丙泊酚與七氟烷對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的機(jī)制研究

丙泊酚與七氟烷對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的機(jī)制研究研究背景和意義缺血再灌注損傷是臨床實(shí)踐中比較多見的病理生理過程,如果處置不合理,容易對(duì)患者多個(gè)臟器造成損傷,影響預(yù)后,嚴(yán)重者甚至?xí)＜捌渖?。血管是組織細(xì)胞與血液進(jìn)行營養(yǎng)交換的重要場所,血管損傷也是缺血再灌注損傷中的基本病理改變,內(nèi)皮細(xì)胞是血管和組織之間的重要屏障。事實(shí)上,在器官的缺血再灌注損傷中,血管損傷通常最先發(fā)生,血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡也先于組織細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,導(dǎo)致血管內(nèi)炎性細(xì)胞以及炎性分子直接進(jìn)入組織,加重組織細(xì)胞的損傷。研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的缺血再灌注損傷分子機(jī)制,具有非常重要的臨床價(jià)值。肝臟的損傷可以由多種病理途徑引起,如肝臟缺血再灌注和肝臟硬化。肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生主要有以下兩個(gè)部分：一是由于肝臟本身在缺血過程中發(fā)生的損傷,二是當(dāng)已經(jīng)存在缺血的肝臟發(fā)生血液再灌注時(shí)產(chǎn)生的損傷。已有研究證實(shí),肝臟缺血再灌注涉及多種不同過程,包括缺血時(shí)的三磷酸腺苷(ATP)耗竭、乳酸堆積和酸中毒,活性氧、脂質(zhì)和氮類等自由基的生成,鈣離子超載以及中性粒細(xì)胞活化。當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生缺血及缺氧時(shí),線粒體內(nèi)有氧呼吸受到抑制,發(fā)生無氧呼吸,肝細(xì)胞內(nèi)ATP大量減少、迅速耗竭,依賴ATP的各種細(xì)胞活動(dòng)停止；代謝終產(chǎn)物不能夠迅速排出體外,細(xì)胞內(nèi)乳酸堆積,造成pH值降低和代謝性酸中毒,從而引起肝細(xì)胞損傷。丙泊酚(propofol)是臨床常見的一類靜脈麻醉用藥,近年來研究證實(shí),丙泊酚在術(shù)中參與了多種臟器的保護(hù),如腦、肺臟、脊髓、心血管、腎臟等。目前,盡管丙泊酚保護(hù)臟器的分子機(jī)制已有研究,但是其確切的保護(hù)機(jī)制依然不明確,參與這一過程的新的基因和蛋白還有待發(fā)現(xiàn),這對(duì)于缺血再灌注損傷保護(hù)類藥物的開發(fā)和臨床應(yīng)用具有重要的價(jià)值。miRNA-17分子是miR-17-92家族成員之一,最初被發(fā)現(xiàn)在腫瘤中表達(dá)異常升高而受到關(guān)注,目前研究證實(shí),miRNA-17是重要的一個(gè)癌基因,與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。另一外面,miRNA-17與心臟、肺臟、腦等多種組織細(xì)胞的發(fā)育關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn),缺氧能夠引起血管內(nèi)皮細(xì)胞中miRNA-17的表達(dá)改變,提示miRNA-17可能在缺血再灌注中發(fā)揮生物學(xué)功能。STATs是一種可以和目標(biāo)基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的蛋白家族,STATs在人和哺乳動(dòng)物中已經(jīng)有7個(gè)成員被發(fā)現(xiàn),分別是：STAT1、STAT2、STAT3、STA4、STAT5a、STAT5b、STAT6。很多細(xì)胞外信號(hào)可以激活JAK-STAT通路,調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá),進(jìn)而起到多種作用。STAT3信號(hào)通路與細(xì)胞凋亡有關(guān),抑制STAT3活性可誘導(dǎo)凋亡。丙泊酚廣泛用于臨床麻醉,研究報(bào)道其對(duì)心臟、腦和下肢的缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。類似地,丙泊酚也廣泛用于肝移植,因?yàn)楦嗡ソ卟粫?huì)對(duì)其代謝產(chǎn)生顯著影響。已有學(xué)者證明,吸入性麻醉藥在肝臟缺血之后可保留肝臟血流和細(xì)胞功能。七氟烷是20世紀(jì)90年代廣泛開始應(yīng)用的一種鹵素麻醉劑,目前已成為常用的全身麻醉用藥。與其他吸入麻醉劑類似,七氟烷可通過降低Ca2+濃度并干擾鈣穩(wěn)態(tài)而直接舒張支氣管平滑肌,從而發(fā)揮支氣管擴(kuò)張劑的作用。