輔助生殖PGD與PGS技術(shù)課件

植入前遺傳學(xué)診斷及篩查技術(shù)臨床應(yīng)用tanyueqi,輔助生殖PGD與PGS技術(shù)內(nèi)容概要植入前遺傳學(xué)診斷與篩查的概念PGD檢測流程染色體易位攜帶者的PGD基于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)單基因病PGD背景介紹適應(yīng)征及技術(shù)進(jìn)展臨床應(yīng)用植入前診斷植入前遺傳學(xué)診斷和篩查的概念植入前遺傳學(xué)診斷的臨床應(yīng)用植入前遺傳學(xué)篩查的臨床應(yīng)用輔助生殖PGD與PGS技術(shù)一、植入前遺傳學(xué)診斷與篩查的概念PGD(PreimplantationGeneticDiagnosis)：又稱為孕前診斷(preconceptiongeneticdiagnosis,PGD)。指在胚胎植入前，利用DNA分析技術(shù)對顯微活檢的胚胎細(xì)胞進(jìn)行染色體異?；蜻z傳性疾病進(jìn)行診斷，選擇正常的胚胎植入。第一部分植入前遺傳學(xué)診斷和篩查的概念輔助生殖PGD與PGS技術(shù)第三代試管嬰兒？PGD/PGS是以ICSI-ET為基礎(chǔ)，結(jié)合顯微操作技術(shù)和分子生物學(xué)研究的而發(fā)展起來的。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)PGD的意義PGD可在孕前階段杜絕X-連鎖隱性遺傳病、染色體病和基因病患兒的妊娠，避免人工流產(chǎn)終止異常妊娠給廣大婦女的身心痛苦。理論上還可減少遺傳病在人群中的遺傳負(fù)荷。PGD是遺傳性病防治的重要手段，是Edwards獲諾貝爾獎(jiǎng)的理由之一。植入前診斷傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷輔助生殖PGD與PGS技術(shù)PGD發(fā)展歷程最早于1965由Edwards提出。1968年Gardncr和Edwards在顯微操縱下對兔囊胚進(jìn)行活檢，取出少量滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞分析染色質(zhì)來選擇雌性胚胎。1990年Handyside報(bào)道了世界第一例植入前性別診斷嬰兒的出生，開創(chuàng)了產(chǎn)前診斷的新紀(jì)元。1994年，Munne用FISH技術(shù)，在植入前診斷胚胎染色體非整倍體及性別獲得成功。1999年，Terlin等用巢式PCR和單鏈多態(tài)性分析技術(shù)，對單細(xì)胞進(jìn)行視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的易感性分析，在植入前確定胚胎未來發(fā)生腫瘤的可能性大小，從而為PGD應(yīng)用于人類胚胎基因表達(dá)的研究開辟了嶄新的途徑。2001年Verlinsky有報(bào)道對胚胎進(jìn)行HLA選型以便于骨髓移植。進(jìn)一步拓寬了該技術(shù)的研究和應(yīng)用。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)染色體異常（羅氏易位、相互易位、倒位等）染色體異常的篩查單基因?。ㄒ话愕膯位虿?、性連鎖遺傳病等）單基因異常的篩查

PGD期望解決的問題輔助生殖PGD與PGS技術(shù)

植入前遺傳學(xué)篩查的概念胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PreimplantationGeneticScreening,PGS），是指胚胎植入著床之前，對早期胚胎進(jìn)行染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常的檢測，通過一次性檢測胚胎23對染色體的結(jié)構(gòu)和數(shù)目，挑選正常的胚胎植入子宮，以期獲得正常的妊娠，提高患者的臨床妊娠率，降低多胎妊娠。PGS目前特指針對染色體數(shù)目異常，即非整倍體；PGS理論上將來可以應(yīng)用于單基因病。PGS是低風(fēng)險(xiǎn)人群，夫妻雙方的染色體或者基因是正常的。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)二、PGD檢測流程卵子精子ICSI活檢取樣胚胎冷凍遺傳學(xué)檢測選擇胚胎胚胎植入遺傳咨詢知情談話FISHCHIPPCRMPSIVF臨床促排卵輔助生殖PGD與PGS技術(shù)極體活檢活檢第一極體和第二極體，檢測母源性的染色體結(jié)構(gòu)異?；蚧蛲蛔?，以及減數(shù)分裂異常造成的染色體非整倍體。優(yōu)點(diǎn)：對卵母細(xì)胞的發(fā)育沒有影響。

缺點(diǎn)：只能檢測母源性的染色體異常；

不能檢測受精后發(fā)生的染色體異常；

可檢測細(xì)胞數(shù)少，易發(fā)生檢測失敗。（一）活檢技術(shù)選擇輔助生殖PGD與PGS技術(shù)卵裂球活檢在D3胚胎發(fā)育到6-10細(xì)胞時(shí)活檢出1-2個(gè)卵裂球，進(jìn)行遺傳學(xué)診斷。

