【食品中單增李斯特菌檢測方法技術發(fā)展綜述5500字（論文）】

前言隨著市場經(jīng)濟的不斷發(fā)展壯大，我國開展全球性食品貿(mào)易在迅猛增長，食品加工和銷售方式也發(fā)生了很大的轉(zhuǎn)折和變革，雖然食品的流通速度加快了，但安全性卻呈現(xiàn)下降的趨勢，導致食源性疾病患者人數(shù)不斷上升[1]。無論是發(fā)達國家還是發(fā)展中國家，食源性疾病已經(jīng)危害著人類的身體健康與生命安全，也對經(jīng)濟產(chǎn)生了重要的沖擊。所以，食源性疾病已逐漸成為我們當前必須面對的嚴峻挑戰(zhàn)[2]。對中國多年來食源性疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)的分析表明，由微生物引起的食源性疾病占疾病和事故總數(shù)的近40%，這也是導致患者人數(shù)最多的原因[3]。其中，單增李斯特菌俗稱冰箱細菌，被認為是最常見的食源性病原體，引起了國家衛(wèi)生安全部門的高度重視[4]。然而，由于其廣泛存在于多種食品中，尤其是冷凍食品中，很難實現(xiàn)對細菌的完全控制。為了減少食物中毒的發(fā)生，有必要對食物中的污染和檢測方法進行有效的探索和研究。。我國食品安全環(huán)境嚴重污染引發(fā)的各類食源性疾病和重大事件具有群體性、突發(fā)性的基本特征，有可能演變?yōu)橹卮蟮氖称饭舶踩[患危機。因此，快速準確地發(fā)現(xiàn)病原菌是應對食源性疾病暴發(fā)的關鍵步驟[5]。此外，隨著我國糧食生產(chǎn)的高度集中和原料來源的高度全球化，食源性疾病暴發(fā)具有暴發(fā)時間長、地域廣、群體大的新特點。在分子生物學方面，為了解決這種生物危害，需要通過對冷鏈運輸和倉庫貯存等各個環(huán)節(jié)進行實時的監(jiān)控以及確定其污染源，因此，采用高效、快速的污水檢測技術就顯得尤為重要[6]。傳統(tǒng)的快速檢測方法在食品中對于實驗器械的質(zhì)量要求較低、可靠性和靈敏度較高、費用少、但由于其操作復雜，且檢測持續(xù)時間長，致使食品中單增李斯特菌的快速檢測不能直接實現(xiàn)。對此本文基于國標法對分子生物檢測學的實時PCR和環(huán)介導恒溫擴增兩種方法進行比較分析討論。一、單增李斯特菌存在現(xiàn)狀單核細胞增生李斯特菌仍然很普遍，但大多數(shù)人缺乏健康意識，導致食物中毒。隨著食品檢測范圍的擴大，細菌檢測的關鍵問題仍然是如何結合現(xiàn)有檢測方法和創(chuàng)新思路，建立快速、準確、分級的檢測體系。同時，它降低了檢測成本，使其更加實用[7]。一系列相關問題也將是未來很長一段時間內(nèi)需要解決的問題。1983年3月，加拿大政府報告指出因為長期進食各種受李斯特菌污染的新鮮涼拌菜而引起了新型食源性人類李斯特菌病。2011年3月美國首次報道了因進食單增李斯特菌受到食物污染的哈密瓜而中毒造成146名孕婦流產(chǎn)，30例病人死亡。西班牙2013年1月到2014年月間，因為感染了李斯特菌病死亡的患者中有1例急性流產(chǎn)，3例腹部流血導致死亡。雖然在購買即食用的食品中李斯特菌很少，能夠達到歐盟的相關食品安全檢測標準，但是對于人類李斯特菌的致病感染率卻在進一步提高。國際上已經(jīng)成功開展了對多種食源性新型單增李斯特菌的臨床篩查，研究了各類食品中各種單增李斯特菌的具體病理學特性和與之密切相關的食品檢測方法手段，探索出更加迅速、便捷、準確、安全的食品檢測方法手段。對于有效減少各種食源性腸道疾病的發(fā)生事件，及時有效地控制各種病原菌的大量傳播以及其他各種嚴重后果的發(fā)生等都具有十分具有重大的科學意義[8]。在食品中進行致病菌的檢查，主要內(nèi)容包括兩個部分：一是通過食物樣本中的分離、富集等來檢查待測的病原菌；二是進一步提升檢測的速度與準確率。目前我國用來檢測食源性致病菌的技術主要分為以下三種：傳統(tǒng)的分離鑒定法、免疫學檢查方法及分子生物學檢查法。傳統(tǒng)分離鑒定方法，對于單增李斯特菌的檢測主要有國家標準中的EB(EnrichmentBroth）增菌法和LB(Luria．