生物化學(xué)中蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能第一章StructureandFunctionofProtein一、什么是蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。二、蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性1.蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個局部都含有蛋白質(zhì)。含量高：蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)最豐富的有機分子，占人體干重的45％，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達(dá)80％。1〕.催化蛋白質(zhì)的一個最重要的生物學(xué)功能是作為有機體新陳代謝的催化劑——酶。酶是蛋白質(zhì)中最大的一類。2〕、調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)具有調(diào)節(jié)其他蛋白質(zhì)執(zhí)行其生理功能的能力，這些蛋白質(zhì)稱為調(diào)節(jié)蛋白3〕、轉(zhuǎn)運功能是從一地到另一地轉(zhuǎn)運特定的物質(zhì)。4〕、貯存這類蛋白質(zhì)是氨基酸的聚合物，生物體必要時可利用蛋白質(zhì)作為提供充足氮素的一種方式。蛋白質(zhì)的功能

5〕、運動作為運動根底的收縮和游動蛋白具有共同的性質(zhì)：它們都是絲狀分子或絲狀聚合體。6〕、結(jié)構(gòu)成分蛋白質(zhì)另一重要功能是建造和維持生物體的結(jié)構(gòu)。7〕、防御和進(jìn)攻免疫反響〔免疫球蛋白〕8〕、異常功能蛋白質(zhì)的分子組成

TheMolecularComponentofProtein第一節(jié)

組成蛋白質(zhì)的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質(zhì)還含有碘

。各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16％。由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量,這是凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量的計算根底。100克樣品中蛋白質(zhì)的含量(g%)=每克樣品含氮克數(shù)×6.25×1001/16%

蛋白質(zhì)元素組成的特點6.25—16％的倒數(shù)，每測定１g氮相當(dāng)于6.25g的蛋白質(zhì)。也就是1g氮所代表的蛋白質(zhì)量〔克數(shù)〕蛋白質(zhì)含量＝蛋白氮×6.25一、氨基酸

——組成蛋白質(zhì)的根本單位存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬L-氨基酸〔甘氨酸除外〕。酪氨酸H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R非極性疏水性氨基酸(非極性R基氨基酸)極性中性氨基酸(不帶電荷的極性R基氨基酸)酸性氨基酸〔含有兩個羧基〕堿性氨基酸〔含有兩個以上氨基〕〔一〕氨基酸的分類〔按其側(cè)鏈?的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)分類〕*20種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下:甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00纈氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98異亮氨酸

isoleucineIleI

6.02苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非極性疏水性氨基酸天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22賴氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76組氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.堿性氨基酸幾種特殊氨基酸脯氨酸〔亞氨基酸〕

半胱氨酸+胱氨酸二硫鍵-HH〔二〕氨基酸的理化性質(zhì)1.兩性解離及等電點氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子帶電狀態(tài)判定：等電點〔pI〕pH>pIaa“-〞aa向正極移動pH<pIaa“+〞aa向負(fù)極移動pH=pIaa“0〞aa不移動中性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為α—氨基的解離常數(shù)。pI=(pK1，+pK2，)/2酸性氨基酸：pK1，為α—羧基的解離常數(shù)，pK2，為側(cè)鏈羧基的解離常數(shù)。

pI=(pK1，+pK2，)/2堿性氨基酸：pK2，為α—氨基的解離常數(shù)，pK3，為側(cè)鏈氨基的解離常數(shù)。pI=(pK2，+pK3，)/2等電點計算2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm

附近。大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收3.茚三酮反響氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。二、肽*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的

-羧基與另一個氨基酸的

-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵?！惨弧畴?peptide)+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合那么形成三肽……*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*由十個以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。N末端C末端牛核糖核酸酶〔二〕幾種生物活性肽1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSGGSH復(fù)原酶NADPH+H+NADP+

體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽神經(jīng)肽(neuropeptide)2.多肽類激素及神經(jīng)肽三、蛋白質(zhì)的分類*根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分單純蛋白質(zhì)－－單純蛋白不含有非蛋白質(zhì)部分。這類蛋白質(zhì)水解后的最終產(chǎn)物只有氨基酸。結(jié)合蛋白質(zhì)=蛋白質(zhì)部分+非蛋白質(zhì)部分*根據(jù)蛋白質(zhì)形狀纖維狀蛋白質(zhì)－－分子很不對稱，形狀類似纖維。球狀蛋白質(zhì)－－分子的形狀接近球形，空間構(gòu)象比纖維狀蛋白復(fù)雜。蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

