蛋白酶活性的測(cè)定方法及原理-圖文

蛋白酶活性的測(cè)定方法及原理_圖文.pptx各種測(cè)定方法及原理考馬斯亮藍(lán)法甲醛滴定法DHT-酪蛋白法DNA-溴乙錠熒光分析法X-光膠片法福林酚法甲醛滴定法3考馬斯亮藍(lán)染料與蛋白質(zhì)在酸性條件下結(jié)合，主要是染料與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm變?yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樘m色，在595nm下測(cè)定的吸光度值A(chǔ)595，與蛋白質(zhì)濃度成正比?？捡R斯亮藍(lán)法4蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，從而測(cè)定其酶活。考馬斯亮藍(lán)法甲醛滴定法5用5-氨基四唑重氮鹽將氨基酸中部分組氨酸和酪氨酸重氮化，得到黃色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白為底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二價(jià)離子可與DHT-蛋白與DHT-肽形成穩(wěn)定的可溶性紅色螯合物，而鋅離子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。選用合適濃度的鋅離子和鎳離子作為沉淀劑和顯色劑，利用比色法可測(cè)定蛋白酶酶活?？捡R斯亮藍(lán)法DHT-酪蛋白法6溴乙錠插入雙鏈DNA的堿基對(duì)之間時(shí)，可使DNA的熒光增加25倍。接近飽和的溴乙錠(0.5μg/mL)與DNA混合時(shí)，其熒光增加量與DNA的濃度呈正比。在DNA-組蛋白-溴乙錠溶液中加入蛋白酶時(shí)，蛋白酶水解結(jié)合在DNA鏈上的組蛋白，使DNA結(jié)合部位暴露出來，溴乙錠重新插入DNA雙鏈中，熒光增加量與蛋白酶活性呈正比。通過測(cè)定DNA溶液的熒光增量來計(jì)算蛋白酶的活性。考馬斯亮藍(lán)法DNA-溴乙錠熒光分析法7酶的底物明膠涂抹在X-光膠片上，當(dāng)待測(cè)酶液滴加到X-光膠片上時(shí)，酶將X-光膠片上的明膠水解，用水沖洗膠片，即可看到膠片上明膠被酶水解的地方，出現(xiàn)透明的圓圈。酶活性的高低與透明圓圈的面積成正比。測(cè)定圓圈的面積以測(cè)定蛋白酶的活性。?？捡R斯亮藍(lán)法X-光膠片法8福林-酚試劑在堿性條件下可被酚類化合物還原呈藍(lán)色鉬藍(lán)和鎢藍(lán)混合物，而蛋白質(zhì)分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物呈上述反應(yīng)，利用此原理測(cè)定蛋白酶酶活。考馬斯亮藍(lán)法福林酚法重點(diǎn)本次實(shí)驗(yàn)就是采用福林酚法測(cè)定蛋白酶活性

福林酚法測(cè)定蛋白酶活性

蛋白酶對(duì)酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鎢蘭和鎢蘭混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來間接測(cè)定蛋白酶的活力。原理分析天平：精度0.0001g恒溫水浴：精度±0.2℃計(jì)時(shí)表分光光度計(jì)沸水浴器振蕩混合器pH計(jì):精度0.01pH單位乳酸緩沖液（pH=3.0）適用于酸性蛋白酶磷酸緩沖液（pH=7.5）適用于中性蛋白酶硼酸緩沖液(pH=10.5)適用于堿性蛋白酶0.4mol/L碳酸鈉溶液0.4mol/L的三氯醋酸液0.5mol/L的NaOH10.00mg/ml酪素溶液100μg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液試劑儀器標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制試管0試管1試管2試管3試管4試管5100μg/ml酪氨溶液（ml）O12345蒸餾水（ml）1098765酪氨酸實(shí)際濃度（μg/ml）O1020304050L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按下表配制分別取上述溶液各1.00ml(須做平行試驗(yàn))，各加入0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml。福林試劑使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中顯色20min,取出用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680nm,比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點(diǎn)，分別測(cè)定其吸光度值，