Bertani）增菌法，通過對細菌微生物的協(xié)同分離增菌培養(yǎng)、生化化學反應、溶血增菌試驗、協(xié)同聯(lián)合溶血增菌試驗、動物溶血試驗等研究方式等來實現(xiàn)增菌，這些增菌實驗方法研究結果對于科學儀器和實驗設備的質(zhì)量要求不高，可操作性強，但是增菌檢驗的工作周期相對較長，大概需2周時間[9]。國家標準方法是根據(jù)我國國家標準《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB4789.30—2008）規(guī)定而制定的方法，這種方法通常需要5-14天。但是這種方法很容易導致假陽性和假陰性等異常情況，并且存在著肉眼不能區(qū)別的雜菌，這些問題還需要進一步的驗證。而受傳統(tǒng)檢驗技術的限制，從可疑食品中分離致病菌則較為困難，如發(fā)生在德國的大腸桿菌0104食物中毒，是在食物中毒發(fā)生后的近一個月才確定致病食品。這種傳統(tǒng)分離鑒別方法已經(jīng)難以適應在網(wǎng)絡技術下對食品制造商在生產(chǎn)銷售過程中的網(wǎng)絡分析、食品上市及消費前快速分析等要求。雖然在一些傳統(tǒng)食品中對于單核細胞增生性李斯特菌的檢測方法可以直接進行確定性和測量化，靈敏度高，成本低，但耗時長。免疫學技術具有較高的準確性和特異性，但在測定前需要預處理。免疫印跡技術（immunoblotting）是一種新的免疫化學技術，它利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）分離不同分子量的蛋白質(zhì)組分。將獲得的不同條帶與待檢測血清中的相應抗體結合，并通過顯色來判斷患者的感染。免疫印跡法是一種非侵入性的診斷檢測方法，同時具有敏感性高、特異性強、檢測方法簡單、時間短等優(yōu)勢。分子生物學方法快速準確，但生物標志物成本高。代謝組學方法可以方便、準確地測定食品中的單核細胞增生李斯特菌，但需要對目標菌進行過夜培養(yǎng)并建立合適的數(shù)學模型。生物傳感器法靈敏、簡單，適用于食品中李斯特菌的快速檢測，但其穩(wěn)定性和使用壽命有待提高。所以尋求一種快速、準確而高效的檢測方法是測定單核細胞增生李斯特菌所要面臨問題中的重中之重。二、PCR在單增李斯特菌的檢測技術中的應用（一）PCR簡介聚合酶鏈反應（PCR）是一種在體外擴增特定DNA片段的方法。根據(jù)目標DNA模板片段，設計相應的上游引物和下游引物，在合適的條件下進行反應。該方法具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、檢測時間短等特點。聚合酶鏈式反應（PCR），經(jīng)多次變性、退火、延伸后，實現(xiàn)目的核酸片段的指數(shù)擴增。PCR在單增李斯特菌中的檢測原理就是先通過PCR方法將單核細胞增生李斯特菌分為幾個特定的血清群，然后根據(jù)分組結果使用特定因子血清，根據(jù)抗原與抗體之間的特異性凝集反應，進行玻片凝集試驗，確定單核細胞增生李斯特菌的特異性血清型。與僅使用因子血清檢測血清的方法相比，該方法大大節(jié)省了檢測時間，提高了檢測效率。（二）PCR在單增李斯特菌的檢測技術中的應用現(xiàn)狀美國科學家KaryMullis在1985年發(fā)明了PCR[10]，該種準確檢測食物方法因具有食物化學特異性強、靈敏度高、迅捷簡便等四大特征，在準確檢測各種食物的lm和化學元素質(zhì)量等方面已經(jīng)具有很大的科學研究應用潛力。隨著PCR檢測技術的發(fā)展，實時PCR在原先的核酸分子實時電磁輻射定性檢測技術的研究基礎上進一步改良和優(yōu)化已逐步形成為現(xiàn)在的實時電磁輻射核酸分子定量檢測技術，具有實時擴增檢測、高準確度、操作簡單、高通量、高靈敏度、高特異性等六大功能[11]。林玉雙等人就實時熒光PCR法檢測乳粉中單增李斯特菌的比較研究，得出RT-PCR法可用于實驗室乳粉中單增李斯特菌的檢測，具有積極的作用[12]。