菜心品種純度鑒定簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)法規(guī)程

菜心品種純度鑒定簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)法規(guī)程本文件規(guī)定了菜心品種純度鑒定的實(shí)驗(yàn)方法。本文件適用于利用簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)法（ISSR）對(duì)大豆種子品種鑒定的實(shí)驗(yàn)過(guò)程。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)experimentalidentification根據(jù)某個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（微衛(wèi)星位點(diǎn)）設(shè)計(jì)出一系列特異引物，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)間隔的堿基順序的分子標(biāo)記和檢測(cè)方法。3.2引物primer一條互補(bǔ)結(jié)合在模板DNA鏈上的短的單鏈，提供3’一OH末端作為DNA合成的起點(diǎn)，延伸合成模板DNA的互補(bǔ)鏈。3.3微衛(wèi)星DNAmicrosatelliteDNA是一類由幾個(gè)核苷酸（一般為1個(gè)、5個(gè)）為重復(fù)單位的長(zhǎng)達(dá)幾十至幾百個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。4原理DNA是生物體的遺傳基礎(chǔ)，攜帶所有的遺傳物質(zhì)，從DNA分子水平上進(jìn)行鑒別是區(qū)分物種、品種甚至個(gè)體之間差異最為有效的方法。利用PCR技術(shù)可將DNA片段在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增幾十甚至幾百萬(wàn)倍，從而達(dá)到可以檢測(cè)的目的。ISSR方法是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)方法，是根據(jù)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（微衛(wèi)星位點(diǎn)）設(shè)計(jì)出一系列特異引物，包括雙核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等為重復(fù)單位的微衛(wèi)星DNA片段（一般為20個(gè)堿基），通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)及其間隔區(qū)，以檢測(cè)其擴(kuò)增片段的多態(tài)性。5環(huán)境條件5.1溫度：15℃、25℃;5.2濕度：相對(duì)濕度（RH）≤50％。2T/GXASXXXX—20206儀器設(shè)備6.1PCR擴(kuò)增儀。6.2紫外分光光度計(jì)。6.3高速臺(tái)式離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不小于15000r/min。6.4多用電泳儀及水平式電泳槽。6.5紫外透射儀。6.6微量移液器。6.7電子天平：分度值為0.0001g。6.8磁力加熱攪拌器。6.9凝膠成像系統(tǒng)。6.10超純水系統(tǒng)。6.11滅菌鍋。6.12酸度計(jì)。6.13微波爐。6.14恒溫水浴鍋。6.15恒溫干燥箱。6.16離心管。6.17研缽。6.18移液器吸頭。6.19容量瓶。6.20燒杯。6.21三角燒瓶。6.22PE手套。6.23錫箔紙。6.24封口膜。7試劑7.1TaqDNA聚合酶：保存條件為20℃±2℃。7.210×Buffer：保存條件為20℃士2℃。7.3四種脫氧核苷酸（4×dNTP)：保存條件為20℃士2℃。7.4Mg2+：保存條件為20℃士2℃。7.5RNA酶：保存條件為20℃士2℃。7.6瓊脂糖。7.7三羥甲基氨基甲烷。7.8溴酚藍(lán)。7.9二甲苯青FF。7.108·羥基喹啉。7.11十二烷基磺酸鈉。7.12溴化乙錠。7.13異戊醇。7.14結(jié)晶酚。7.15三氯甲烷。7.16硼酸；7.17蔗糖。7.18無(wú)水乙醇。7.19鹽酸。7.20氯化鈉。7.21去離子水。8鑒定步驟8.1高壓滅菌將欲滅菌的離心管放入燒杯中，用錫箔紙封口，移液器吸頭裝在吸頭盒內(nèi)，配好的試劑裝入試劑瓶中，蓋好蓋，放入滅菌鍋中。首先將壓力升至1Pa，放氣，再將壓力重新升至1Pa，開始計(jì)時(shí)，20min后，將電源關(guān)閉。待壓力為零時(shí)，取出離心管、吸頭及試劑瓶，待用。