腸桿菌科細(xì)菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白的研究

腸桿菌科細(xì)菌中超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和外膜蛋白的研究腸桿菌科細(xì)菌分布廣、種類多、與人類關(guān)系密切,是細(xì)菌感染的最常見病原菌,并以多重耐藥菌株引起的感染為顯著特點(diǎn)。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ExtendedSpectrumβ-Lactamases,ESBLs)是一類主要由腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生,能夠水解包括第三和第四代頭孢菌素在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物,但可以被克拉維酸抑制的一類酶家族。目前已報(bào)道的ESBLs中包括TEM型94種；SHV型44種；CTX-M-型121種；OXA型18種,其他基因型近12種(/studies)。不同的國家、地區(qū)或醫(yī)院因其使用抗菌藥物的種類不同,而表現(xiàn)出不同的ESBLs發(fā)生率及基因型。SHV型酶是革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)最早,也是最常見的β-內(nèi)酰胺酶之一。目前已經(jīng)公布的SHV型酶已經(jīng)超過了140種,且新亞型酶依然在不斷被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)水解底物的不同,SHV型酶可以分為廣譜酶、超廣譜酶和酶抑制劑耐藥型酶。SHV型ESBLs在全球廣泛分布,但各地流行的基因亞型不盡相同。近幾年來,我國有關(guān)此酶的報(bào)道明顯增多,并分離到多種SHV亞型酶。由于ESBL確證試驗(yàn)存在一定的缺陷,CLSI綜合評(píng)價(jià)了第三代和第四代頭孢菌素藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)對(duì)臨床療效的影響后,決定在2010年降低腸桿菌科細(xì)菌對(duì)部分頭孢菌素和氨曲南藥敏判定的折點(diǎn),同時(shí)不再推薦臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行ESBL確證試驗(yàn),僅用于流行病學(xué)和感染控制的目的。盡管已經(jīng)降低了部分抗菌藥物的折點(diǎn),仍有報(bào)道稱按照修改后的折點(diǎn)無法檢測(cè)出全部的產(chǎn)ESBLs菌株。除了產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶外,細(xì)菌外膜蛋白(outermembraneprotein,OMP)功能的改變或缺失也是引起耐藥性變化的重要原因。外膜孔蛋白常以同三聚體的形式存在,聚集起來形成孔道,允許小分子親水性物質(zhì)包括大多數(shù)抗菌藥物的跨膜擴(kuò)散。它們具有特定的透過率,而通透性的不同對(duì)耐藥的產(chǎn)生及耐藥程度的高低均起到重要作用。隨著碳青霉烯類抗菌藥物使用的不斷增加,臨床上已經(jīng)出現(xiàn)了越來越多對(duì)其耐藥的腸桿菌科細(xì)菌,產(chǎn)碳青霉烯酶是最主要的耐藥機(jī)制。然而,碳青霉烯酶的檢測(cè)卻十分困難。為了避免漏篩,CLSI在2009年推薦使用改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)產(chǎn)碳青霉烯酶菌株。雖然該試驗(yàn)的敏感性和特異性均超過90%,依然有報(bào)道出現(xiàn)一定比率的假陽性或假陰性結(jié)果?；诖?本課題收集了ESBL確證試驗(yàn)陽性菌株共382株。其中,2008年大腸埃希菌158株和肺炎克雷伯菌164株,2007年和2008年奇異變形桿菌共60株。分析了2010年CLSI新折點(diǎn)對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株藥敏判定的影響、SHV新亞型酶SHV-136及SHV-137的特點(diǎn)、氨曲南敏感的產(chǎn)ESBL奇異變形桿菌中外膜孔蛋白OmpF的氨基酸序列改變和產(chǎn)ESBLs合并外膜蛋白缺失對(duì)改良Hodge試驗(yàn)假陽性的影響。為針對(duì)產(chǎn)ESBLs菌株感染的抗菌藥物合理選用提供依據(jù),對(duì)臨床耐藥菌產(chǎn)ESBL全面的了解及碳青霉烯酶的準(zhǔn)確檢測(cè),降低醫(yī)院感染的發(fā)生率和病死率有重要意義。第一部分2010年CLSI新折點(diǎn)對(duì)產(chǎn)ESBLs的腸桿菌科細(xì)菌藥敏結(jié)果判定的影響(一)產(chǎn)ESBL腸桿菌科細(xì)菌的基因型分析1.