三、環(huán)介導等溫擴增在單增李斯特菌檢測中的應用（一）環(huán)介導等溫擴增簡介環(huán)介導等溫擴增主要原理是通過研究和設計4條具有特異性的新引物曲線，準確鑒定靶等位基因的6個位點和亞區(qū)，并利用一種新的具有鏈核酸取代活性的BstDNA核酸聚合酶。在65℃的單條環(huán)介導基因恒溫擴增條件下直接對其進行一條環(huán)介導恒溫核酸鏈的擴增，檢測的實驗結果顯示可以用光學肉眼直接觀察到在離心管底部表層存在著一種白色的核酸沉淀物和產(chǎn)生物并進行了初步判斷[13]。環(huán)介導等溫擴增檢測單核細胞增生李斯特菌是根據(jù)單核細胞增生李斯特菌HLA基因保守區(qū)設計的兩對引物。采用反轉(zhuǎn)錄和環(huán)介導等溫法在同一體系中擴增單核細胞增生李斯特菌RNA。以最終濃度為200的羥萘酚藍作為等溫擴增產(chǎn)物的指標。無需打開蓋子即可通過凝膠電泳直接檢測。根據(jù)樣品的顏色變化，可在20小時內(nèi)（包括富集時間）直接檢測到李斯特菌RNA的存在。（二）環(huán)介導等溫擴增在單增李斯特菌檢測中的應用現(xiàn)狀徐匆探究了單增李斯特菌反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法，得出環(huán)介導等溫擴增方法的靈敏度是RT-PCR的10倍，能夠檢測出牛奶中是否存在著單增李斯特活菌，應用價值非常高[14]。LAMP實驗方法分別在單增模型細菌樣品和新鮮實驗細菌樣品的兩次檢測中均具備了良好的特異性和檢測靈敏度，通過LAMP試驗獲得了15份單核細胞增生李斯特菌核酸陽性細菌和生肉細菌樣品[15]。四、PCR與環(huán)介導等溫擴增兩種測定方法分析與研究進展（一）PCR與環(huán)介導等溫擴增兩種測定方法對比PCR法可以檢測多種多樣的樣品，例如對組織、血液、乳汁等進行抗原檢查。曾有研究顯示PCR有高達96%的特異性，還有63%左右的敏感性，但也具有假陽性的缺點，相同條件下不同操作者的結果會產(chǎn)生差異，而且環(huán)境中的其他分枝桿菌也可與IS900片段結合，且擴增出與設定片段相同的條帶[16]。雖然PCR技術是一種快速診斷方法，但在需要鑒別檢測多種病原時，單項PCR方法比較費時[17]。環(huán)介導等溫擴增技術在恒溫條件下（65℃左右）加入鏈置換DNA聚合酶，可在40-60min之內(nèi)完成核酸擴增反應，將目標DNA片段擴增109～1010倍，具有恒溫快速擴增和高特異性的特點[18]。有研究指出LAMP兩種核酸測定方法都能夠精準地檢測出單增利氏李斯特菌，傳統(tǒng)的PCR實驗方法的細菌檢測結果精確性有限，增菌液樣品中的單增核酸桿菌含量遠遠超過了細菌閾下的值，由此也導致的假細菌陰性檢測結果[19]。（二）單增李斯特菌檢測技術研究進展隨著當前我國現(xiàn)代分子細胞生物學的檢測理論和檢驗技術的不斷完善和發(fā)展，相關現(xiàn)代分子細胞生物學的重要檢測工具和檢驗方法技術諸如PCR技術、核酸抗體探針式基因雜交檢測技術、基因芯片、漏聲抗體表面檢測波形和生物化學傳感器等都已經(jīng)在對各類病原菌的科學檢測和生物科學技術研究中被廣泛應用[20]?；诿撗鹾怂岬倪@種分子生物學檢測技術主要是對所有病原菌體細胞和致病微生物的科學檢測，是物種名的識別、物種的進化起源、多樣性的科學評估以及其與動物親緣體的關系、體質(zhì)變化演變等常見的科學研究工具和檢測手段，也是病原微生物快速診斷的主要技術方法之一[21]。五、結語單增李斯特菌是常見的一種食源性致病菌會引起食物顏色變深、產(chǎn)生不良氣味等，引起腐敗。會對人體產(chǎn)生嚴重的傷害，污染初期不易檢出，因此建立能夠及時識別與發(fā)現(xiàn)單增李斯特菌的檢測方法，對我國食品產(chǎn)業(yè)快速、健康發(fā)展具有重大意義。目前，單增李斯特菌的檢測方法眾多，當前主要為PCR以及環(huán)介導等溫擴增方法，本文首先簡要、詳細地介紹了本課題主要研究成果發(fā)展的歷史背景、目標和技術意義，然后針對于當前食品安全領域存在的突出問題、單增李斯特菌及其他多種食源性食品致病菌實時檢測檢驗技術等問題進行了了相關問題討論，最后針對于應用單增李斯特菌的實時檢測檢驗技術分別提出了兩種實時PCR和實時LAMP，這兩種不同檢測方法的特異性和靈敏度，以及單增李斯特菌檢測技術研究進展，以期促進單增李斯特菌的檢測技術發(fā)展。