優(yōu)點(diǎn)：最成熟最常用的活檢方法。

缺點(diǎn)：活檢出卵裂球后降低了胚胎的發(fā)育潛能；

細(xì)胞數(shù)少，容易發(fā)生檢測失敗(細(xì)胞固定及

雜交失敗，擴(kuò)增失敗，ADO等)。

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)囊胚活檢D5-6天胚胎發(fā)育到囊胚階段后，活檢囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行遺傳學(xué)檢測。

優(yōu)點(diǎn)：對滋養(yǎng)層細(xì)胞的活檢不影響將要發(fā)育成胎

兒的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的發(fā)育；

可檢測細(xì)胞數(shù)較多，檢測失敗概率降低。

對SNP-array而言，能大大減低費(fèi)用。

缺點(diǎn)：大部分情況下（除非可以在24小時(shí)之內(nèi)出結(jié)果）

需將活檢后的囊胚冷凍保存。

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)染色體易位(Translocation):一種染色體結(jié)構(gòu)異常，一條染色體的一段轉(zhuǎn)移到同一條或另一條染色體上，導(dǎo)致易位片段基因的重排

(Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010)易位是一種常見的染色體結(jié)構(gòu)重排異常，新生兒中發(fā)病率0.2%.(Sternetal.,1999)臨床上兩種類型的易位最常見：羅氏易位和相互易位一、染色體易位攜帶者的FISH-PGD第二部分植入前遺傳學(xué)診斷的臨床應(yīng)用輔助生殖PGD與PGS技術(shù)4q2520q12相互易位：兩條非同源染色體之間進(jìn)行片段的交換，常常是整個(gè)末端的斷裂并互換。--Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010著絲?！z粒Derivativechromosome4Derivativechromosome20輔助生殖PGD與PGS技術(shù)羅氏易位：這種類型的易位是在兩組端著絲粒染色體(D組andG組,染色體13-15,21-22)間進(jìn)行交換，往往在靠近著絲粒的區(qū)域斷裂重組，導(dǎo)致易位的兩條染色體隨體的丟失--Thompson&ThompsonGENETICSINMEDICINE2010Centromere→Centromere→Chr21Chr14der(14;21)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)易位攜帶者的健康風(fēng)險(xiǎn)平衡的染色體易位個(gè)體往往沒有明顯的疾病表型，稱為“易位攜帶者”。但卻多存在生殖的障礙；易位攜帶者主要的遺傳風(fēng)險(xiǎn)起源于配子減數(shù)分裂的過程，攜帶者可產(chǎn)生高比例的不平衡配子（精子和卵），可以導(dǎo)致流產(chǎn)，出生染色體異?；純阂鸪錾毕荩ㄌ貏e是智力障礙），并可導(dǎo)致不孕和不育；輔助生殖PGD與PGS技術(shù)平衡易位攜帶者的遺傳風(fēng)險(xiǎn)四射體對于相互易位攜帶者，配子分離模式理論上產(chǎn)生18種配子類型：包括1種正常,

1種平衡易位型

和16種不平衡分離的配子。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)normalbalanceddisomy21disomy21nullisomy21Nullisomy14羅氏易位產(chǎn)生6種配子類型，包括1中正常，1中平衡易位型，其余4種不平衡分離配子，這類不平衡配子往往導(dǎo)致流產(chǎn)。羅氏易位的遺傳風(fēng)險(xiǎn)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)染色體易位和生殖健康反復(fù)流產(chǎn)：

3-4%的反復(fù)流產(chǎn)患者存在染色體結(jié)構(gòu)異常

相互易位占61%羅氏易位占16%--Cliffordetal.1994;Franssenetal.2005我院數(shù)據(jù)：共發(fā)現(xiàn)1425易位攜帶者，其中相互易位76.6%(1094/1428)，羅氏易位23.4%(334/1428).反復(fù)流產(chǎn)–

75.2%(1071/1425)嚴(yán)重男性因素–

17.2%

(245/1425)卵巢功能下降–1.2%

(18/1425)

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)PGD用于易位攜帶者治療的歷史產(chǎn)前診斷移植以來被有效的用來避免染色體異?；純撼霈F(xiàn)，但是診斷異常后流產(chǎn)給婦女帶來心理和生理的負(fù)擔(dān)，并可能導(dǎo)致生育障礙；第一例PGD的成功妊娠，利用Y染色體特異性DNA擴(kuò)增技術(shù)成功對人胚胎性別進(jìn)行診斷并獲得妊娠。--Handyside,AH.Nature,19901998年，F(xiàn)ISH技術(shù)被用于易位攜帶者的PGD診斷并獲得成功