因此,本項(xiàng)目擬研究miRNA-17在丙泊酚調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用中的分子機(jī)制；同時(shí)構(gòu)建肝臟缺血再灌注大鼠模型,探討丙泊酚和七氟烷是否對(duì)肝臟缺血再灌注具有保護(hù)作用及其具體的作用機(jī)制。第一部分丙泊酚通過調(diào)控miR-17激活STAT3信號(hào)通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷目的研究miRNA-17在丙泊酚誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用中的分子機(jī)制。方法1.體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),構(gòu)建缺氧復(fù)氧的細(xì)胞模型；根據(jù)處理因素的不同,分為H/R組,H/R+propofol150μmol/L組,H/R+miR-17inhibitor組,H/R+miR-17scramble組(NC)；2.利用Real-timePCR技術(shù)檢測丙泊酚對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-17表達(dá)水平的影響；3.利用CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測丙泊酚對(duì)HUVECs保護(hù)作用；4.利用Annexin-V/PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)miR-17抑制劑對(duì)凋亡的抑制作用；5.利用Westernblot檢測丙泊酚處理和miR-17表達(dá)后Bax和Bcl-2的變化；6.利用Westernblot檢測miR-17對(duì)STAT3表達(dá)的影響,利用Westernblot分析miR-17模擬物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的變化；7.通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)鑒定miR-17與STAT3mRNA的結(jié)合。結(jié)果1.Real-timePCR分析發(fā)現(xiàn),HUVECs和H/RHUVECs中的miR-17表達(dá)無明顯改變。但是,經(jīng)丙泊酚處理后,正常細(xì)胞和H/R細(xì)胞中的miR-17表達(dá)均顯著下降。這些結(jié)果表明,miR-17對(duì)H/R導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷可能具有保護(hù)作用；2.CCK-8試驗(yàn)表明,H/R處理之后,丙泊酚處理使細(xì)胞活力顯著上調(diào),轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑使H/R處理之后的細(xì)胞活力上調(diào)。這些結(jié)果表明,給予丙泊酚對(duì)HUVECs有H/R保護(hù)作用,而且該保護(hù)作用可能依賴于miR-17的表達(dá)調(diào)控;3.Annexin-V/PI雙染法及流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)miR-17抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用,使用miR-17抑制劑或陰性對(duì)照(scramble對(duì)照)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs,并用AnnexinV-FITC和碘化丙啶染色,然后在H/R處理之后采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。與未經(jīng)H/R處理組相比,給予丙泊酚后的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與轉(zhuǎn)染scramble對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的數(shù)量也發(fā)生類似的減少；4.Westernblot測定了凋亡相關(guān)蛋白,H/R處理之后給予丙泊酚處理時(shí),凋亡蛋白Bax發(fā)生顯著下調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2發(fā)生上調(diào)。此外,缺氧處理后進(jìn)行miR-17抑制劑轉(zhuǎn)染時(shí),這些蛋白質(zhì)具有相同的表達(dá)趨勢(shì)；5.STAT3活化可引起細(xì)胞周期控制調(diào)節(jié)異常以及凋亡基因異常表達(dá),從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此,miR-17可能通過靶向作用于STAT3而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。為了明確miR-17是否可以直接靶向作用于HUVECs中的STAT3,進(jìn)行了Westernblot分析,發(fā)現(xiàn)miR-17模擬物轉(zhuǎn)染后STAT3蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)；6.