生存期皆有限。雖然二倍體細(xì)胞具有限的生存期，卻完全能滿(mǎn)足反復(fù)使用的要求。而在實(shí)際應(yīng)用上，初代接種的細(xì)胞都幾十萬(wàn)以上，因此一個(gè)二倍體細(xì)胞系最終提供的細(xì)胞數(shù)量近于無(wú)限的。23整理ppt方法二倍體細(xì)胞培養(yǎng)方法與一般培養(yǎng)相同，關(guān)鍵在于傳代，其傳代程序?yàn)椋?1)吸除舊培養(yǎng)液注入另瓶中；(2)用溫BSS沖洗1次；(3)用O.25％溫胰蛋白酶消化，參加消化液量以?xún)H覆蓋住細(xì)胞層即可；作用1～5分鐘；24整理ppt(4)待細(xì)胞附著松動(dòng)、細(xì)胞質(zhì)邊緣卷起和間隔加大，便終止消化；為防止細(xì)胞喪失，可不必再用BSS沖洗，直接向瓶中參加培養(yǎng)液(新舊培養(yǎng)液按2:1新舊混合)；(5)輕輕反復(fù)吹打制成單個(gè)細(xì)胞懸液(消化缺乏或吹打不充分，易形成細(xì)胞團(tuán)，不利于生長(zhǎng)，應(yīng)注意防止)；(6)按一分為二比例接種培養(yǎng)。25整理ppt討論：如何能保存有大量可利用的二倍體細(xì)胞?首先在初代二倍體細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，要接種多量細(xì)胞；生長(zhǎng)成功后立即凍存做為種細(xì)胞(Stock)。用于實(shí)驗(yàn)時(shí)，解凍1分Stock，傳1～3代，二倍體細(xì)胞是可長(zhǎng)期應(yīng)用的。26整理ppt27整理ppt注意：傳代是細(xì)胞培養(yǎng)中經(jīng)常性操作，有三點(diǎn)本卷須知：①把握好傳代時(shí)機(jī)，已如前述，在80%～90%集合階段最好，過(guò)早傳代細(xì)胞產(chǎn)量少，過(guò)晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳。②二是消化時(shí)間要適度，過(guò)短細(xì)胞不易從瓶壁脫落，過(guò)長(zhǎng)細(xì)胞可脫落流失。28整理ppt③三是消化液濃度要適宜，過(guò)濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反響快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。另外各種細(xì)胞對(duì)消化反響不同，有的敏感，有的遲鈍，因此應(yīng)根據(jù)所用細(xì)胞特點(diǎn)制定適宜消化措施。有的細(xì)胞附著瓶壁不牢，用吸管可從瓶壁直接吹下來(lái)，但這樣容易傷害細(xì)胞，細(xì)胞大片脫落掉，不易計(jì)數(shù)，應(yīng)盡可能采用消化法分散細(xì)胞為妥。29整理ppt消化傳代良好時(shí)，細(xì)胞受損害少，細(xì)胞懸液均勻，各分裝樣品中數(shù)量誤差小，細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度一致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠性大。30整理ppt〔二〕、加支持物培養(yǎng)法

加支持物培養(yǎng)法是預(yù)先向培養(yǎng)容器中參加各種可使細(xì)胞貼附的支持物，進(jìn)行培養(yǎng)的方法。待細(xì)胞貼附于支持物生長(zhǎng)增殖后，可進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)和觀察。觀察時(shí)可把支持物從瓶中抽出，能做各種技術(shù)處理，是研究工作中常用的方法之一。各種對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的如玻璃、塑料、雞卵殼膜、膠原、硅橡膠、袋泡茶包裝紙等，均可做支持物用。31整理ppt1．支持物制備特制有機(jī)玻璃、特氟隆薄膜、玻璃等：其中以玻璃片和特氟隆薄膜最為多用。前者便于做各種固定、染色處理和觀察；后者最適做電鏡技術(shù)，允許做包埋和切片。32整理ppt加支持物培養(yǎng)法程序與一般培養(yǎng)法相同，只是在培養(yǎng)前需在培養(yǎng)瓶中參加已經(jīng)消毒的支持物。特氟隆薄膜為定型無(wú)菌包裝產(chǎn)品，用時(shí)無(wú)菌條件下啟封，用剪刀按需要剪成各種不同大小的塊，于培養(yǎng)接種細(xì)胞前，先置入培養(yǎng)容器中即可。通常多用蓋玻片做支持物，用前先要把蓋片用玻璃刀切成一定形態(tài)，以便裝入培養(yǎng)瓶中，然后按如下順序處理：自來(lái)水浸泡24小時(shí)→96％酒精30～60分鐘→蒸餾水浸泡30～60分鐘→用干凈軟布擦拭干凈(擦?xí)r應(yīng)戴白手套工作)→裝入培養(yǎng)器皿中→高壓或干熱滅菌備用。33整理ppt2．培養(yǎng)法：初代消化培養(yǎng)、初代組織塊培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)等皆可應(yīng)用加支持物培養(yǎng)法。接種細(xì)胞后，可在任何時(shí)間取出支持物，做各種觀察或?qū)嶒?yàn)。支持物培養(yǎng)法中最重要的是支持物一定要處理干凈，不殘留任何對(duì)細(xì)胞有害成分，以免不利細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)增殖。34整理ppt〔三〕、單細(xì)胞別離(克隆)培養(yǎng)