--ConnCMetal.1998;MunnéSetal.1998;PierceKEetal.1998

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)熒光原位雜交(FISH)熒光原位雜交技術(shù)（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）是以利用熒光標(biāo)記的特定基因或染色體片段作為探針，與染色體特定序列DNA分子雜交，可以確定分裂細(xì)胞或間期細(xì)胞對應(yīng)染色體序列的位置及數(shù)目，以此檢測染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。FISH技術(shù)有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①安全、快速、靈敏度高；②探針能較長時(shí)間保存；③多色標(biāo)記，簡單直觀；④可用于中期染色體及間期細(xì)胞的分析輔助生殖PGD與PGS技術(shù)熒光原位雜交(FISH-PGD)技術(shù)流程輔助生殖PGD與PGS技術(shù)歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE)

---FISH-PGD實(shí)踐指南輔助生殖PGD與PGS技術(shù)ESHRE要求：

實(shí)驗(yàn)室胚胎活檢技術(shù)；遺傳室細(xì)胞核玻片固定基礎(chǔ)，并對固定程序有詳細(xì)要求；選擇合適的探針，對平衡易位患者需提前做好外周血淋巴細(xì)胞中期分裂相預(yù)實(shí)驗(yàn)；歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE)

---FISH-PGD實(shí)踐指南輔助生殖PGD與PGS技術(shù)細(xì)胞核玻片固定程序：活檢卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)；低滲液滴中處理≥5min；在圓圈標(biāo)記對應(yīng)的玻片正面部位加固定劑(Tween-20/HC1)，將低滲好的細(xì)胞轉(zhuǎn)至固定劑液滴中；待固定劑完全干燥后，可放在-20℃?zhèn)溆?，或者直接進(jìn)入下一步；60℃烤片，30min-3h；RNase消化，蠟?zāi)し馄?，濕盒?7度孵育30min-1h；將RNase處理后的玻片依次過2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脫水；將玻片放入變性液中，75℃預(yù)變性3-5min（目的是將DNA雙鏈打開）；玻片依次過75%、90%、100%酒精梯度脫水，2min/濃度，完全風(fēng)干；探針75℃變性5min；將探針加到風(fēng)干的玻片樣本上，雙層蠟?zāi)し馄?，置于濕盒中?7℃過夜（雜交4-6h）；玻片依次過洗滌液WS1三缸(45℃)，WS2兩缸（室溫），WS3一缸（室溫）；75%、90%、100%酒精梯度脫水，風(fēng)干；加入DAPI，處理3min后，直接熒光顯微鏡下觀察。歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE)

---FISH-PGD實(shí)踐指南輔助生殖PGD與PGS技術(shù)平衡易位探針選擇和淋巴細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)探針的選擇：商業(yè)探針的使用需通過QC質(zhì)控；自制探針也需要進(jìn)行合適的QC/QA鑒定。所有探針在應(yīng)用到臨床檢測前都需經(jīng)過細(xì)胞雜交預(yù)實(shí)驗(yàn)，評估特異性、亮度及彌散度；對于所有平衡易位攜帶者，需要取用對應(yīng)易位區(qū)段合適的探針以及探針組合對夫妻雙方淋巴細(xì)胞中期分裂相及間期核進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測：至少分析20個(gè)中期分裂相，確保探針位置在正確的染色體上，易位片段能被正確指示；至少分析100個(gè)間期核，評估特異性、亮度及彌散度。歐洲生殖與胚胎學(xué)協(xié)會(huì)(ESHRE)

---FISH-PGD實(shí)踐指南著絲粒探針位點(diǎn)特異性探針亞端粒探針輔助生殖PGD與PGS技術(shù)一例相互易位攜帶者PGD，核型為：46,XY,t(6;10)(q13;p15)，活檢2枚胚胎，對單卵裂球進(jìn)行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)1枚信號正常，移植1枚，妊娠單胎，產(chǎn)前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)制備的一個(gè)中期分裂相和一個(gè)間期核FISH探針：易位片段的亞端粒探針（6q13→6qter，Tel6qSpectrumOrange；10p15→10pter，Tel10pSpectrumGreen）和10號著絲粒片段的著絲粒探針（10p15→10qter,blueCEP10alphasatelliteSpectrumAqua）。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)一例相互易位攜帶者PGD，核型為：46,XY,t(6;10)(q13;p15)，活檢2枚胚胎，對單卵裂球進(jìn)行FISH檢測，發(fā)現(xiàn)1枚信號正常，移植1枚，妊娠單胎，產(chǎn)前診斷為正常核型，已出生正常嬰兒。FISH-PGD舉例：平衡易位攜帶者FISH-PGD檢測結(jié)果：不同通道濾光片下觀察到的細(xì)胞核中的FISH探針熒光信號。a胚胎細(xì)胞核中每個(gè)探針均為2個(gè)雜交信號提示每個(gè)探針位點(diǎn)均為2個(gè)拷貝，表示易位相關(guān)的染色體組成為正?；蚱胶庖孜弧胚胎核中均為1個(gè)紅色信號、3個(gè)綠色信號和2白色信號，分別提示6號易位片段為一個(gè)拷貝、10號易位片段為3個(gè)拷貝和10號著絲粒片段為2個(gè)拷貝，表示該胚胎為臨近-1分離形成的6q13→6qter單體和10p15→10pter三體不平衡產(chǎn)物。臨近-1分離模式圖輔助生殖PGD與PGS技術(shù)ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersBiopsiedcycles257149Oocytenumber14.53±6.5313.81±6.83NumberofgoodqualityembryosonD37.12±4.186.85±4.61NumberofgoodblastocystsonD50.93±1.501.04±1.71Biopsiedembryo(median(range))10(1-30)9(1-24)Biopsied

