《諸氏鯔蝦虎魚 毒理學評價 第3部分：生長抑制》

1DB44/TXXXXX.3—2021諸氏鯔蝦虎魚毒理學評價第3部分：生長抑制本文件規(guī)定了諸氏鯔蝦虎魚毒理學評價中生長抑制的原理、方法、器材、評價步驟、質量控制、結果與報告、安樂死和實驗室廢棄物處理等要求。本文件適用于直接或間接排入海洋、入海河口的污染物及受納水體的生長抑制毒性評價。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18420.2-2009海洋石油勘探開發(fā)污染物生物毒性第2部分：檢驗方法SN/T3592實驗室化學藥品和樣品處理的標準指南DB44/Txxxx.1-2021諸氏鯔蝦虎魚毒理學評價第1部分：急性毒性3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1生長抑制growthinhibition實驗魚接觸外源物質后，在一定期間內其生長受到抑制的毒性效應。3.2特定生長率specificgrowthrate，SGR實驗魚在試驗期間的日增重速率。3.3最低可觀察效應濃度lowestobservedeffectconcentration,LOEC與空白對照相比，對受試生物產(chǎn)生顯著(p<0.05)效應的最低受試物濃度。[來源：GB/T21828-2008，2.4]3.4無可見效應濃度noobservedeffectconcentration,NOEC實驗生物暴露在一組不同濃度的試驗溶液一定時間后，通過觀察實驗生物的不良影響，并比較試驗組與對照組統(tǒng)計分析結果，判定出對實驗生物無顯著影響（p＞0.05）的最大濃度。[來源：GB/T18420.2－2009，3.2]4原理2DB44/TXXXXX.3—2021一定濃度的有毒物質暴露下，諸氏鯔蝦虎魚的攝食行為和代謝水平會受到影響，從而對其生長速度產(chǎn)生不同程度的抑制效應。將幼魚期的諸氏鯔蝦虎魚暴露于亞致死濃度范圍的受試物溶液中，試驗周期為14d，測量試驗開始和結束時的諸氏鯔蝦虎魚體重，通過回歸模型來估計抑制x%生長率的濃度（如ECx并統(tǒng)計分析最低可觀察效應濃度（LOEC）以及無可見效應濃度（NOEC），以評價受試物對諸氏鯔蝦虎魚的生長抑制效應。5方法分為靜態(tài)毒性試驗、半靜態(tài)毒性試驗和流水毒性試驗。試驗期間受試物實測濃度與配制濃度偏差超過20%或受試物穩(wěn)定性不明確時，宜采用半靜態(tài)毒性試驗或流水毒性試驗。6器材6.1主要儀器設備6.1.1飼養(yǎng)諸氏鯔蝦虎魚以及餌料生物的養(yǎng)殖箱、水處理設備等。6.1.2測定環(huán)境因子的溶氧儀、鹽度計、pH計、溫度計等。6.1.3電子天平、高速攪拌器、生物顯微鏡、游標卡尺、惰性材料容器、量筒、膠頭滴管、手抄網(wǎng)等。6.2諸氏鯔蝦虎魚宜采用45日齡～75日齡諸氏鯔蝦虎魚，其質量應符合DB44/Txxxx.1-2021中6.2.1的規(guī)定。6.3受試物按照DB44/Txxxx.1—2021中6.3的規(guī)定執(zhí)行。6.4餌料鹵蟲無節(jié)幼體，質量應符合DB44/Txxxx.1-2021中6.2.3.2的規(guī)定。7評價步驟7.1樣品準備7.1.1稀釋水按照DB44/Txxxx.1-2021中7.1.1的規(guī)定執(zhí)行。7.1.2貯備液配制按照DB44/Txxxx.1-2021中7.1.2的規(guī)定執(zhí)行。7.2預試驗設置5個等比濃度組和一個空白對照組。若使用助溶劑應增設助溶劑對照組，助溶劑的濃度應與試驗組中助溶劑最高濃度一致，助溶劑的最高濃度不超過0.1‰?？刹捎幂^大的等比系數(shù)，可不設平行組。每個容器放5尾～10尾諸氏鯔蝦虎魚。觀察并記錄諸氏鯔蝦虎魚96h的死亡情況，確定死亡率不超過10%（LC10）的受試物濃度范圍。3DB44/TXXXXX.3—20217.3正式試驗7.3.1試驗濃度設定根據(jù)預試驗或受試物毒性數(shù)據(jù)，設置至少5個等比濃度組和1個空白對照組，等比系數(shù)不宜大于2.0，最高濃度不大于96hLC10。若使用助溶劑應增設助溶劑對照組，助溶劑的濃度應與試驗組中助溶劑的最高濃度一致，助溶劑的最高濃度不超過0.1‰。各試驗組設3個平行。7.3.2諸氏鯔蝦虎魚的測量和移入7.3.2.1試驗開始前5h～24h應停止投喂馴養(yǎng)魚。7.3.2.2隨機抽取30尾實驗魚，逐尾測量體長（精度：0.1mm測量結果記錄于附錄A中的表A.3，體長變異系數(shù)應小于15%；并稱量其總濕重，測量結果記錄于附錄A中的表A.4。