單細(xì)胞別離培養(yǎng)又稱(chēng)細(xì)胞克隆(Cellcloning)，即把單個(gè)細(xì)胞從群體內(nèi)別離出來(lái)單獨(dú)培養(yǎng)，使之重新繁衍成一個(gè)新的細(xì)胞群體的培養(yǎng)技術(shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞或其它未經(jīng)細(xì)胞克隆化的細(xì)胞系都具有異質(zhì)性，細(xì)胞經(jīng)過(guò)克隆以后，后裔細(xì)胞群來(lái)源于一個(gè)共同的祖細(xì)胞，即形成所謂純系，稱(chēng)細(xì)胞株(CellStrain)。細(xì)胞株的細(xì)胞遺傳性狀差異減少，生物性質(zhì)均一，利于實(shí)驗(yàn)研究。35整理ppt1．原理：從理論上說(shuō)各種培養(yǎng)細(xì)胞都可用以進(jìn)行克隆培養(yǎng)。但實(shí)際上，初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限細(xì)胞系(二倍體細(xì)胞)比較困難。無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞等那么比較容易。其原因是，當(dāng)體內(nèi)任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境都有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，期間細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)液具有同化作用，即從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)，也向培養(yǎng)液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物，也有促細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)。36整理ppt有人稱(chēng)之為化學(xué)信使，具有促克隆細(xì)胞生長(zhǎng)作用，實(shí)那么為生長(zhǎng)因子類(lèi)物質(zhì)。單細(xì)胞同化營(yíng)養(yǎng)液能力不如群體細(xì)胞強(qiáng)；初代培養(yǎng)細(xì)胞、有限細(xì)胞系不如無(wú)限細(xì)胞系、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。轉(zhuǎn)化細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞強(qiáng)的原因，可能與它們有自泌(Autocrine)和內(nèi)泌(Endocrine)，即自己合成生長(zhǎng)因子能力有關(guān)。37整理ppt凡對(duì)培養(yǎng)環(huán)境有較大適應(yīng)性和具有較強(qiáng)獨(dú)立生存能力的細(xì)胞，均易做細(xì)胞克隆?？寺〖?xì)胞時(shí)，要把細(xì)胞先制備成單細(xì)胞懸液，再接種培養(yǎng)在底物上，讓細(xì)胞單獨(dú)生長(zhǎng)。適應(yīng)性較大和活力好的細(xì)胞能增殖形成細(xì)胞小群(Colony)克隆。細(xì)胞群?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞形成克隆的百分?jǐn)?shù)稱(chēng)克隆形成率或克隆率(CloningEfficiency)，也稱(chēng)接種率(SeedingEfficiency)。兩詞都可用于表示細(xì)胞生活力和獨(dú)立生長(zhǎng)能力，但克隆形成率含義比接種率更為確切。38整理ppt2．提高克隆形成率的措施細(xì)胞經(jīng)過(guò)稀釋后，在低密度狀態(tài)下培養(yǎng)時(shí)，克隆形成率明顯下降，即克隆形成率與細(xì)胞的密度成正比。對(duì)無(wú)限細(xì)胞系克隆形成率一般很少降到10%以下,但初代培養(yǎng)細(xì)胞和有限細(xì)胞系的克隆形成率那么很低，僅有0.5%～5%，甚至為零。因此必須提高細(xì)胞克隆形成率才易克隆成功，為此常采取以下一些措施：【培養(yǎng)基】：為提高細(xì)胞克隆形成率，選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基是非常重要的環(huán)節(jié)，現(xiàn)知以下一些培養(yǎng)基用作克隆時(shí)效果可能較好。39整理ppt常用細(xì)胞克隆培養(yǎng)基