embryos27091420Normal/balanced17.5%(475)31.8%(451)Unbalanced69.5%(1882)56.3%(799)Testingfailure13.0%(352)12.0%(170)Cancelledcycles(rate)82(31.9%)24(16.1%)2006-2011年我院易位攜帶者進(jìn)行d3

FISH-PGD結(jié)果正?；蚱胶庖孜慌咛ケ壤停绕涫窍嗷ヒ孜惠o助生殖PGD與PGS技術(shù)ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersBiopsiedcycles257149Oocytenumber14.53±6.5313.81±6.83NumberofgoodqualityembryosonD37.12±4.186.85±4.61NumberofgoodblastocystsonD50.93±1.501.04±1.71Transferredembryo(median(range))2(1-3)2(1-3)Cyclesacceptedtransfer175125Clinicalpregnancyrateperbiopsiedcycle33.5%(68/257)32.2%(48/149)ClinicalpregnancyrateperET38.9%(68/175)38.4%(48/125)Implantationrate32.2%(86/267)28.1%(62/221)Miscarriagerate16.2%(11/68)16.7%(8/48)Live

birth

rateperBiopsy22.2%(57/257)26.8%(40/149)Healthbabies/deliveredbabies52/5235/352006-2011年我院易位攜帶者進(jìn)行d3

FISH-PGD結(jié)果輔助生殖PGD與PGS技術(shù)單卵裂球FISH幾種風(fēng)險(xiǎn)可能導(dǎo)致沒有準(zhǔn)確結(jié)果：雜交背景干擾太強(qiáng)的情況雜交雜質(zhì)信號干擾的情況雜交失敗未見信號的情況固定或重雜交細(xì)胞核丟失的情況囊胚FISH相對卵裂期FISH更有優(yōu)勢？1.活檢細(xì)胞數(shù)的增多有利于信號的判定；2.直觀方便檢出胚胎嵌合體。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)胚胎序號Tel7p信號數(shù)Tel8q信號數(shù)CEP8結(jié)果提示11[6]3[6]2[6]異常21[7]3[7]2[7]異常31[5]3[5]2[5]異常42[7]2[7]2[7]正?；蚱胶庖孜?1[4]3[4]2[4]異常62[7]2[7]2[7]正?；蚱胶庖孜?1[7]3[7]2[7]異常81[4]3[4]2[]異常91[6]3[6]2[6]異常102[4]3[2]2[4]2[2]2[4]2[2]異常113[2]1[2]2[2]異常囊胚FISH-PGD舉例：平衡易位輔助生殖PGD與PGS技術(shù)FISH面臨的挑戰(zhàn)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)不同實(shí)驗(yàn)室FISH檢出率和準(zhǔn)確率波動(dòng)較大著床率和妊娠率隨著FISH檢測錯(cuò)誤率的上升而降低輔助生殖PGD與PGS技術(shù)FISH技術(shù)局限FISH技術(shù)僅能檢測有限的染色體，因此患者經(jīng)FISH-PGD成功妊娠，但仍不可避免因其它未檢測的非整倍體異常妊娠而引發(fā)的早期流產(chǎn)或出生缺陷。FISH-PGD早期流產(chǎn)胚胎進(jìn)行比較基因組雜交檢測，檢出5號染色體重復(fù)。需要全染色體篩查為基礎(chǔ)的PGD技術(shù)？輔助生殖PGD與PGS技術(shù)二、基于全染色體篩查的PGD(PGD-CCS)PGDwithComperhansiveChromosomeScreening，避免了FISH僅能檢測少數(shù)染色體的限制，采用全染色體篩查的方式對易位或倒位攜帶者進(jìn)行PGD診斷，同時(shí)排除其它染色體非整倍體異常。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)易位攜帶者的SNP-PGD臨床情況總結(jié)1.囊胚+SNP活檢分析增加PGD診斷的準(zhǔn)確性2.基于SNP的PGD-CCS可以檢測出除易位染色體外其他染色體的異常，減少流產(chǎn)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)易位攜帶者SNP-PGD的臨床結(jié)局總結(jié)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)共分析360個(gè)患者年齡在20~44歲之間，平均新發(fā)生異常的幾率是27.2%