TheMolecularStructureofProtein

第二節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括

一級結(jié)構(gòu)(primarystructure)二級結(jié)構(gòu)(secondarystructure)三級結(jié)構(gòu)(tertiarystructure)四級結(jié)構(gòu)(quaternarystructure)高級結(jié)構(gòu)定義蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)指多肽鏈中氨基酸的排列順序，主要靠肽鍵維系。一、蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)主要的化學(xué)鍵肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。肽鍵(peptidebond)：一個氨基酸的羧基與另一氨基酸的氨基縮水而成的酰胺鍵稱為肽鍵?！病瑿ONH…〕一級結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的根底。目錄二、蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中某一段肽鏈的局部空間結(jié)構(gòu)，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈的構(gòu)象

。也就是該肽段主鏈骨架原子的相對空間位置，主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲。維持二級結(jié)構(gòu)的力量為氫鍵。定義

主要的化學(xué)鍵：

氫鍵

肽單元肽平面(peptideunit，肽單元)：由肽鍵中的四個原子和與之相鄰的兩個碳原子共同構(gòu)成的剛性平面?！睠αCONHCα〕蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉(zhuǎn)角(

-turn)

無規(guī)卷曲(randomcoil)

特征：1、每隔3.6個AA殘基螺旋上升一圈，螺距0.54nm;2、螺旋體中所有氨基酸殘基R側(cè)鏈都伸向外側(cè)，鏈中的全部>C=0和>N-H幾乎都平行于螺旋軸;3、每個氨基酸殘基的>N-H與前面第四個氨基酸殘基的>C=0形成氫鍵，肽鏈上所有的肽鍵都參與氫鍵的形成。α－螺旋〔α－h(huán)elix〕形成因素：與ＡＡ組成和排列順序直接相關(guān)。多態(tài)性：多數(shù)為右手〔較穩(wěn)定〕，亦有少數(shù)左手螺旋存在〔不穩(wěn)定〕；存在尺寸不同的螺旋。β－折疊〔β-pleatedsheet〕

特征：兩條或多條伸展的多肽鏈〔或一條多肽鏈的假設(shè)干肽段〕側(cè)向集聚，通過相鄰肽鏈主鏈上的N-H與C=O之間有規(guī)那么的氫鍵，形成鋸齒狀片層結(jié)構(gòu)，即β－折疊片。類別：平行反平行-折疊-折疊是由兩條或多條幾乎完全伸展的肽鏈平行排列，通過鏈間的氫鍵交聯(lián)而形成的。肽鏈的主鏈呈鋸齒樁折疊構(gòu)象。①在-折疊中，-碳原子總是處于折疊的角上，氨基酸的R基團處于折疊的棱角上并與棱角垂直，兩個氨基酸之間的軸心距為0.35nm.②-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵主要是由兩條肽鏈之間形成的；也可以在同一肽鏈的不同局部之間形成。幾乎所有肽鍵都參與鏈內(nèi)氫鍵的交聯(lián)，氫鍵與鏈的長軸接近垂直。③-折疊有兩種類型。一種為平行式，即所有肽鏈的N-端都在同一邊。另一種為反平行式，即相鄰兩條肽鏈的方向相反。β－轉(zhuǎn)角〔β-turn〕

特征：多肽鏈中氨基酸殘基n的羰基上的氧與殘基〔n+3〕的氮原上的氫之間形成氫鍵，肽鍵回折1800。無規(guī)那么卷曲示意圖無規(guī)那么卷曲細(xì)胞色素C的三級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中那些沒有確定規(guī)律性的局部肽鏈構(gòu)象稱為無規(guī)卷曲。蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域