40整理ppt以上培養(yǎng)基都是個(gè)別研究者選用的，難免有一定的局限性。事實(shí)上分散于各實(shí)驗(yàn)室的同一種細(xì)胞，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后，難免發(fā)生一些適應(yīng)性變化。因此同一種培養(yǎng)基也不一定能適用于不同條件下的同類(lèi)細(xì)胞。在克隆細(xì)胞中，最簡(jiǎn)易和行之有效的方法是使用適應(yīng)性培養(yǎng)基或條件培養(yǎng)基(ConditionalMedium)，它是一種不含有細(xì)胞而已經(jīng)被細(xì)胞生活過(guò)或同化過(guò)的培養(yǎng)基。41整理ppt其制備方法是：(1)培養(yǎng)同源細(xì)胞(未克隆前時(shí)的同一細(xì)胞)至半集合狀態(tài)時(shí)，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)24～48小時(shí)后，吸出所有培養(yǎng)液；(2)離心：3000～4000/別離心10分鐘后，吸取上清液；(3)濾過(guò)：再經(jīng)直徑O.22μm濾孔的濾膜過(guò)濾。低溫凍存貯備用；用時(shí)取1分適應(yīng)培養(yǎng)基+2分培養(yǎng)基混合使用。42整理ppt注意：別離適應(yīng)性培養(yǎng)基時(shí)一定要利用處于指數(shù)增生期時(shí)的細(xì)胞。因此時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)最旺盛，機(jī)能活潑，向周?chē)h(huán)境釋放促生長(zhǎng)的物質(zhì)最多，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分又未被耗盡，是別離制備的最好時(shí)刻。剛別離后的適應(yīng)性培養(yǎng)基中可能含有少量細(xì)胞，一定要通過(guò)離心和濾過(guò)排除干凈，以免形成假克隆?！狙濉恳蕴ヅＱ鍨樯?，小牛血清和馬血清次之；用時(shí)應(yīng)先做克隆形成率試驗(yàn)，選最正確者用之；血清需做滅活處理。43整理ppt【飼細(xì)胞】飼細(xì)胞(FeederCells)也稱(chēng)滋養(yǎng)細(xì)胞，是一層經(jīng)過(guò)射線(xiàn)照射或絲裂霉素傷害處理的、用作克隆細(xì)胞附著底物的細(xì)胞層。飼細(xì)胞受射線(xiàn)照射或絲裂霉素C作用后，便失去分裂能力．但仍然生存并有同化營(yíng)養(yǎng)液的能力。當(dāng)被用作克隆的細(xì)胞散落在飼細(xì)胞上層與之接觸后，飼細(xì)胞能促克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，利于克隆的形成；克隆形成后飼細(xì)胞漸死亡，換液時(shí)去除。制備過(guò)程如下：44整理ppt(1)取原代培養(yǎng)的人或動(dòng)物胚胎成纖維細(xì)胞，90%集合時(shí)制成細(xì)胞懸液，再按103細(xì)胞/毫升重新接種培養(yǎng)；(2)在細(xì)胞半集合時(shí)，準(zhǔn)備0.25μg/ml的絲裂霉素C(MitomycineC)，按2ug/105細(xì)胞的量參加到培養(yǎng)瓶中過(guò)夜；或用射線(xiàn)單次照射，劑量30～50戈瑞(Gy)；(3)細(xì)胞經(jīng)上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養(yǎng)液、再培養(yǎng)24小時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞制成懸液，按5×104/ml(104細(xì)胞/cm2)接種入新培養(yǎng)基中；(4)48小時(shí)后，即可用于細(xì)胞克隆之用。45整理ppt討論：(3)項(xiàng)可略去，即細(xì)胞受照射后，再培養(yǎng)24～48小時(shí)，便可作飼細(xì)胞之用。飼細(xì)胞制備后三周內(nèi)即死亡．應(yīng)及時(shí)應(yīng)用(做飼細(xì)胞時(shí)防止用同源細(xì)胞)。