Age是否SNP-PGD需要用于每個(gè)易位攜帶者?輔助生殖PGD與PGS技術(shù)ReciprocaltranslocationcarriersRobertsoniantranslocationcarriersD5-FISHSNParrayD3-FISHD5-FISHSNParrayD3-FISHTransfercycles29771751238125ClinicalpregnancyrateperET55.2%(16/29)63.7%(49/77)38.9%(68/175)83.3%(10/12)63.2%(24/38)38.4%(48/125)Implantationrate40%(16/40)59.5%(49/97)32.2%(86/267)59.1%(10/17)54.9%(28/51)28.1%(62/221)Miscarriagerate25.0%(4/16)8.16%(4/49)16.2%(11/68)0(0/10)12.5%(3/24)16.7%(8/48)ComparisonD5-FISHandd5-SNPresultsintranslocationcarriers<35yrs對于年輕的羅氏易位攜帶者，d5FISH能獲得d5SNP相似的臨床妊娠結(jié)局輔助生殖PGD與PGS技術(shù)新一代測序技術(shù)(NGS)正逐步興起婚前孕前植入前產(chǎn)前新生孕期指導(dǎo)新夫婦家庭計(jì)劃指導(dǎo)低成本同時(shí)檢測>40種代謝疾病，可覆蓋大規(guī)模人群建立國家和地區(qū)發(fā)病率數(shù)據(jù)庫

確認(rèn)診斷疾病，特別是稀有疾病疾病亞型分類，或鑒別相似表型的不同疾病，進(jìn)行有效干預(yù)

拯救嬰兒生命，使他們更健康減少對社會(huì)和家庭帶來的負(fù)擔(dān)減少出生缺陷指導(dǎo)意義NextGenerationSequencing(NGS)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)NGS-PGD/PGS技術(shù)路線WGASNParray檢測NGS檢測平行實(shí)驗(yàn)已知樣本非整倍體單個(gè)胚胎干細(xì)胞正常核型淋巴細(xì)胞FISH-PGD診斷為異常的胚胎重活檢淋巴細(xì)胞全基因組擴(kuò)增獲得產(chǎn)物臨床并行實(shí)驗(yàn)SNParray檢測NGS檢測建立平臺評估檢出率，準(zhǔn)確度等指標(biāo)，芯片與測序相當(dāng)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)方法學(xué)的建立2X測序深度能覆蓋60%人類基因組，10X深度能覆蓋>90%人類基因組。等位基因脫扣ADO率約5-20%；平均值為4%，近著絲粒區(qū)段發(fā)生ADO率相對較高。堿基對檢出誤差：C:G>T:A.Before&afterGCbias

correction專為單細(xì)胞測序CNV分析而設(shè)置的算法，矯正WGA產(chǎn)生的GC偏差，使結(jié)果更接近基因組DNA測序水平。

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)NGSvsSNParray在非整倍體與16M缺失重復(fù)的比較方法學(xué)的建立輔助生殖PGD與PGS技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)高通量，高準(zhǔn)確度：使用新一代測序技術(shù)，克服PCR技術(shù)通量低的缺點(diǎn)。不容易產(chǎn)生漏檢：可對所有23對染色體進(jìn)行檢測。FISH技術(shù)由于每一輪雜交的探針數(shù)目是有限的，無法對所有23對染色體進(jìn)行檢測，容易產(chǎn)生漏檢。自動(dòng)化程度高：測序數(shù)據(jù)通過SOAP比對，SegSeq軟件進(jìn)行分析輔助生殖PGD與PGS技術(shù)我們前期已建立了FISH、SNP芯片技術(shù)檢測染色體異常，并與華大合作建立了單細(xì)胞水平的全基因組測序。2012年8月誕生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女嬰。我中心完成的NGS-PGD/PGS工作輔助生殖PGD與PGS技術(shù)三、單基因病PGD輔助生殖PGD與PGS技術(shù)ESHREPGD工作組對擴(kuò)增基礎(chǔ)的PGD的

最佳實(shí)踐指南

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)單基因病PGD的流程1.預(yù)備實(shí)驗(yàn)1.1基因診斷1.2設(shè)計(jì)個(gè)性化方案1.3構(gòu)建單體型1.4基因組水平實(shí)驗(yàn)1.5淋巴細(xì)胞/廢棄胚胎細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)2.臨床實(shí)驗(yàn)2.1臨床前預(yù)備實(shí)驗(yàn)2.2臨床診斷3.產(chǎn)前診斷輔助生殖PGD與PGS技術(shù)1、等位基因脫扣（alleledropout,ADO）