在382株產(chǎn)ESBLs細(xì)菌中,有363株經(jīng)PCR檢測(cè)確定了ESBLs基因型,有3株大腸埃希菌、14株肺炎克雷伯菌和2株奇異變形桿菌未檢測(cè)到ESBLs基因。2.單獨(dú)檢出blaCTx-M或合并blaSHVESBLs的菌株占全部菌株的92.7%,其中有98.1%的大腸埃希菌和96.7%的奇異變形桿菌僅攜帶CTX-M-基因。3.48.2%的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)有CTX-M-1組ESBLs,明顯高于CTX-M-9組的發(fā)生率(P<0.01)；72.8%的大腸埃希菌和91.7%的奇異變形桿菌中發(fā)現(xiàn)有CTX-M-9組ESBL,明顯高于CTX-M-1組的發(fā)生率(P<0.01)。CTX-M-2組和CTX-M-8組ESBLs未檢測(cè)到。4.有26.2%的肺炎克雷伯菌檢出SHV型ESBLs或同時(shí)合并CTX-M型ESBLs,包括29株SHV-12,10株SHV-2,2株SHV-31,1株SHV-136和1株SHV-137；66.5%的肺炎克雷伯菌單獨(dú)攜帶CTX-M-基因；4.3%的菌株單獨(dú)攜帶SHVESBLs;22%的菌株同時(shí)檢出CTX-M-和SHV二種ESBLs基因型。未在大腸埃希菌和奇異變形桿菌中檢測(cè)到SHV型ESBLs。5.在1株肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)TEM新亞型酶基因,經(jīng)JacobyGA教授命名為TEM-183(GenBank登錄號(hào)HQ529916),為廣譜酶。(二)產(chǎn)ESBL腸桿菌科細(xì)菌對(duì)部分頭孢菌素類及氨曲南的敏感性1.使用新的CLSI折點(diǎn),382株產(chǎn)ESBLs的細(xì)菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻肟和頭孢曲松均判定為耐藥。2.91.7%,85%和96.7%的奇異變形桿菌分別對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟和氨曲南判定為敏感。有45.6%和41.8%的大腸埃希菌分別對(duì)頭孢他啶和頭孢吡肟判定為敏感。有20.1%的肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢吡肟顯示敏感。3.總的來看,肺炎克雷伯菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的耐藥率明顯高于大腸埃希菌,而產(chǎn)CTX-M-1組酶菌株比CTX-M-9組酶對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物更耐藥。在290株單獨(dú)攜帶CTX-M-1組或CTX-M-9組的菌株中,有41%-68%攜帶CTX-M-9組酶基因的菌株對(duì)氨曲南、頭孢吡肟和頭孢他啶敏感,而在攜帶CTX-M-1組酶基因的菌株中,對(duì)上述3種抗菌藥物的敏感率僅為3%-14%。在99株產(chǎn)CTX-M-9組酶的大腸埃希菌中,有22株對(duì)上述三種藥都敏感,有11株對(duì)頭孢他啶和頭孢吡肟敏感,對(duì)氨曲南耐藥。在40株產(chǎn)CTX-M-1組酶的大腸埃希菌中,有20株對(duì)上述三種抗菌藥物均耐藥,有8株對(duì)頭孢他啶和氨曲南耐藥而對(duì)頭孢吡肟中介耐藥。盡管2010年CLSI降低了部分抗菌藥物的折點(diǎn),依然有一定比例的產(chǎn)ESBLs腸桿菌科細(xì)菌會(huì)被報(bào)告對(duì)部分頭孢菌素類或氨曲南敏感。不同ESBLs基因型或菌種對(duì)不同抗菌藥物的藥敏結(jié)果存在很大的差異。CTX-M型ESBLs流行的國家或地區(qū),頭孢噻肟的敏感性很好地反映菌株是否產(chǎn)ESBLs。第二部分ESBL新基因亞型SHV-136和SHV-137的發(fā)現(xiàn)及其特性研究在兩株肺炎克雷伯菌K-83及K-158中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)SHV新亞型酶基因,經(jīng)美國JacobyGA教授命名為SHV-136(GenBank登錄號(hào)HQ661362)及SHV-137(HQ661363)(/studies)。1.SHV-136及SHV-137的氨基酸序列：通過PCR產(chǎn)物的測(cè)序、比較,SHV-136是在廣譜酶SHV-25氨基酸序列的基礎(chǔ)上,第22位的丙氨酸被纈氨酸替代。SHV-137是在廣譜酶SHV-1氨基酸序列的基礎(chǔ)上,第147位的甘氨酸被丙氨酸替代,同時(shí)第254位天冬酰胺被組氨酸替代。