表皮葡萄球菌聚集相關(guān)蛋白(Aap)作為抗細(xì)菌生物膜疫苗候選抗原的研究

表皮葡萄球菌聚集相關(guān)蛋白（Aap）作為抗細(xì)菌生物膜疫苗候選抗原的研究凝固酶陰性的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)為人體皮膚表面常見的共生菌,通常不致病。但近年來隨著各種植入性醫(yī)療材料的廣泛使用,表皮葡萄球菌已成為院內(nèi)感染的主要條件致病菌,主要原因是其能在這些醫(yī)療材料表面形成生物膜(biofilm)結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)能夠很好地保護(hù)細(xì)菌抵抗多種抗生素的治療和人體免疫系統(tǒng)的攻擊,并從中不斷釋放細(xì)菌,從而造成機(jī)體的反復(fù)感染,最終將導(dǎo)致醫(yī)療材料植入的失敗,對(duì)患者造成極大的痛苦和對(duì)社會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外,由于抗生素的大量使用導(dǎo)致表皮葡萄球菌多重耐藥株的發(fā)生率日趨增高,因此急需開發(fā)預(yù)防和治療葡萄球菌感染的新方法,尤其是開發(fā)能夠有效抗表皮葡萄球菌生物膜的疫苗。細(xì)菌生物膜是細(xì)菌粘附在有機(jī)或無機(jī)材質(zhì)表面形成的由細(xì)菌及大量細(xì)胞外粘附分子組成的多層細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。表皮葡萄球菌生物膜的形成主要分為三個(gè)階段,初始粘附、增殖聚集及生物膜成熟。在生物膜形成的初始粘附階段,細(xì)菌通過大量粘附分子(Adhesin)直接或間接粘附于醫(yī)療材料的表面。當(dāng)完成初始粘附后,細(xì)菌在大量分裂增殖的同時(shí),開始以細(xì)菌表面或分泌至細(xì)胞外的多種粘附分子為介導(dǎo),相互粘附并聚集形成一種多層的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。最終,當(dāng)大量細(xì)菌聚集并在醫(yī)療材料表面形成生物膜后,生物膜表面的細(xì)菌開始從生物膜上脫落,并隨生物膜外的體液播散至其他部位進(jìn)而形成新的生物膜。由于在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程中,眾多的粘附分子對(duì)細(xì)菌的粘附和聚集起到了十分重要的作用,因此研究上述細(xì)菌粘附分子在生物膜形成中的作用,并研究粘附分子的特異性抗體對(duì)細(xì)菌粘附聚集能力和生物膜形成能力的影響,便能為抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程當(dāng)中,現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的能夠介導(dǎo)細(xì)菌間相互粘附聚集的粘附分子主要有三大類,多糖細(xì)胞間粘附因子(PIA)、蛋白粘附因子、以及細(xì)胞外DNA(eDNA)。在這三類粘附分子中,Aap蛋白是一種表達(dá)于表皮葡萄球菌細(xì)胞壁表面的重要的蛋白粘附分子。Aap蛋白介導(dǎo)的細(xì)菌間相互粘附聚集主要是通過其A結(jié)構(gòu)域被蛋白酶水解后,其B結(jié)構(gòu)域在Zn2+存在條件下發(fā)生同源二聚化而實(shí)現(xiàn)的。已有文獻(xiàn)報(bào)道,針對(duì)Aap蛋白的抗體可以有效抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,因此提示Aap蛋白很可能成為抗表皮葡萄球菌生物膜的候選疫苗。本課題目的是以表皮葡萄球菌Aap蛋白為研究對(duì)象,研究其介導(dǎo)表皮葡萄球菌粘附聚集及生物膜形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域,并通過詳細(xì)研究其單克隆抗體對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成的影響綜合分析評(píng)價(jià)Aap蛋白作為抗生物膜疫苗候選抗原的可能性,同時(shí)確定Aap蛋白誘導(dǎo)抗生物膜抗體產(chǎn)生的抗原表位,從而為丌發(fā)新型的抗葡萄球菌感染的疫苗奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。第一章表皮葡萄球菌Aap蛋白介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域基本功能單位的確定在表皮葡萄球菌生物膜形成的過程中,Aap蛋白介導(dǎo)的細(xì)菌間相互粘附聚集發(fā)揮了極為關(guān)鍵的作用,針對(duì)Aap蛋白的抗體可以明顯抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成,因此Aap蛋白可以作為抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的候選抗原。