因飼細(xì)胞制備繁鎖，在應(yīng)用多孔培養(yǎng)板克隆細(xì)胞后，已少有人再用飼細(xì)胞進(jìn)行克隆細(xì)胞；但作為底物，用以培養(yǎng)其它難培養(yǎng)的細(xì)胞尚有其應(yīng)用價(jià)值。46整理ppt【激素】1～10u(國(guó)際單位)/ml營(yíng)養(yǎng)液的胰島素能促進(jìn)很多細(xì)胞克隆的形成。地塞米松也有能提高人正常膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等的克隆形成率?！綜O2】CO2對(duì)絕大多數(shù)細(xì)胞克隆形成率都有提高作用，常用5%濃度。對(duì)有的細(xì)胞，如人的成纖維細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞克隆時(shí)，2%的CO2效果可能更好。HEPES(20mM)與2%CO2并用能保護(hù)細(xì)胞免受pH值波動(dòng)的影響。如無(wú)CO2溫箱，需用NaHCO3調(diào)節(jié)pH維持在7.2～7.4。47整理ppt【底物特殊處理】有人證明，用多聚右旋賴(lài)氨酸處理培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿底物后，能提高用低血清培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞的克隆形成率，其方法如下：(1)制備濃度為lmg/ml的多聚右旋賴(lài)氨酸的水溶液，用以濕潤(rùn)培養(yǎng)瓶底；(2)倒出多聚賴(lài)氨酸液，用5mlPBS沖洗一次后，可立即使用，或存數(shù)周內(nèi)使用亦可。有報(bào)道，用培養(yǎng)液配制的濃度為5ug/ml的纖粘連素處理底物后亦有類(lèi)似效應(yīng)。48整理ppt【適應(yīng)性底物】不同細(xì)胞喜歡貼附在不同性質(zhì)的底物上，使用適應(yīng)性底物利于細(xì)胞形成克隆。無(wú)限細(xì)胞系易貼附于塑料底物上。初代培養(yǎng)細(xì)胞易貼附于膠原層或血漿纖維蛋白層底物上。血漿纖維蛋白層制備法如下：先制備出含有0.12單位凝血酶的培養(yǎng)液100毫升；配方為：(1)纖維蛋白原液：纖維蛋白原250mgNaCl800mg枸櫞酸鈉25mg,玻璃三蒸餾水1000ml濾過(guò)法滅菌49整理ppt(2)向培養(yǎng)皿中先加lml纖維蛋白原液，然后再續(xù)加4ml含有凝血酶原的培養(yǎng)液，迅速用吸管頭充分混合，數(shù)分鐘后便凝集形成一層清晰的膠狀膜；(3)再把細(xì)胞接種于此膜之上；也可先把細(xì)胞參加到含有凝血酶原的培養(yǎng)液中，在參加纖維蛋白原液后，再讓細(xì)胞附在膠膜上生長(zhǎng)。50整理ppt另一個(gè)簡(jiǎn)單的底物層是瓊脂層，常用濃度為2%；瓊脂層制備后，可把細(xì)胞接種在瓊脂層上。瓊脂中含有酸性硫酸粘多糖，對(duì)大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定抑制作用，但對(duì)一些病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和惡性細(xì)胞卻無(wú)大影響。瓊脂的這種選擇性作用，一是很多細(xì)胞難以貼附，二是其中含有抑制的多聚陰離子，不利正常細(xì)胞生長(zhǎng)。瓊脂經(jīng)降低毒性處理，特別是減少多聚陰離子后的產(chǎn)物即為瓊脂糖(Agarose)。瓊脂糖可用作克隆不能在瓊脂中生長(zhǎng)(因毒性)的貼附依賴(lài)性細(xì)胞。51整理ppt實(shí)驗(yàn)證明，惡變細(xì)胞或惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞在軟瓊脂(1.2%)的生長(zhǎng)與在裸鼠體上的致瘤性有很大一致性。因此測(cè)試細(xì)胞能否在軟瓊脂中生長(zhǎng)，已成為測(cè)試轉(zhuǎn)化細(xì)胞惡性性的重要指標(biāo)，不同的底物適應(yīng)于不同細(xì)胞的要求。52整理ppt3．多孔塑料培養(yǎng)板單細(xì)胞克隆法Saford的毛細(xì)管克隆細(xì)胞法是最早的單細(xì)胞別離培養(yǎng)技術(shù)。其根本過(guò)程是：在顯微鏡窺視下，直接用毛細(xì)玻璃管從細(xì)胞懸液中吸取單個(gè)細(xì)胞，再進(jìn)一步別離培養(yǎng)形成克隆。本法雖比較精確，但過(guò)程較繁瑣，成功率低，已少采用。除毛細(xì)管法外也還有很多其它方法，但自從多孔塑料培養(yǎng)板問(wèn)世并用于克隆細(xì)胞后，其它法已很少應(yīng)用。53整理ppt多孔塑料培養(yǎng)板克隆細(xì)胞法已成為當(dāng)前克隆細(xì)胞的主要技術(shù)，可極大提高細(xì)胞克隆的成功率并且簡(jiǎn)而易行。