將STAT3的3’-UTR克隆到pMIR-REPOR熒光素酶對(duì)照載體。然后制備突變的報(bào)告基因,使其STAT33’-UTR中的miR-17種子匹配序列發(fā)生突變。該STAT33’-UTR和miR-17共轉(zhuǎn)染使相對(duì)熒光素酶活性顯著下降。相反,與NC相比,突變STAT33’-UTR不受miR-17過表達(dá)的影響。這些數(shù)據(jù)表明,STAT3mRNA和miR-17之間存在直接的相互作用。結(jié)論丙泊酚能夠改善缺氧復(fù)氧后臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管內(nèi)皮損傷,這個(gè)保護(hù)作用的機(jī)制之一可能是miR-17下調(diào)介導(dǎo)的STAT3信號(hào)通路激活。第二部分丙泊酚和七氟烷兩種麻醉藥對(duì)肝臟缺血/再灌注損傷的作用目的探討并比較丙泊酚和七氟烷對(duì)肝臟缺血/再灌注的作用及其確切的分子機(jī)制。方法1.選用雄性SD大鼠,建立肝臟缺血再灌注的模型；2.采集肝臟組織,10%福爾馬林固定24小時(shí)以上,包埋后制作4μm厚度切片,然后進(jìn)行HE染色,在光鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)檢查,評(píng)估炎癥和組織損傷情況；3.使用生化分析儀檢測大鼠血清中的血清ALT、AST和LDH的水平,驗(yàn)證丙泊酚和七氟烷對(duì)這三種酶的作用；4.利用聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測大鼠血清中炎性介質(zhì)(TNF-α,、IL-1、IL-10和IL-6)的濃度和水平,以明確丙泊酚和七氟烷是否可以降低這些細(xì)胞因子的水平；5.利用qRT-PCR技術(shù)檢測TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性細(xì)胞因子mRNA的表達(dá),進(jìn)一步明確丙泊酚和七氟烷對(duì)這些細(xì)胞因子的水平的作用；6.利用Westernblot檢測了NF-κB的水平,觀察炎性細(xì)胞因子釋放是否受NF-κB調(diào)控；7.利用特定檢測試劑盒評(píng)估大鼠肝組織中氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物MDA和NO以及抗氧化標(biāo)志物SOD的水平；8.利用TUNEL法檢測肝組織細(xì)胞凋亡情況；9.利用Westernblot檢測丙泊酚和七氟烷對(duì)Bcl-2家族、AKT和p38-MAPK信號(hào)通路的影響,探究丙泊酚和七氟烷的抗凋亡機(jī)制；10.利用行免疫組化染色檢測丙泊酚和七氟烷對(duì)肝臟I/R損傷大鼠的p-Akt和p-p38表達(dá)的影響。結(jié)果1.肝組織損傷的組織學(xué)評(píng)估使用HE染色進(jìn)行。Suzuki評(píng)分顯示IR組的病理改變?yōu)镮R誘導(dǎo)的重度損傷；類似地,丙泊酚和七氟烷降低了Suzuki評(píng)分,即減輕了損傷程度；2.血清中釋放的幾種標(biāo)志物評(píng)估肝臟損傷,包括AST、ALT和LDH,I/R組中這些酶的水平明顯升高,但是丙泊酚和七氟烷均使這三種酶的漏出減少；3.TNF-α、IL-1、IL-6和IL-10等炎性因子在肝臟I/R損傷的病理生理中發(fā)揮關(guān)鍵作用。為了明確丙泊酚和七氟烷是否可以降低這些細(xì)胞因子的水平,使用ELISA和qRT-PCR分別測定了它們?cè)诟谓M織中的水平和mRNA表達(dá)。丙泊酚和七氟烷均使TNF-α、IL-1和IL-6的釋放以及mRNA表達(dá)降低,并增加了IL-10的水平。但是,丙泊酚組的IL-1釋放顯著低于七氟烷組,而TNF-a釋放顯著高于七氟烷組；4.Westernblot檢測了NF-κB的表達(dá),觀察炎性細(xì)胞因子的釋放是否受NF-κB調(diào)控。I/R誘導(dǎo)的P65磷酸化水平升高受到丙泊酚和七氟烷處理的抑制。相反,丙泊酚和七氟烷上調(diào)了IκBα的表達(dá)。丙泊酚對(duì)NF-κB表達(dá)呈現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用；5.測定了MDA、SOD和NO的水平,以評(píng)估丙泊酚和七氟烷對(duì)氧化應(yīng)激的影響。MDA和NO的水平于缺血再灌注時(shí)顯著增加,而丙泊酚和七氟烷處理可使其恢復(fù)。與I/R組相比,丙泊酚和七氟烷處理組的SOD水平下降；6.TUNEL法檢測顯示I/R組的凋亡率顯著增加,而丙泊酚和七氟烷均使凋亡減輕；7.Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)：丙泊酚和七氟烷可抑制缺血性肝損傷中Bcl-2和Bcl-xl等抗凋亡蛋白的下調(diào),而降低Bak和Bax等促凋亡蛋白的上調(diào),最終使誘導(dǎo)肝組織凋亡的細(xì)胞色素C和caspase蛋白表達(dá)下調(diào)；8.Westernblot實(shí)驗(yàn)證實(shí)：丙泊酚增強(qiáng)了AKT的磷酸化而抑制了BAD的磷