然而因Aap蛋白分子量較大(140-300kDa),所以利用大腸桿菌原核重組表達(dá)全長(zhǎng)的Aap蛋白難以實(shí)現(xiàn)較高的蛋白產(chǎn)量,導(dǎo)致很難利用全長(zhǎng)Aap蛋白制備疫苗；同時(shí)由于Aap蛋白是表皮葡萄球菌中的一種優(yōu)勢(shì)抗原,直接運(yùn)用這種來源于細(xì)菌的大分子蛋白制備的疫苗安全性較低,難以用于人體的全身免疫?；谏鲜鲈?利用Aap蛋白作為抗原研發(fā)相關(guān)的疫苗產(chǎn)品,只能在Aap蛋白中尋找其介導(dǎo)細(xì)菌間相互粘附聚集和生物膜形成的關(guān)鍵區(qū)域,并且以該區(qū)域?yàn)榭乖M(jìn)一步研究其是否能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗生物膜的抗體,從而為后續(xù)的疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。通過對(duì)Aap蛋白的生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn)Aap蛋白由N端信號(hào)肽、A結(jié)構(gòu)域、B結(jié)構(gòu)域、P/G富集結(jié)構(gòu)域和C端的LPXTG細(xì)胞壁錨鏈基序組成。在不同的表皮葡萄球菌菌株中,由高度保守的重復(fù)元件反復(fù)重復(fù)串聯(lián)構(gòu)成的B結(jié)構(gòu)域是Aap蛋白中變異最大的區(qū)域,不同菌株Aap蛋白該區(qū)域含有的重復(fù)元件數(shù)量不同,RP62A、ATCC12228和5179株Aap蛋白的B結(jié)構(gòu)域分別含有12個(gè)、6個(gè)和5個(gè)重復(fù)元件。利用穿梭質(zhì)粒pCN51在肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)中過表達(dá)表皮葡萄球菌ATCC12228株Aap蛋白的B結(jié)構(gòu)域,原本不能形成生物膜的肉葡萄球菌形成了較為明顯的細(xì)菌生物膜。說明ATCC12228株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)細(xì)菌生物膜的形成,即使其含有重復(fù)元件的數(shù)量不同于生物膜形成陽性菌株RP62A或5179株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域中含有重復(fù)元件的數(shù)量。該結(jié)果提示,Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域正確空間構(gòu)象的形成及其介導(dǎo)細(xì)菌粘附聚集的功能同其含有的重復(fù)元件的數(shù)量沒有相關(guān)性,各重復(fù)元件可能獨(dú)立行使功能。進(jìn)一步克隆、表達(dá)、純化“Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域最后一個(gè)重復(fù)元件及其后的不完整重復(fù)元件”,即AapBrpt1.5后,利用Native和生物膜微孔板半定量實(shí)驗(yàn)分別研究AapBrpt1.5的聚合狀態(tài)及其對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成的影響。AapBrpt1.5在Zn2＋的介導(dǎo)下可以發(fā)生多聚化,同時(shí)AapBrpt1.5還可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成(抑制作用和濃度成正比)。因此我們認(rèn)為,B結(jié)構(gòu)域中的每個(gè)重復(fù)元件都是一個(gè)可以在Zn2＋介導(dǎo)下發(fā)生多聚化的獨(dú)立區(qū)域,AapBrpt1.5是Aap蛋白介導(dǎo)細(xì)菌間相互粘附聚集和生物膜形成的基本功能單位。此外,通過AapBrpt1.5免疫小鼠得到免疫血清后,利用激光共聚焦顯微鏡觀察了小鼠免疫血清對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成的影響?？笰apBrpt1.5小鼠血清可以明顯抑制表皮葡萄球菌RP62A株生物膜的形成。AapBrpt1.5作為Aap蛋白介導(dǎo)細(xì)菌生物膜形成的基本功能單位,可以代替全長(zhǎng)的Aap蛋白作為一個(gè)合適的抗原而用于后續(xù)的抗表皮葡萄球菌生物膜疫苗的研發(fā)。第二章表皮葡萄球菌Aap蛋白誘導(dǎo)抗生物膜抗體產(chǎn)生的抗原表位確定既往研究證明,Aap蛋白在表皮葡萄球菌生物膜形成過程中具有非常重要的作用,并且其抗體可以抑制細(xì)菌生物膜的形成,提示Aap蛋白可以作為抗生物膜的候選疫苗。但是由于全長(zhǎng)Aap蛋白的抗原性過強(qiáng)、分子量過大,限制了其作為疫苗的應(yīng)用前景。隨著單克隆抗體技術(shù)和抗原表位測(cè)定技術(shù)的發(fā)展,為在Aap蛋白中尋找能夠誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生抗生物膜抗體的抗原表位提供了有力的條件。這種抗原表位的多肽很有可能成為最佳的抗生物膜的候選疫苗。基于此目的,我們研究了小鼠抗Aap單克隆抗體對(duì)表皮葡萄球菌聚集能力和生物膜形成的影響,并測(cè)定了各單克隆抗體的抗原表位,為基于該表位的抗生物膜表位多肽疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。