(2)結(jié)構(gòu)域〔structuredomain〕蛋白質(zhì)中相鄰的二級結(jié)構(gòu)單位〔即單個α－螺旋或β－折疊或β－轉(zhuǎn)角〕組合在一起，形成有規(guī)那么的、在空間上能辯認(rèn)的二級結(jié)構(gòu)組合體稱為蛋白質(zhì)的超二級結(jié)構(gòu)★超二級結(jié)構(gòu)在結(jié)構(gòu)層次上高于二級結(jié)構(gòu)，但沒有聚集成具有功能的結(jié)構(gòu)域．根本組合方式：αα；β×β；βββ在二級結(jié)構(gòu)的根底上，多肽進(jìn)一步卷曲折疊成幾個相對獨立、近似球形的三維實體，再由兩個或兩個以上這樣的三維實體締合成三級結(jié)構(gòu)，這種相對獨立的三維實體稱為結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域具有獨特的空間構(gòu)象，與分子整體以共價鍵相連，并承擔(dān)特定的生物學(xué)功能。形成意義：動力學(xué)上更為合理蛋白質(zhì)〔酶〕活性部位往往位于結(jié)構(gòu)域之間，使其更具柔性(１)超二級結(jié)構(gòu)〔supersecondarystructure〕超二級結(jié)構(gòu)類型βββααβ×β12345

52341

Β-鏈βαββ-迂回回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)β-迂回卵溶菌酶的三級結(jié)構(gòu)中的兩個結(jié)構(gòu)域-螺旋-轉(zhuǎn)角-折疊二硫鍵結(jié)構(gòu)域1結(jié)構(gòu)域2氨基酸殘基的側(cè)鏈對二級結(jié)構(gòu)形成的影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是以一級結(jié)構(gòu)為根底的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側(cè)鏈適合形成-螺旋或β-折疊，它就會出現(xiàn)相應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)。三、蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。主要的化學(xué)鍵整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置，包括主鏈和側(cè)鏈。三級結(jié)構(gòu)的形成使得在序列中相隔較遠(yuǎn)的氨基酸側(cè)鏈相互靠近?！惨弧扯x目錄肌紅蛋白(Mb)的三級結(jié)構(gòu)N端C端亞基之間的結(jié)合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。四、蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。有些蛋白質(zhì)分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基(subunit)。血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次

一級結(jié)構(gòu)→二級結(jié)構(gòu)→超二級結(jié)構(gòu)→結(jié)構(gòu)域→三級結(jié)構(gòu)→亞基→四級結(jié)構(gòu)一級結(jié)構(gòu)

二級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu)四級結(jié)構(gòu)維系蛋白質(zhì)分子的一級結(jié)構(gòu)：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)：氫鍵維系蛋白質(zhì)分子的三級結(jié)構(gòu)：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質(zhì)分子的四級結(jié)構(gòu)：范德華力、鹽鍵a鹽鍵〔離子鍵〕b氫鍵c疏水相互作用力d范德華力e二硫鍵f酯鍵氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數(shù)量大疏水相互作用力對維持三級結(jié)構(gòu)特別重要鹽鍵數(shù)量小二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象很重要，二硫鍵越多，蛋白質(zhì)分子構(gòu)象越穩(wěn)定離子鍵氫鍵范德華力疏水相互作用力蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第三節(jié)〔一〕一級結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的根底一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系牛核糖核酸酶的一級結(jié)構(gòu)二硫鍵天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性牛核糖核酸酶〔二〕一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病〞。分子病在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)中，參與功能活性部位的殘基或處于特定構(gòu)象關(guān)鍵部位的殘基，即使在整個分子中發(fā)生一個殘基的異常，該蛋白質(zhì)的功能也會受到明顯的影響。（一）肌紅蛋白(Mb)與血紅蛋白(Hb)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系Hb與Mb一樣能可逆地與O2結(jié)合，Hb與O2結(jié)合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分?jǐn)?shù)〔稱百分飽和度〕隨O2濃度變化而改變?！捕逞t蛋白的構(gòu)象變化與結(jié)合氧肌紅蛋白(Mb)和血紅蛋白(Hb)的氧解離曲線*協(xié)同效應(yīng)(cooperativity)一個寡聚體蛋白質(zhì)的一個亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。如果是促進(jìn)作用那么稱為正協(xié)同效應(yīng)(positivecooperativity)如果是抑制作用那么稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng)(negativecooperativity)O2血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。變構(gòu)效應(yīng)(allostericeffect)蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為變構(gòu)效應(yīng)?！踩车鞍踪|(zhì)構(gòu)象改變與疾病蛋白質(zhì)構(gòu)象疾?。杭僭O(shè)蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時可導(dǎo)致疾病發(fā)生。蛋白質(zhì)構(gòu)象改變導(dǎo)致疾病的機理：有些蛋白質(zhì)錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋白質(zhì)淀粉樣纖維沉淀的病理改變。這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。瘋牛病中的蛋白質(zhì)構(gòu)象改變瘋牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一組人和動物神經(jīng)退行性病變。正常的PrP富含α-螺旋，稱為PrPc。PrPc在某種未知蛋白質(zhì)的作用下可轉(zhuǎn)變成全為β-折疊的PrPsc，從而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第四節(jié)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與別離純化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein〔一〕蛋白質(zhì)的兩性電離一、理化性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團。*蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點?！捕车鞍踪|(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至100萬之巨，其分子的直徑可達(dá)1～100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。*蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒外表電荷水化膜+++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在等電點的蛋白質(zhì)水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質(zhì)－－－－－－－－帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質(zhì)的聚沉〔三〕蛋白質(zhì)的變性、沉淀和凝固*蛋白質(zhì)的變性(denaturation)在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質(zhì)——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。應(yīng)用舉例臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑〔如疫苗等〕的必要條件。假設(shè)蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或局部恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation)。天然狀態(tài)，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態(tài)，無活性*蛋白質(zhì)沉淀在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。*蛋白質(zhì)的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較鞏固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。(不可逆過程)〔四〕蛋白質(zhì)的紫外吸收由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的OD280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測定?！参濉车鞍踪|(zhì)的呈色反響⒈茚三酮反響(ninhydrinreaction)蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反響。⒉雙縮脲反響(biuretreaction)蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反響稱為雙縮脲反響，雙縮脲反響可用來檢測蛋白質(zhì)水解程度。二、蛋白質(zhì)的別離和純化〔一〕透析及超濾法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開的方法。*超濾法應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，到達(dá)濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。利用天然或人工合成的高分子膜，以外加壓力或化學(xué)位差為推動力，對混合物溶液進(jìn)行別離、分級、提純和富集的方法。反滲透、超濾、微濾、電滲析及傳統(tǒng)的透析法均為膜別離技術(shù)。原理：大分子不能透過膜而被截留，小分子能透過膜，使分子大小不同的物質(zhì)得到別離。