多孔塑料培養(yǎng)板克隆細(xì)胞的主要過(guò)程是：先制備出1～2細(xì)胞／毫升低密度的細(xì)胞懸液，然后向多孔塑料培養(yǎng)板各孔中分別接種細(xì)胞懸液0.5～lml，那么每孔平均含1個(gè)細(xì)胞。鏡下檢測(cè)每孔所含細(xì)胞數(shù)，標(biāo)記下含單細(xì)胞的孔，置溫箱培養(yǎng)，數(shù)日后凡在已標(biāo)記的孔中有生長(zhǎng)增殖的細(xì)胞群即為克隆細(xì)胞。其法如下：54整理ppt【材料】健康狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)增生期細(xì)胞克隆培養(yǎng)基(適應(yīng)性培養(yǎng)基或F12等；含10%血清)100.0ml胰蛋白酶(O.25%)10.0mlHanks液100.0ml55整理ppt刻度吸管2支粗試管5個(gè)吸管5個(gè)計(jì)數(shù)器1個(gè)多孔塑料培養(yǎng)板(96孔)1塊微量加液器(O.1ml～1ml)1個(gè)細(xì)胞懸液制備56整理ppt57整理ppt【程序】(1)消化：取健康待克隆細(xì)胞，吸出瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，加消化液；(2)低密度細(xì)胞懸液的制備：做克隆細(xì)胞時(shí)首先需先用消化法制備出分散成單個(gè)細(xì)胞懸液：然后稀釋細(xì)胞，使之成為1～2細(xì)胞／毫升懸液；最適宜細(xì)胞密度為1～2細(xì)胞／ml培養(yǎng)液；58整理ppt(3)接種：先用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加O.5毫升；接種時(shí)要迅速準(zhǔn)確，爭(zhēng)取在最短時(shí)間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)；59整理ppt(4)標(biāo)記：培養(yǎng)6～12小時(shí)后，待細(xì)胞下沉并貼附于培養(yǎng)板孔底后；從溫箱中取出，置倒置光顯微鏡臺(tái)上，觀察和標(biāo)記下含單個(gè)細(xì)胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)；CO2箱內(nèi)含有水槽，以保持箱內(nèi)濕度。在培養(yǎng)中一般無(wú)需換液，只有在細(xì)胞增長(zhǎng)過(guò)于緩慢時(shí)才可進(jìn)行換液。換液時(shí)先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過(guò)多，余少許，以免細(xì)胞干涸。然后再迅速補(bǔ)加新鮮克隆培養(yǎng)液。待孔內(nèi)細(xì)胞增500～600個(gè)時(shí)，可進(jìn)行別離培養(yǎng)；60整理ppt(5)別離擴(kuò)大培養(yǎng)：培養(yǎng)86～96小時(shí)后進(jìn)行觀察。挑選生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1～2次，繼加胰蛋白酶少許，參加量以能覆蓋細(xì)胞群即可，如過(guò)多，應(yīng)吸除多余消化液。置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓時(shí)，參加O.1ml含10%血清的克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當(dāng)細(xì)胞離開(kāi)底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補(bǔ)加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增量，使之形成新的細(xì)胞群體后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。61整理ppt注意：①觀察并挑選孔內(nèi)確實(shí)僅含有一個(gè)細(xì)胞后，才可進(jìn)行標(biāo)記。觀察時(shí)要特別注意孔底邊緣部位，如細(xì)胞落于該處，可能由于直角部折光而觀察不清。凡不能確認(rèn)含一個(gè)細(xì)胞的孔者，不進(jìn)行標(biāo)記，以免發(fā)生假克隆。②標(biāo)記時(shí)要挑選含有縫康細(xì)胞的孔(細(xì)胞體積適宜，輪廓清晰完整)。③亦可接種到其它底物如碟皿中進(jìn)行細(xì)胞克隆，但細(xì)胞易流動(dòng)和克隆形成后不易別離。如僅為測(cè)定細(xì)胞克隆形成率，而不做單細(xì)胞別離，仍可用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)法。