大白菜BAC文庫(kù)的構(gòu)建及CO相關(guān)基因BAC克隆的篩選與分析

大白菜BAC文庫(kù)的構(gòu)建及CO相關(guān)基因BAC克隆的篩選與分析大白菜為十字花科蕓薹屬植物中重要的蔬菜作物,也是我國(guó)種植面積最大的葉用蔬菜。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,基因組結(jié)構(gòu)和功能、基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制等成為了蔬菜專家研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。大片段基因組文庫(kù)的構(gòu)建是基因組學(xué)研究必不可少的工具。盡管國(guó)際上已經(jīng)構(gòu)建了大白菜的基因組文庫(kù),但有關(guān)蕓薹屬基因組結(jié)構(gòu)和功能研究依然處于初級(jí)階段,為了給我國(guó)大白菜基因組結(jié)構(gòu)及功能研究提供方便,構(gòu)建我國(guó)優(yōu)良自交系的BAC文庫(kù)也是當(dāng)務(wù)之急。大白菜主要以營(yíng)養(yǎng)器官為產(chǎn)品,早期抽薹是大白菜春季生產(chǎn)的主要障礙,嚴(yán)重影響著它的產(chǎn)量和品質(zhì),因此,研究培育大白菜晚抽薹品種,滿足市場(chǎng)的周年供應(yīng)成為蔬菜育種工作者的重要任務(wù)。研究大白菜開(kāi)花相關(guān)基因及調(diào)控的分子機(jī)制將為培育抗抽薹新品種提供理論基礎(chǔ)及分子鑒定手段。本文以我國(guó)優(yōu)良的大白菜自交系‘85-1’為材料,利用pIndigoBAC5為載體,以HindⅢ為限制性內(nèi)切酶,經(jīng)過(guò)高分子量DNA的制備、DNA與載體的連接、轉(zhuǎn)化等過(guò)程,成功構(gòu)建了大白菜BAC文庫(kù)。通過(guò)構(gòu)建混合池,用PCR方法篩選了大白菜含有CO相關(guān)基因的BAC克隆,并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了序列分析,為研究大白菜抽薹開(kāi)花相關(guān)基因的序列特征及與其他蕓薹屬植物基因序列特征的差異性奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:(1)該文庫(kù)共含有57600個(gè)克隆,以單克隆的形式保存在150個(gè)384孔板中;以大白菜單倍體基因組總長(zhǎng)度550Mb計(jì)算,本文庫(kù)重組子的覆蓋率約為大白菜基因組的10.3倍,該文庫(kù)得到任意單拷貝DNA序列的概率為99.99%,文庫(kù)的覆蓋率符合要求,能夠滿足基因圖位克隆、物理圖譜構(gòu)建、基因定位的需要;隨機(jī)挑取200個(gè)BAC克隆,經(jīng)過(guò)檢測(cè),其插入片段平均大小為98.4Kb,插入片段多集中在90~120Kb之間。85%的BAC克隆插入片段在90Kb以上,證明片段大小的均一性較好;在200個(gè)檢測(cè)的克隆中,有3個(gè)克隆沒(méi)有插入片段,文庫(kù)的空載率為1.5%;隨機(jī)挑取6個(gè)BAC克隆進(jìn)行連續(xù)5d的培養(yǎng),HindⅢ完全酶切的結(jié)果表明,各個(gè)克隆經(jīng)過(guò)約125代左右的繁殖,DNA指紋圖譜沒(méi)有變化,證明DNA插入片段能夠在大腸桿菌中穩(wěn)定遺傳,克隆的穩(wěn)定性較好;本試驗(yàn)的連接轉(zhuǎn)化效率為:100~200Kb的DNA與載體連接轉(zhuǎn)化后,一次轉(zhuǎn)化獲得5000個(gè)左右的克隆,200~300Kb的DNA與載體連接轉(zhuǎn)化后,一次轉(zhuǎn)化只獲得800個(gè)克隆,因此連接轉(zhuǎn)化效率與片段的大小密切相關(guān),片段越大,連接轉(zhuǎn)化效率越低;(2)通過(guò)擬南芥CO基因的同源序列設(shè)計(jì)6對(duì)引物,對(duì)47個(gè)384孔板的18048個(gè)克隆進(jìn)行PCR篩選。通過(guò)47個(gè)一級(jí)混合池,48個(gè)二級(jí)混合池,72個(gè)單克隆的三步PCR篩選,共167個(gè)PCR反應(yīng)篩選到3個(gè)陽(yáng)性克隆,分別命名為BrCO97A1、BrCO140N21、BrCO147H21;(3)經(jīng)過(guò)NCBI網(wǎng)站的blastn比對(duì),本試驗(yàn)篩選的BAC克隆含有編碼constans-like蛋白的基因序列,序列相似性與Brassicarapa(白菜,AA),Brassicanapus(甘藍(lán)型油菜,AACC),Brassicajuncea(芥菜型油菜,AABB)最接近,其次為Brassicaoleracea(甘藍(lán),CC),序列相似性最小的為Brassicanigra(黑芥,BB)。因此,該克隆上的CO相關(guān)基因序列與C基因組的同源性高于B基因組。(4)通過(guò)與網(wǎng)站上查找的CO相關(guān)基因的18個(gè)序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果表明:PCR產(chǎn)物序列與Bra008668有96%的最大序列相似性。在與Bra008668的比對(duì)結(jié)果中,查找到12個(gè)SNP位點(diǎn),其中C/T變異6個(gè),G/A變異