技術(shù)關(guān)鍵：根據(jù)欲別離成分的具體情況選用規(guī)格適宜的過濾膜。

不同膜過濾被截留的分子大小有區(qū)別。如運用超濾，選用適當(dāng)規(guī)格的膜可實現(xiàn)對中藥提取液中多糖類、多肽類、蛋白質(zhì)類的截留別離?！捕潮恋怼Ⅺ}析及免疫沉淀*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即別離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等參加蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)外表電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。等電點pI=5pH=6環(huán)境-pH=4+環(huán)境--++000凝聚*鹽析疏水性物質(zhì)間的親和力：水籠

Clathrate●

水分子會包圍在非極性分子四周，形成類似竹籠的結(jié)構(gòu)，隔離非極性分子，水分子本身的流動性因此而降低。*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質(zhì)免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應(yīng)的抗原蛋白，并形成抗原抗體復(fù)合物的性質(zhì)，可從蛋白質(zhì)混合溶液中別離獲得抗原蛋白?！龈鞣N鹽析及沉淀法的比較

Saltingin鹽溶Saltingout鹽析有機溶劑沉淀蛋白質(zhì)分子表面的帶電基團蛋白質(zhì)分子表面的非極性基團除了hydrophobic

之外的其他作用力NaCl(單價離子)硫酸銨(兩價離子)甲醇、丙酮等蛋白質(zhì)在其pI下，因凈電荷為零而聚集沉淀；假設(shè)參加鹽類，阻礙其聚集而增加溶解度。兩價離子在溶液中搶走附在蛋白質(zhì)表面(非極性部分)的水分子，使非極性部分相互吸引聚集沉淀。降低水活性，溶液的介電常數(shù)下降，增加蛋白質(zhì)溶質(zhì)分子之間的作用力，而聚集在一起。影響因素試劑機制其它說明對較低濃度緩沖液透析是saltingin的反向過程。1)非極性蛋白質(zhì)較早沉淀。2)在硫酸銨中蛋白質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定。1)局部蛋白質(zhì)變性。2)有助沉淀的因素：蛋白質(zhì)分子量大、緩沖液pH靠近pI。3)脂溶性蛋白質(zhì)的溶解度反而增加〔三〕電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負(fù)極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而到達(dá)別離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(elctrophoresis)。根據(jù)支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。幾種重要的蛋白質(zhì)電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質(zhì)等電點的差異而別離蛋白質(zhì)的電泳方法。*雙向凝膠