62整理ppt四、球體細(xì)胞培養(yǎng)各種細(xì)胞培養(yǎng)法都有一定的局限性，最多用的單層細(xì)胞培養(yǎng)也有缺乏之處，一是傳代時(shí)要做消化處理，對(duì)細(xì)胞有一定的損傷；體內(nèi)各種組織細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)的條件是不一樣的，而體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞與培養(yǎng)液接觸時(shí)機(jī)卻是相同的。也是影響分化因素之一。進(jìn)行球體培養(yǎng)時(shí)，能使培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)成球體形，球體中心部細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物要通過(guò)外圍細(xì)胞，周邊部細(xì)胞卻是直接的，兩者生存條件不同，與腫瘤組織和體內(nèi)上皮組織情況相似，對(duì)研究細(xì)胞分化很有應(yīng)用價(jià)值。63整理ppt1．原理：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞都具有貼附在底物上生長(zhǎng)成單縣細(xì)胞的性質(zhì)，如細(xì)胞長(zhǎng)成片之后細(xì)胞片與底物脫離，更換到使細(xì)胞不易貼附的底物上繼續(xù)生長(zhǎng)時(shí)，那么細(xì)胞片能卷聚成球體形，成為球體培養(yǎng)。64整理ppt2．培養(yǎng)方法【用品】細(xì)胞：能貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞都可用于球體培養(yǎng)試劑和用品：2%的瓊脂培養(yǎng)基30.0mlO.25%胰蛋白酶液10.0ml吸管5支Hanks液100.0m165整理ppt培養(yǎng)液：A液：合成培養(yǎng)液(199或1640等)20.Oml，小牛血清10ml，10%NaHCO3O.5ml。以上液充分混合后，水浴加溫到60℃。B液：4%的Bacto瓊脂20ml，煮沸后冷卻到60℃與A液相混成瓊脂培養(yǎng)液。66整理ppt【程序】(1)瓊脂鋪底的培養(yǎng)瓶：30ml無(wú)菌培養(yǎng)瓶，每瓶中加5ml2%瓊脂培養(yǎng)基，冷卻，形成平坦底層后備用；(2)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好已聯(lián)接成片的細(xì)胞，用彎頭吸管伸入瓶?jī)?nèi)，把細(xì)胞層縱橫割劃成假設(shè)干小區(qū)后，倒出培養(yǎng)液；(3)參加O.25%的胰蛋白酶液，在倒置顯微鏡下邊消化邊觀察，當(dāng)細(xì)胞小區(qū)邊緣卷起后便立即終止消化，倒出消化液，用Hanks輕輕漂洗一次(不洗亦可)，參加新培養(yǎng)液3～5ml，用吸管把已松動(dòng)的細(xì)胞片吸打下來(lái)；分裝入1～3個(gè)含2％瓊脂培養(yǎng)基底層的培養(yǎng)瓶中，置溫箱繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)日后便可生長(zhǎng)成細(xì)胞球體；67整理ppt(4)換液：培養(yǎng)1～2日后，如需換液，微傾斜培養(yǎng)瓶，令培養(yǎng)液集于培養(yǎng)瓶底角，停片刻，待球體細(xì)胞下沉后，吸除局部培養(yǎng)液，再補(bǔ)充新培養(yǎng)液。注意：消化細(xì)胞方法是影響細(xì)胞能否集聚成團(tuán)，形成球的一個(gè)重要因素，如用0.25%的胰蛋白酶加O.2%的EDTA消化細(xì)胞，雖能把細(xì)胞消化成分散的細(xì)胞懸液，但接種在任何底物上都不易形成球體，可能與EDTA作用有關(guān)。又當(dāng)細(xì)胞尚未連接成片時(shí)，消化后也容易形成分散的細(xì)胞懸液，同樣難以形成球體；從而細(xì)胞片是形成球體生長(zhǎng)的一個(gè)重要條件。68整理ppt69整理ppt球體細(xì)胞也可和單層細(xì)胞混合培養(yǎng)，便于研究?jī)煞N不同細(xì)胞的相互影響。方法是：先做單層培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，把2%瓊脂培養(yǎng)液注入瓶?jī)?nèi)，令其在單層細(xì)胞上面形成瓊脂層。注意在加瓊脂時(shí)，要使瓊脂冷卻到快要凝固前再注入瓶?jī)?nèi)，以防止過(guò)熱損傷細(xì)胞。當(dāng)瓊脂凝固后，再把已準(zhǔn)備好的另一種細(xì)胞球體培養(yǎng)液接種在上面，便形成瓊脂層下為單層細(xì)胞，上層為球體細(xì)胞的混合培養(yǎng)。70整理ppt下