膽堿能抗炎通路在針刺預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)中的作用機(jī)制研究

膽堿能抗炎通路在針刺預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)中的作用機(jī)制研究目的:通過實(shí)驗(yàn)研究探討針刺風(fēng)池穴預(yù)處理對腦梗死大鼠的腦保護(hù)作用及機(jī)制,并以膽堿能抗炎通路為切入點(diǎn),探討其在針刺風(fēng)池穴預(yù)處理誘導(dǎo)腦缺血耐受效應(yīng)中的作用。方法:實(shí)驗(yàn)一:78只雄性成年SD大鼠,隨機(jī)分為正常組6只,假手術(shù)組、腦梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組各18只。每組又分為1天、3天、7天三個(gè)亞組,每組6只。采用改良ZeaLonga方法制備大腦中動脈閉塞腦梗死(MCAO)模型,針刺預(yù)處理組于造模前針刺大鼠雙側(cè)“風(fēng)池”穴,連續(xù)7天。缺血預(yù)處理組于造模前24小時(shí)于頸外動脈插入自制線栓,栓塞大腦中動脈后,間斷缺血30分鐘。各組分別于處死前4小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評分,HE染色檢測細(xì)胞形態(tài),TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,Real-timePCR和WesternBlot檢測α7-nAChR、TLR4和NF-κB基因及蛋白的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,spss19.0版統(tǒng)計(jì)軟件分析。實(shí)驗(yàn)二:36只健康成年SD雄性大鼠,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、腦梗死組、針刺預(yù)處理組、針刺+迷切組和針刺+抑制劑組,每組6只。模型制備及針刺預(yù)處理方法同實(shí)驗(yàn)一。針刺+迷切組大鼠于針刺治療開始前3天切斷右側(cè)迷走神經(jīng),之后進(jìn)行針刺治療7天,然后行腦梗死模型制備。針刺+抑制劑組大鼠于針刺開始時(shí)同步腹腔注射MLA,然后行腦梗死模型制備。各組分別于動物清醒12小時(shí)和處死前4小時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評分,HE染色檢測細(xì)胞形態(tài),TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,Real-timePCR和WesternBlot檢測α7-nAChR、TLR4和NF-κB基因及蛋白的表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)染色分別檢測a7-nAChR在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞上的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X±S)表示,spss19.0版統(tǒng)計(jì)軟件分析。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示缺血預(yù)處理和針刺預(yù)處理均可改善腦梗死后神經(jīng)功能評分,且優(yōu)于腦梗死組,p<0.05。HE染色結(jié)果顯示,腦梗死組細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變,3天時(shí)最重,而缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞損傷程度均輕于腦梗死組。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示腦梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組TUNE1陽性細(xì)胞明顯多于正常組和假手術(shù)組,p<0.01。各組于1天時(shí)陽性細(xì)胞數(shù)明顯升高,3天達(dá)高峰,7天時(shí)開始下降,缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)TUNE1陽性細(xì)胞多于腦梗死組,p<0.01。Real-timePCR檢測結(jié)果顯示1天和3天時(shí)假手術(shù)組、腦梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組a7-nAChRmRNA表達(dá)下調(diào)。缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組a7-nAChRmRNA表達(dá)高于腦梗死組,p<0.01。7天時(shí)各組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05。腦梗死后1天和3天時(shí)假手術(shù)組、腦梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組TLR4mRNA和NF-κBmRNA表達(dá)上調(diào)。缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組TLR4mRNA和NF-κBmRNA表達(dá)低于腦梗死組,p<0.05。腦梗死7天時(shí)各組間TLR4mRNA和NF-κBmRNA表達(dá)無顯著性差異,p>0.05。WesternBlot結(jié)果-顯示:假手術(shù)組、腦梗死組、缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組a7-nAChR蛋A表達(dá)下降、TLR4和NF-KB蛋白表達(dá)升高,與正常組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.01。缺血預(yù)處理組和針刺預(yù)處理組a7-nAChR蛋白表達(dá)高于腦梗死組,TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)低于腦梗死組,p<0.01。實(shí)驗(yàn)二:神經(jīng)功能評分結(jié)果顯示:腦梗死組、針刺預(yù)處理組、針刺+迷切組和針刺+抑制劑組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損,針刺預(yù)處理組和針刺+迷切組神經(jīng)功能評分優(yōu)于腦梗死組,p<0.05。針刺+抑制劑組與腦梗死組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p>0.05。HE染色結(jié)果顯示腦梗死組細(xì)胞形態(tài)損傷嚴(yán)重,針刺預(yù)處理組和針刺+迷切組可見少量神經(jīng)細(xì)胞損傷改變,針刺+抑制劑組HE染色結(jié)果與腦梗死組相似。細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示:腦梗死組、針刺預(yù)處理組、針刺+迷切組和針刺+抑制劑組均存在較多的TUNE1陽性細(xì)胞,與正常組比較差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p<0.01。針刺預(yù)處理組和針刺+迷切組TUNE1陽性細(xì)胞少于腦梗死組,p<0.05。針刺+抑制劑組與腦梗死組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05。Real-timePCR結(jié)果:針刺預(yù)處理組、針刺+迷切斷組a7-nAChRmRNA表達(dá)均高于腦梗死組,NF-KBmRNA表達(dá)低于腦梗死組,p<0.05。針刺預(yù)處理組TLR4mRNA表達(dá)低于腦梗死組,p<0.01。針刺+迷切斷組TLR4mRNA表達(dá)與腦攸梗死組相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05。針刺+抑制劑組a7-nAChRmRNA、TLR4mRNA和NF-KBmRNA表達(dá)水平與腦梗死組相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05。WesternBlot結(jié)果顯示:針刺預(yù)處理組和針刺+迷切組a7-nAChR蛋白表達(dá)高于腦梗死組,TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)低于腦梗死組,p<0.01。針刺+抑制劑組a7-nAChR、TLR4和NF-κB蛋白表達(dá)水平與腦梗死組相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05。免疫熒光雙標(biāo)檢測結(jié)果顯示:各組a7-nAChR在星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá),針刺預(yù)處理組和針刺+迷切組a7-nAChR/GFAP和a7-nAChR/CD11b陽性細(xì)胞數(shù)均多于腦梗死組,p<0.05,針刺+抑制劑組a7-nAChR/GFAP和a7-nAChR/CDllb陽性細(xì)胞數(shù)與腦梗死組相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,p>0.05。結(jié)論:1、針刺風(fēng)池穴預(yù)處理能夠增強(qiáng)大鼠腦組織對缺血的耐受,使大鼠神經(jīng)功能改善,神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕,抑制細(xì)胞凋亡,具有與缺血預(yù)處理類似的腦保護(hù)作用。2、針刺風(fēng)池穴預(yù)處理可上調(diào)a7-nAChR基因和蛋白的表達(dá),下調(diào)TLR4和NF-κB基因和蛋白的表達(dá)。3、切斷單側(cè)迷走神經(jīng)不能完全阻斷針刺預(yù)處理的腦保護(hù)作用及其對a7-nAChR、TLR4和NF-κB基因