7.3.2.3用手抄網(wǎng)在馴養(yǎng)箱中隨機撈取諸氏鯔蝦虎魚，從低濃度組開始依次向高濃度組分放，每個容器10尾，在30min內完成。7.3.3試驗周期試驗周期為14d。7.3.4試驗環(huán)境條件養(yǎng)殖密度每升不超過10尾，其它要求按DB44/Txxxx.1-2021中7.4.3的規(guī)定執(zhí)行。7.3.5諸氏鯔蝦虎魚投喂每天投喂2次鹵蟲無節(jié)幼體，每次過量投喂（每尾魚投喂200個～300個鹵蟲投喂1h后撈出剩余鹵蟲無節(jié)幼體。7.3.6試驗溶液更換靜態(tài)毒性試驗不更換試驗溶液。半靜態(tài)毒性試驗每48h至少更換一次試液，每次更換量不少于原試液體積的3/4。宜采用虹吸方式吸出原液，緩慢加入新液，操作過程中應避免觸碰諸氏鯔蝦虎魚。流水毒性試驗應根據(jù)受試物的穩(wěn)定性，每24h至少更換一次貯備液。一個試驗容器24h的流量至少為該容器內試驗溶液體積的5倍。試驗期間流速變幅不大于10%。7.3.7觀察和記錄試驗開始和試驗結束時分別測量水溫、溶解氧、pH值、鹽度，測定結果記錄于附錄A的表A.2中。每24h至少觀察一次諸氏鯔蝦虎魚的體色、體形、活動狀態(tài)、死亡等毒性效應，觀察結果記錄在附錄A的表A.2中。用膠頭滴管輕吹諸氏鯔蝦虎魚無反應的判為死亡個體。應及時移出死亡個體。流水毒性試驗每24h至少應測量一次流速，測定結果記錄于附錄A的表A.2中。試驗結束前24h停止投喂，稱量各試驗組存活魚的總濕重或逐尾稱量濕重，記錄于附錄A的表A.48質量控制有效的試驗應符合以下條件： 試驗結束時對照組的諸氏鯔蝦虎魚死亡率不超過10%；4DB44/TXXXXX.3—2021試驗結束時對照組實驗魚的平均增重應超過100%；原始記錄應完整，包括樣品名稱、編號、試驗時間、評價依據(jù)、馴養(yǎng)記錄等。9結果與報告9.1結果計算9.1.1特定生長率的計算試驗期間各試驗組的特定生長率（SGR）按式（1）計算。SGR=[（lnWt-lnW0）/t]×100% 式中：Wt——終末體重；W0——初始體重；t——試驗天數(shù)。死亡率超過10%的試驗組不計算特定生長率。9.1.2生長抑制率的計算試驗期間各試驗組的生長抑制率H按式（2）計算。H=根100%…………（2）式中：R0對照組諸氏鯔蝦虎魚的特定生長率；Rt試驗組諸氏鯔蝦虎魚的特定生長率。9.1.3NOEC和LOEC的計算按照GB/T18420.2-2009中9.2.2.3規(guī)定的方法計算。9.1.4ECx的計算按照GB/T18420.2-2009中9.2.3規(guī)定的方法計算。9.2評價報告評價報告應包括下列內容：a)受試樣品的名稱、來源、保存方法、保存時間等；b)諸氏鯔蝦虎魚來源、日齡、體長、馴養(yǎng)情況；c）試驗條件：1）試驗方式，如半靜態(tài)毒性試驗或流水式毒性試驗，以及曝氣、密度等；2）貯備液和試驗溶液配制方法、濃度；3）各試驗容器諸氏鯔蝦虎魚的數(shù)量；4）試驗溶液配制后和試驗結束時的環(huán)境指標，如水溫、溶氧、鹽度、pH等。1）對照組和各濃度組諸氏鯔蝦虎魚的死亡率；2）試驗期間受試物對諸氏鯔蝦虎魚的毒性效應；5DB44/TXXXXX.3—20213）生長抑制ECx、NOEC和LOEC，及其計算方法；4）試驗期間可能會影響試驗結果的因素。10諸氏鯔蝦虎魚安樂死按照DB44/Txxxx.1-2021中第10章的規(guī)定執(zhí)行。11實驗室廢棄物處理按照SN/T3592的規(guī)定執(zhí)行。附錄A6DB44/TXXXXX.3—2021（資料性）諸氏鯔蝦虎魚生長抑制評價原始記錄表A.1試驗溶液配制記錄表試驗溶液配制記錄見表A.1。表A.1試驗溶液配制記錄表樣品名稱：樣品表觀性狀：樣品編號：評價依據(jù)：評價日期：記錄時間：稀釋水：□曝氣24h以上的自來水，pH值□天然海水，鹽度pH值：。稱量樣品g；□加入mL稀釋水溶解，定容至mL；配制成濃度為mg/L的貯備液。評價人（簽名復核人（簽名7DB44/TXXXXX.3—2021A.2試驗觀察和環(huán)境因子測定原始記錄表試驗觀察和環(huán)境因子測定原始記錄見表A.2。表A.2試驗觀察和環(huán)境因子測定原始記錄表樣品名稱：樣品編號：評價日期：樣品表觀性狀：評價依據(jù)：記錄時間：毒性效應（a）毒性效應（b）毒性效應（c）毒性效應（d）注：根據(jù)觀察結果，可增加毒性效應編號?！妗階BCABCABCABCABCABC評價人（簽名復核人（簽名8DB44/TXXXXX.3—2021A.3體長測量原始記錄表體長測量原始記錄見表A.3。表A.3體長測量原始記錄表樣品名稱：樣品表觀性狀：樣品編號：評價依據(jù)：評價日