首先,利用Aap蛋白介導(dǎo)生物膜形成的基本功能單位AapBrpt1.5作為抗原,我們制備了小鼠抗Aap單克隆抗體：MAb18B6、MAb25C11和MAb20B9。利用ELISA和WesternBlot分別檢測(cè)各抗體的效價(jià)及抗原識(shí)別力等免疫反應(yīng)性,3株單克隆抗體(IgG)對(duì)AapBrpt1.5具有很高的抗原親和力(效價(jià)≥1：1280000/0.4mg/mL),同時(shí)3株單克隆抗體都可以與表皮葡萄球菌(RP62A和ATCC12228株)Aap蛋白發(fā)生特異性結(jié)合。利用蛋白截短聯(lián)合免疫共沉淀法對(duì)3株單克隆抗體抗原表位的測(cè)定表明,MAb18B6位于AapBrpt1.5中抗原識(shí)別位點(diǎn)的序列與表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域各重復(fù)元件中相應(yīng)位點(diǎn)的序列完全一致；而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位序列僅與RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域中部分重復(fù)元件相應(yīng)位點(diǎn)的序列完全一致,而在其他重復(fù)元件中的相應(yīng)位置存在有氨基酸殘基的變異。繼而,利用生物膜微孔板半定量實(shí)驗(yàn)和激光共聚焦顯微鏡研究小鼠抗Aap單克隆抗體對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形成和細(xì)菌聚集狀態(tài)的影響,MAb18B6可以抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成(抑制率≤40%),但是MAb25C11和MAb20B9卻可以促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成(促進(jìn)率≤30%)。此外,3株單克隆抗體都可以促使浮游生長(zhǎng)的表皮葡萄球菌發(fā)生較為明顯的聚集并形成細(xì)菌團(tuán)塊。結(jié)合對(duì)3株單克隆抗體抗原表位測(cè)定的結(jié)果,我們認(rèn)為不同單克隆抗體對(duì)細(xì)菌生物膜形成的影響同其識(shí)別的抗原表位有關(guān)。MAb18B6抗原表位位于表皮葡萄球菌RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域重復(fù)元件中的保守區(qū)域,MAb18B6可以結(jié)合并抑制B結(jié)構(gòu)域中各個(gè)重復(fù)元件的二聚化作用,并抑制分屬于兩個(gè)細(xì)菌表面的Aap蛋白分子間的拉鏈狀聚合,從而抑制細(xì)菌生物膜的形成；而MAb25C11和MAb20B9的抗原表位位于RP62A株Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域重復(fù)元件中的非保守區(qū)域,它們只能結(jié)合并抑制B結(jié)構(gòu)域中部分重復(fù)元件的二聚化作用,因此它們對(duì)Aap蛋白分子間拉鏈狀聚合的抑制作用明顯低于MAb18B6,從而缺乏對(duì)細(xì)菌生物膜形成的抑制作用。隨后,分別利用Dot-blot、WesternBlot及免疫熒光、熒光定量PCR分別測(cè)定表皮葡萄球菌中細(xì)胞外粘附因子Aap、eDNA及PIA的生物合成,3株單克隆抗體都可以促進(jìn)浮游細(xì)菌和生物膜表面細(xì)菌Aap蛋白的表達(dá),并可以促進(jìn)生物膜中PIA的合成及eDNA的釋放。這些改變都可以促進(jìn)細(xì)菌間的相互粘附聚集,進(jìn)而促使浮游的細(xì)菌聚集成團(tuán),并增強(qiáng)細(xì)菌生物膜的形成。因此,小鼠抗Aap單克隆抗體對(duì)表皮葡萄球菌細(xì)菌間粘附聚集和生物膜形成的影響存在兩種相互矛盾的作用：其一,通過結(jié)合Aap蛋白B結(jié)構(gòu)域重復(fù)元件中相應(yīng)區(qū)域而抑制Aap蛋白二聚化并抑制細(xì)菌生物膜的形成；其二,通過影響細(xì)菌細(xì)胞外粘附因子的生物合成而促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成。MAb25c11和MAb20B9本身缺乏對(duì)Aap蛋白二聚化的抑制能力,同時(shí)又上調(diào)了細(xì)菌細(xì)胞外粘附因子的生物合成,所以其對(duì)生物膜形成的作用最終表現(xiàn)為促進(jìn)；MAb18B6雖然同樣可以上調(diào)細(xì)菌細(xì)胞外粘附因子的生物合成,但是由于其具有較強(qiáng)的阻斷Aap蛋白二聚化的能力,所以上調(diào)了的細(xì)胞外粘附因子的生物合成只是削弱了其對(duì)生物膜形成的抑制作用,MAb18B6最終顯示出對(duì)生物膜形成的抑制。所以只有選擇合適的Aap表位多肽作為疫苗,誘導(dǎo)產(chǎn)生具有較強(qiáng)抑制生物膜作用的抗體,才能達(dá)到預(yù)防生物膜形成的目的；反之,不適當(dāng)?shù)谋砦灰呙缯T導(dǎo)產(chǎn)生的抗體反而可能會(huì)增強(qiáng)細(xì)菌生物膜的形