影響PGD準(zhǔn)確性的主要因素之一，其發(fā)生率約為5-20%?？蓪?dǎo)致胚胎的誤診。導(dǎo)致ADO的原因目前仍未充分弄清。

解決辦法：

①采用多重PCR的方法，加入標(biāo)記位點(diǎn)的檢測；

②控制擴(kuò)增片段大小(<350bp)以及合適的引物設(shè)計(jì)；

③采用熒光PCR；

④提高變性溫度至96℃，選用合適的聚合酶；

⑤增加活檢細(xì)胞數(shù)等。

單基因病PGD中，著重解決等位基因脫扣和污染兩大問題輔助生殖PGD與PGS技術(shù)2、污染導(dǎo)致PGD診斷失敗和誤診的另一重要因素。污染主要來自透明帶上殘留的精細(xì)胞和母源的丘細(xì)胞以及前次試驗(yàn)擴(kuò)增的DNA殘留物我們的解決辦法：1）采用ICSI防止精細(xì)胞污染；2）防止丘細(xì)胞污染：A.操作中盡量去除卵細(xì)胞周圍的丘細(xì)胞。B.活檢的卵裂球在無污染的PBS或培養(yǎng)基中反復(fù)洗脫。C.采用多重PCR同時(shí)檢測活檢標(biāo)本及雙親的DNA指紋加以鑒別。3)防止外源DNA污染A.實(shí)驗(yàn)室物理分區(qū)；所有的試劑分裝，不反復(fù)凍融，耗材一次性使用。B.設(shè)立空白對照。C.在專用層流室中操作（如右圖）。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)育齡夫婦未采用任何避孕措施，1年或1年以上未能受孕，稱為不孕癥；雖有過妊娠，但均已流產(chǎn)或死胎，而未能獲得活嬰者，稱為不育癥。中國不孕不育人數(shù)大約5000萬,不孕不育的發(fā)生率12％~15％我們的研究發(fā)現(xiàn)，人類早期自然流產(chǎn)胚胎中超過50%發(fā)生了非整倍體異常。植入前遺傳學(xué)篩查背景----不孕癥和不育癥世界范圍內(nèi)不孕不育率高達(dá)15%，成為繼癌癥和心腦血管疾病之外，嚴(yán)重影響人類健康的第三大疾病。正常（例）重復(fù)（例）缺失（例）復(fù)雜異常（例）異常率（%）早孕期流產(chǎn)7526521393851.7中、晚孕期流產(chǎn)106173015.9總數(shù)16836691423850.4TanYQ,etal.Geneticchangesinhumanfetusesfromspontaneousabortionafterinvitrofertilizationdetectedbycomparativegenomichybridization.BiolReprod.2004Feb;70(2):495-9.Epub2003Oct15.第三部分植入前遺傳學(xué)篩查的臨床應(yīng)用輔助生殖PGD與PGS技術(shù)NewEnglandJournalofMedicine351(19):1927-1929，2004植入前遺傳學(xué)篩查背景----年齡與生育關(guān)系文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)隨著女性年齡的升高，流產(chǎn)率逐漸升高，生育率急劇下降。我中心2012年-2013年間不同年齡階段的296對夫婦共1016枚檢測胚胎異常率統(tǒng)計(jì)，新發(fā)生染色體異常率隨女方年齡的增長而升高。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)植入前遺傳學(xué)篩查背景--染色體異常與胚胎發(fā)育染色體異常是引起胚胎發(fā)育能力降低的重要原因，也是出生缺陷的重要原因。據(jù)報(bào)道，體外培養(yǎng)的D3分裂期卵裂球有50%-70%概率出現(xiàn)染色體異常，其出現(xiàn)頻率隨母方年齡增加而增加。即使發(fā)育到D5囊胚期，仍有40%概率出現(xiàn)染色體異常。傳統(tǒng)的胚胎形態(tài)學(xué)評價(jià)體系不能反映胚胎的遺傳學(xué)真實(shí)情況。據(jù)報(bào)道，在形態(tài)學(xué)良好的胚胎中，僅42%的胚胎是染色體完全正常的。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)植入前遺傳學(xué)篩查的概念PGS(Preimplantation

Genetic

Screening)指對在胚胎發(fā)育中散在發(fā)生的染色體非整倍體異常進(jìn)行篩查，以幫助篩選染色體水平上最佳胚胎，理論上可以提高試管嬰兒的著床率和活產(chǎn)率。PGS適應(yīng)征：針對高齡女性、反復(fù)植入失敗者，曾有染色體異常兒妊娠史、反復(fù)自然流產(chǎn)、嚴(yán)重男性因素不育等早期PGS應(yīng)用的技術(shù)：熒光原位雜交(FISH)JoyceHarper,etal2011輔助生殖PGD與PGS技術(shù)FISH技術(shù)的改進(jìn)增加FISH探針的顏色以及數(shù)量(為了易于區(qū)分避免色差，至多可選擇5色同時(shí)雜交)。增加雜交次數(shù)：對細(xì)胞核信號洗脫后重復(fù)雜交(一個(gè)細(xì)胞核最多可承受三次洗脫重雜交)進(jìn)行雙卵裂球活檢？輔助生殖PGD與PGS技術(shù)代表性文章1994

