塵螨、豚草、曲霉粗提物誘導的慢性氣道炎癥及以Syk為靶點化合物Vam3抗炎機制研究

塵螨、豚草、曲霉粗提物誘導的慢性氣道炎癥及以Syk為靶點化合物Vam3抗炎機制研究目前全球大約有3億人患哮喘,其中多數(shù)患者通過吸入免疫抑制劑(如糖皮質(zhì)激素)和p-腎上腺素受體激動劑治療急性哮喘,獲得良好的效果。然而大約5%～10%的慢性哮喘患者卻對此類治療反應(yīng)效果較差?；陬惞檀嫁卓剐蜌獾姥装Y嚴重影響人類的健康,且發(fā)病機制尚未明確,因此在此類疾病的預防、診斷、治療上還存在很大的缺口,現(xiàn)有的部分臨床治療藥物也存在長期的副作用或難吸收等各種各樣的問題,研究類固醇拮抗型氣道炎癥機制和開發(fā)針對此類疾病有效的藥物成為當前急需解決的問題。本研究的目的是探索慢性氣道炎癥機制,并評價以Km(米氏常數(shù))原理高通量篩選的Syk激酶特異性抑制劑Vam3的抗炎機制,以期開發(fā)出具有治療慢性氣道炎癥的一類新藥。大多數(shù)哮喘患者的致敏原為環(huán)境中的多種抗原,但在多數(shù)實驗動物模型中只使用一種過敏原,不能反映患者發(fā)病機制的本質(zhì)。本研究通過采用患者常見的塵螨、豚草和曲霉菌屬組成的3類過敏原復合物(DRA)免疫動物,建立了慢性哮喘模型,并發(fā)現(xiàn)在慢性氣道炎癥中通過NF-κB影響炎癥因子IL-8表達與活性的作用機制。首先,將雌性BALB/c小鼠分為3組,模型組和藥物組中塵螨、豚草和曲霉菌屬(DRA)作為抗原,生理鹽水作為對照,重復免疫動物10周。其次,藥物組中地塞米松作為治療藥物,對照組和模型組中生理鹽水作為安慰劑,口服灌胃兩周,每天1次。結(jié)果觀察到DRA增加了小鼠支氣管肺泡灌流(BAL)液中的IL-10、TGF-β水平和中性粒細胞在肺組織中募集。地塞米松降低了炎癥相關(guān)細胞因子的水平,抑制了肺組織中肥大細胞的浸潤和粘液高分泌。但是,地塞米松并沒有降低反而增加了肺組織中性粒細胞浸潤和與人類功能同源的IL-8的水平。體外研究發(fā)現(xiàn),塵螨主要抗原組分Derp1可刺激人肺泡上皮A549細胞,增強了IL-8的基因表達和NF-κB的活性。然而,未見地塞米松抑制A549細胞中升高的IL-8水平,但NF-κB抑制劑BAY11-7082卻降低了IL-8的高表達。實驗結(jié)果表明IL-8水平的增加可能參與類固醇拮抗型中性粒細胞型氣道炎癥,而這種機制可能與通過激活NF-κB途徑有關(guān)。脾酪氨酸激酶(Syk)可表達于T細胞、B細胞、肥大細胞等多種免疫細胞內(nèi),在急性和慢性炎癥中,通過細胞外抗原誘導的IgE受體FcεRI介導的免疫細胞活化中發(fā)揮重要作用。本研究的目的是觀察二苯乙烯類化合物Vam3對免疫復合物誘導炎癥的抑制及其機制。首先,建立了以Km原理高通量化合物篩選模型,觀察Vam3對Syk激酶的抑制作用。其次,通過活化IgE受體FcεRI介導的免疫細胞活化,評價Vamm3在細胞水平上的抗炎作用。最后,應(yīng)用蛋白免疫印跡技術(shù)評價Vam3對Syk激酶下游信號通路的影響。結(jié)果觀察到二苯乙烯類化合物Vam3競爭性抑制了Syk激酶的催化活性,其Ki和IC50值分別為61.09nM和62.95nM。Vam3在細胞水平上以劑量依賴的方式降低了大鼠腹腔肥大細胞和RBL-2H3細胞內(nèi)Ca2+的水平。同時,Vam3抑制了多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,如腫瘤壞死因子TNF-α,IL-6,IL-8等,其IC50值分別為3.2μM、2.43μM、1.3μM。此外,通過蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)Vam3能夠抑制Syk蛋白激酶的Y525/526位點、下游分子LAT的Y191位點、cPLA2的S505位點、PLCγ-1的Y783位點和S1248位點的磷酸化。實驗結(jié)果表明了Vam3是通過抑制Syk的催化活性,導致下游分子LAT、cPLA2、PLCγ-1活化的抑制,進而抑制炎癥