參考文獻[1]徐匆，羅華，建黃皓，梁衛(wèi)驅(qū)，胡珊，李艷芳，胡楚維，羅鴻斌，單增李斯特菌反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J].現(xiàn)代食品科技，2020，36（6）[2]武鑫，食品中單增李斯特菌快速檢測技術研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2019，10（18）[3]徐匆,羅華建,黃皓,等.單增李斯特菌反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增檢測方法的建立[J].現(xiàn)代食品科技,2020,36(6):6.[4]尚叢珊，食源性致病菌單增李斯特菌檢測技術的研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報，2020，11（14）[5]馬盼盼，夏丹丹，趙瑩瑩，郜曉峰，康文藝，食源性單增李斯特菌檢測方法研究進展[J].河南大學學報:醫(yī)學版，2019，38（4）[6]逯巖，祝琳，食品中單增李斯特菌的存在現(xiàn)狀及檢測方法研究[J].中國醫(yī)藥指南，2020，18（21）[7]李云霞，陳雯雯，顧晨榮，饒名禎，郭魯申，趙渝，單增李斯特菌的檢測方法研究進展[J].上海師范大學學報：自然科學版，2015，44（6）[8]賈培，盛司，蘭全學，單增李斯特菌恒溫熒光PCR檢測方法的建立及應用[J].中國新技術新產(chǎn)品，2019，0（9）[9]紀順師，葉長蕓，四種單增李斯特菌常用核酸檢測方法的評價與應用[J].中國人獸共患病學報，2019，35（12）[10]孫靜娟，曾海娟，丁承超，王廣彬，翟緒昭，王淑娟，李杰，劉箐，單核細胞增生李斯特菌檢測技術研究進展[J].微生物學雜志，2017，37（4）[11]劉芳，徐振娜，洪偉彬，謝海燕，食品中單增李斯特菌熒光PCR檢測方法的建立[J].農(nóng)村經(jīng)濟與科技，2017，28（17）[12][林玉雙、藍福勝、廖燕萍、劉曉玲、周雙輝.實時熒光PCR法和國標法檢測乳粉中單增李斯特菌的比較研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2020,11(24):5.[13]方赤光，劉桂華，修冬瑩，黃鑫，王惠，楊紅，孔翔云，食品中單增李斯特菌國家標準檢驗方法實驗室驗證及結果分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2007，17（5）[14]孫玉霜，李穎，李秀梅，楊穎，食源性單增李斯特菌檢測技術研究進展[J].中國動物檢疫，2017，34（8）[15]姜霞，滿朝新，趙玥明，周文琦，曲艷艷，龐心怡，姜毓君，環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉中單增李斯特菌[J].中國食物與營養(yǎng)，2015，21（11）[16]蔣亞男，滿朝新，趙鳳，劉穎，薛玉清，胡惠秩，李博，姜毓君，環(huán)介導恒溫擴增方法快速檢測乳中單增李斯特菌[J].中國乳品工業(yè)，2011，39（4）[17]LakeLS,ShubinYS,LiglerFS.DetectionofStaphylococcalEnterotoxinBinSpikedFoodSamples[J].JFoodProt,2003,66(10):1851-1856.[18]BattCA，CadyNC，StelickS，etal.Real-timePCRdetectionofListeriamonocytogenesusinganintegratedmicrofluidicsplatform[J].SensorsandActuators，B.Chemical，2005，111/112(1):332-341.[19]RenDaxi，WangDeGuo，HuoGuiCheng，etal.Developmentandevalu