Grif?nDK,etal.Clinicalexperiencewithpreimplantationdiagnosis

ofsexbydual?uorescentinsituhybridisation.JAssReprodGenet

11,132–143.(首次使用雙重雜交)2006

WeierJF,etal..Molecularcytogeneticstudiestowardsthefullkaryotypeanalysisofhumanblastocystsandcytotrophoblasts.CytogenetGenomeRes.2006;114(3-4):302-11(對24色FISH的嘗試)2009

CollsP,etal.Increasedefficiencyofpreimplantationgeneticdiagnosisforaneuploidybytesting12chromosomes.ReprodBiomedOnline,19(4):532-538.(首次用到FISH-PGD檢測12條染色體)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)以FISH技術(shù)和第三天活檢為基礎(chǔ)的PGS

----并未顯示能提高分娩率卵裂期使用FISH技術(shù)的隨機(jī)對照試驗(yàn)檢測了不同數(shù)目的染色體：Staessenetal,2008Meyeretal,2009Mersereauetal,2008Blockeeletal,2008Debrocketal,2010Hardarsonetal,2008Schoolcraftetal,2009…………沒有一個(gè)實(shí)驗(yàn)顯示能增加分娩率，甚至部分研究顯示分娩率顯著下降。輔助生殖PGD與PGS技術(shù)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)1.僅能檢測少數(shù)染色體(至多12條)；2.商業(yè)檢測探針多位于染色體亞端粒區(qū)(長短臂末端)，不能定位染色體斷裂位點(diǎn)；3.信號強(qiáng)度易受到固定效果、探針靈敏度、背景干擾以及雜交程度等的影響；文獻(xiàn)報(bào)道FISH誤診率約7~10%?？赡艿脑?？分裂期卵裂球高度的染色體異常嵌合，導(dǎo)致檢測細(xì)胞不能很好代表整個(gè)胚胎；卵裂期活檢過程本身可能對胚胎發(fā)育潛能產(chǎn)生危害和負(fù)面影響選擇合適的活檢時(shí)間全染色體篩查的方法更多RCTs研究更為有效的PGS技術(shù)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)卵裂期活檢

-損傷胚胎發(fā)育潛能的風(fēng)險(xiǎn)--

Tan

YQ.,etal.HumRerpod.2013;28(9):2581-2592D3活檢影響囊胚發(fā)育輔助生殖PGD與PGS技術(shù)卵裂期活檢

-損傷胚胎發(fā)育潛能的風(fēng)險(xiǎn)卵裂期FISH囊胚期FISH平衡易位羅氏易位平衡易位羅氏易位移植1751256842移植妊娠率32%（n=86）28%（n=62）65%(n=44)84%(n=27)流產(chǎn)率12.79%(n=11)12.90%(n=8)9.23%(n=6)7.41%(n=2)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)所有患者同時(shí)移植兩枚胚胎，一枚來自卵裂期或囊胚期活檢的胚胎，一枚來自未活檢的胚胎，采用DNA指紋鑒定妊娠胚胎的來源。—2013卵裂期活檢

-損傷胚胎發(fā)育潛能的風(fēng)險(xiǎn)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)囊胚期活檢較卵裂期活檢對胚胎的發(fā)育潛能影響更?。宦蚜哑诨顧z

-損傷胚胎發(fā)育潛能的風(fēng)險(xiǎn)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)嵌合對PGS診斷的影響胚胎染色體嵌合現(xiàn)象的概率在25-80%之間，概率范圍大是由于各研究使用胚胎來源、胚胎發(fā)育階段及染色體檢測方法的差異。

胚胎嵌合現(xiàn)象示意圖輔助生殖PGD與PGS技術(shù)In1993chromosomalmosaicismwasdescribedinhumanpreimplantationembryosforthefirsttime.

---Delhantyetal.1993早期胚胎染色體嵌合的發(fā)生率conclusions:Diploid–aneuploidmosaicismisbyfarthemostcommonchromosomalconstitutioninsparehumanpreimplantationembryosafterIVF.Thisunderminesthereliabledeterminationoftheploidystatusofacleavage-stageembryobasedontheanalysisofasinglecell.Futureresearchshoulddeterminetheoriginanddevelopmentalpotentialofmosaicembryos只有9％的胚胎有完全正常的卵裂球--NatMed2009輔助生殖PGD與PGS技術(shù)隨著胚胎的發(fā)育，嵌合體胚胎比例逐漸降低。ThefateofthemosaicembryochromosomalconstitutionanddevelopmentofDay4,5and8humanembryos.SantosMA,etal.HumanReproduction,Vol.25,No.8pp.1916–1926,2010嵌合對PGS診斷的影響輔助生殖PGD與PGS技術(shù)>40%aneuploidcells