2.SHV-136及SHV-137的克隆和ESBL的確定：將SHV-136和SHV-137的全基因序列分別連接入質(zhì)粒載體pHSG398后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞Top10,并成功表達(dá)。兩個(gè)克隆株的ESBLs確證試驗(yàn)顯示頭孢他啶/克拉維酸的MIC較單藥頭孢他啶的MIC降低了8倍,故SHV-136及SHV-137均被判定為ESBL。3.SHV-137中決定ESBL特性突變位點(diǎn)的確定：將SHV-137較SHV-1突變的兩個(gè)位點(diǎn),分別成功恢復(fù)成與SHV-1相對(duì)應(yīng)的氨基酸,即SHV-137-M1(A147G)和SHV-137-M2(H254N),并測(cè)序驗(yàn)證了序列。通過ESBL雙紙片確證試驗(yàn)確定SHV-137中第147位的甘氨酸被丙氨酸替代是導(dǎo)致其成為ESBL的關(guān)鍵位點(diǎn)。4.β-內(nèi)酰胺酶等電點(diǎn)的分析：SHV-136的等電點(diǎn)是7.5,而SHV-137的等電點(diǎn)是7.6。5.SHV-136和SHV-137克隆株的藥敏及酶穩(wěn)定性：瓊脂稀釋法藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,攜帶SHV-136和SHV-137酶基因的兩個(gè)克隆株對(duì)多種β-內(nèi)酰胺類及其酶抑制劑合劑的藥敏類似。對(duì)青霉素類、第一代頭孢菌素均表現(xiàn)耐藥；對(duì)第二代、第三代和第四代頭孢菌素表現(xiàn)為敏感但是較感受態(tài)細(xì)胞TOP10的MIC有明顯升高。克拉維酸對(duì)兩個(gè)SHV亞型酶的抑制作用十分明顯,阿莫西林/克拉維酸合劑的MIC較阿莫西林單藥降低64倍；而舒巴坦和他唑巴坦對(duì)兩個(gè)亞型酶的抑制作用較差,對(duì)氨芐西林/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦的MIC均超過256μg/ml。特別是對(duì)含有他唑巴坦的酶抑制劑合劑的耐藥,是很少見的情況。第三部分氨曲南敏感的產(chǎn)ESBLs奇異變形桿菌中外膜孔蛋白OmpF序列的改變?cè)诘谝徊糠值难芯恐形覀儼l(fā)現(xiàn)有14株單獨(dú)產(chǎn)CTX-M-9組ESBL的奇異變形桿菌對(duì)氨曲南的MIC僅為0.04或0.06μg/ml,而對(duì)頭孢噻肟和頭孢吡肟依然表現(xiàn)為耐藥。我們對(duì)這些細(xì)菌的外膜蛋白進(jìn)行了研究。隨機(jī)選擇了單獨(dú)產(chǎn)CTX-M-9組ESBL的奇異變形桿菌共15株,其中,氨曲南MIC為0.04μg/ml、0.06μg/m、0.5μg/ml、1μg/ml和2μg/ml的細(xì)菌各3株。SDS蛋白電泳未發(fā)現(xiàn)這些細(xì)菌外膜蛋白的缺失或明顯減少。并且,fadL、ompA、ompF、ompW和tolC這五種編碼奇異變形桿菌主要外膜孔蛋白基因的表達(dá)水平均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。我們擴(kuò)增了39株(包括上述15株菌)氨曲南MIC為0.04μg/m、0.06μg/ml、0.5μg/ml、和2μg/ml的奇異變形桿菌OmpF全基因序列,與奇異變形桿菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC29906比較后發(fā)現(xiàn)：在氨曲南MIC為0.04和0.06μg/ml的菌株中,均存在相同的OmpF氨基酸序列的改變,其中突變了30個(gè)氨基酸,插入了3個(gè)氨基酸,缺失了7個(gè)氨基酸,同源性為88.5%,而氨曲南MIC為0.5μg/ml和2μg/ml的菌株OmpF的氨基酸序列與ATCC29906完全相同。全部菌株OmpF的調(diào)控子OmpR的氨基酸序列均未發(fā)生突變。第四部分產(chǎn)ESBLs合并外膜蛋白缺失對(duì)改良Hodge試驗(yàn)檢測(cè)碳青霉烯酶的影響選擇第一部分研究的細(xì)菌中對(duì)碳青霉烯類敏感的所有大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌共301株,其中大腸埃希菌153株、肺炎克雷伯菌148株。瓊脂稀釋法藥敏結(jié)果顯示所有菌株對(duì)頭孢唑啉和頭孢噻肟耐藥,62.1%的菌株對(duì)頭孢他啶耐藥,48.2%的菌株對(duì)頭孢吡肟耐藥。受試細(xì)菌中均未擴(kuò)增出碳青霉烯酶基因。其中,有93%的菌株攜帶CTX-M-型ESBLs,包括135株CTX-M-14,占48.2%,112株CTX-M-15,占40%,2株CTX-M-25,占0.7%,28株同時(shí)攜帶CTX-M-14和CTX-M-15,占10%,3株CTX-M-14和CTX-M-2