<25%aneuploidcells

25-40%aneuploidcells

FISHreanalysisofinnercellmassandtrophectodermsamplesofpreviouslyarray-CGHscreenedblastocystsshowshighaccuracyofdiagnosisandnomajordiagnosticimpactofmosaicismattheblastocyststage,AntonioC,etal.HumanReproduction,Vol.0,No.0pp.1–10,2013真正會(huì)影響到移植風(fēng)險(xiǎn)的嵌合胚胎發(fā)生率僅為5%.因?yàn)榻^大多數(shù)非整倍體異常在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層中共同發(fā)生。而在滋養(yǎng)層細(xì)胞中可能嵌合存在更多異常。嵌合對PGS診斷的影響輔助生殖PGD與PGS技術(shù)如何理解卵裂期活檢的影響（Timelapse分析）正常卵裂球的移除進(jìn)一步影響胚胎發(fā)育的潛能異常卵裂球的存在影響胚胎的正常診斷輔助生殖PGD與PGS技術(shù)囊胚活檢有替代卵裂期活檢的趨勢作者認(rèn)為：卵裂球活檢仍相對更加損傷胚胎，臨床結(jié)局顯示囊胚活檢應(yīng)是最為合適的植入前遺傳學(xué)檢測的活檢時(shí)期。FertilSteril.2013Sep;100(3):608-14.doi:10.1016/j.fertnstert.2013.07.004.輔助生殖PGD與PGS技術(shù)極體活檢—風(fēng)險(xiǎn)最低的活檢方法極體活檢對胚胎沒有損傷，隨著極體染色體檢測技術(shù)的進(jìn)步，如更精確而且便宜的測序技術(shù)的應(yīng)用，極體活檢將成為未來PGD/PGS中一項(xiàng)非常有前景的技術(shù)。

輔助生殖PGD與PGS技術(shù)討論：極體活檢vs囊胚活檢？避免嵌合的影響不影響未來的胚胎僅檢測減數(shù)分裂錯(cuò)誤而未評估有絲分裂錯(cuò)誤，而有絲分裂可能修復(fù)減數(shù)分裂錯(cuò)誤

能分析來自父母雙方的異常嵌合(滋養(yǎng)外胚層可能不能代表內(nèi)細(xì)胞團(tuán))

囊胚培養(yǎng)和玻璃化冷凍美國的NathanTreff代表與歐洲的JoepGeraedts達(dá)成了許多共識：極體活檢與囊胚活檢各有優(yōu)勢，不再建議進(jìn)行卵裂期活檢輔助生殖PGD與PGS技術(shù)WilladsenSetal.Hum.Reprod.1999;14:470-475早年P(guān)GS嘗試：利用動(dòng)物MII卵構(gòu)建人卵裂球分裂相技術(shù)難度大，構(gòu)建成功率低，無法實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用。全染色體組篩查技術(shù)輔助生殖PGD與PGS技術(shù)全染色體組篩查技術(shù)FISH:

9-11條chr所有23對人染色體都需要篩查CGH-比較基因組雜交aCGH:基因組雜交芯片MicroarraySNPRealTimePCRNextGenerationSequencing輔助生殖PGD與PGS技術(shù)全染色體篩查技術(shù)進(jìn)展1996SermonK.,etal.Adaptationoftheprimerextensionpreamplification(PEP)reactionforpreimplantationdiagnosis:singleblastomereanalysisusingshortPEPprotocols.MolHumReprod.1996;2(3):209-212.

(最早用全基因組擴(kuò)增法進(jìn)行PGD，但僅篩查幾個(gè)基因)1999WellsD.,etal.Detailedchromosomalandmoleculargeneticanalysisofsinglecellsbywholegenomeamplification.NucleicAcidsRes,27:1214-1218.

(首次使用單細(xì)胞mCGH做PGS)2005KnijnenburgJ.,etal.Rapiddetectionofgenomicimbalancesusingmicro-arrayconsistingofpooledBACscoveringallhumanchromosomearms.NucleicAcidsRes.2005;12(33):e159.(首次用aCGH做PGS)2007TreffNR.,etal.Accurate23chromosomeaneuploidyscreeninginhumanblastomeresusingsinglenucleotidepolymorphism(SNP)microarray.FertilSteril,2007;86:s217.

(首次用SNParray做PGS)2013EricJ.Forman,etal.Comprehensivechromosomescreeningalterstraditionalmorphology-basedembryoselection:aprospectivestudyof100consecutivecyclesofplannedfresheuploidblastocysttransfer

(首次用qPCR做PGS)2013ChunleiZhang,etal.ASingleCellLevelBasedMethodforCopyNumberVariationAnalysisbyLowCoverageMassivelyParallelSequencing

(首次用NGS做PGS)Pubmed總體能夠搜索到2881篇文獻(xiàn)，自2002年至今，每年平均有176篇