8.2溶液配制相關(guān)溶液配制方法見附錄A。8.3DNA的提取具體步驟如下：a)取新鮮或冷凍葉片100mg，放在1.5ml離心管中，加入1000勻漿緩沖液浸泡4h，倒入研缽中充分研磨，將研磨產(chǎn)物倒入1.5ml離心管中，取少量勻漿緩沖液沖洗研缽，一并倒入離心管中，離心（轉(zhuǎn)速為4000r/min）10min，將上清液移至新的1.5ml離心管中，棄沉淀。b)加入與上清液等體積的飽和酚，緩慢顛倒離心管20min，不應(yīng)該劇烈振蕩。離心（轉(zhuǎn)速為8000r/min)10min，將上清液移至新的離心管中。c)加入與上清液等體積的酚一三氯甲烷一異戊醇（體積比為24:23:1)，離心（轉(zhuǎn)速為8000r/min)10min，將上清液移至新的離心管中。d)加入與上清液等體積的三氯甲烷一異戊醇（體積比為23:1)，緩慢顛倒10min，離心（轉(zhuǎn)速為8000r/min)10min，取上清液至新的離心管中。e)加入上清液二倍體積的冰冷乙醇，水平旋轉(zhuǎn)離心管50圈、100圈，即可出現(xiàn)白色絮狀DNA。f)將離心管置于20℃冰箱中30h，取出后離心（轉(zhuǎn)速為8000r/min)10h，形成白色沉淀。g)倒掉離心管中的液體，加入1mL75％乙醇，離心（轉(zhuǎn)速為15000r/min)5min，倒掉乙醇，倒置在干凈的吸水紙上，吸干液體。h)將離心管置于恒溫干燥箱（40℃、50℃)中20min或置于通風(fēng)處40min。i)加入100LTE緩沖液和RNA酶2L，水浴（55℃士2℃)12h，使DNA沉淀充分溶解，4℃冰箱中保存。8.4DNA濃度檢測(cè)8.4.1紫外吸收檢測(cè)DNA分子中的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)能夠吸收紫外光。DNA的紫外吸收高峰在波長(zhǎng)260nm處，蛋白質(zhì)的紫外吸收高峰在波長(zhǎng)280nm處。取提取的DNA溶液5L，加水995L，放人比色杯中，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，4T/GXASXXXX—2020記下260nm和280nm下的OD值，計(jì)算出DNA的濃度以及(1)60和01)80的比值。DNA的0D260/OD280宜在1.8，1.5以上也可用于ISSR叩CR分析，若比值太小應(yīng)重復(fù)8.3中a）～i）步驟繼續(xù)抽提。8.4.2DNA濃度計(jì)算按公式（1)計(jì)算：D=50×1000×OD260×s……(1)式中：D——DNA的濃度，單位為納克每微升（ng/μL）；S——稀釋倍數(shù)。8.5凝膠電泳檢測(cè)將制備好的濃度為0.7‰的瓊脂糖凝膠放入電泳槽中，使點(diǎn)樣孔處于電源負(fù)極端，加入沒過(guò)膠面1mm深的足量電泳緩沖液（0.5×TBE）。取DNA溶液10L和凝膠加樣緩沖液2L，在封口膜上用微量移液器上下吸打混勻，加入到點(diǎn)樣孔中（注意避免出現(xiàn)氣泡）。打開電源，將電壓控制在5V/cm,電泳1h，取出凝膠，放在紫外透射儀上觀察。若DNA質(zhì)量好、分子量高50kb）且無(wú)降解，在點(diǎn)樣孔附近呈現(xiàn)一條致密亮帶；若DNA部分降解，則呈連續(xù)分布狀態(tài)多若嚴(yán)重降解，則看不到大片段DNA，只能在遠(yuǎn)離加樣孔的地方看到RNA。8.6ISSR擴(kuò)增8.6.1反應(yīng)成分25反應(yīng)體系中，含有1XBuffer,1.5mmol/LMg2+，200μmoI/LdNTP,1UTaqDNA聚合酶，1μmoI/L引物，100ng模板DNA,加水至25μL。按上述比例將反應(yīng)液依次加入0.2mL離心管中，放人PCR儀中，進(jìn)行PCR循環(huán)。8.6.1.1循環(huán)過(guò)程94℃預(yù)變性7min；94℃變性30s,48℃退火45s，45個(gè)循環(huán)；72℃延伸s；72℃延伸7min；4℃冷卻。8.7電泳檢測(cè)將制備好的濃度為2％的瓊脂糖凝膠放人電泳槽中，使點(diǎn)樣孔處于電源負(fù)極端。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL和凝膠加樣緩沖液2L，在封口膜上用微量移液器上下吸打混勻，加入到點(diǎn)樣孔中。打開電源，將電壓控制在3V/cm,電泳4h，切斷電源，取出凝膠，在凝膠成像上掃描。8.8鑒定將待測(cè)品種的凝膠成像結(jié)果與該品種原種的標(biāo)準(zhǔn)譜帶相比較，從而鑒定出該品種的真實(shí)性。（規(guī)范性附錄）緩沖液和主要試劑的配制A.1勻漿緩沖液的配制A.1.1取1mol/LTris.CI(pH8.0）200mL、0.5mol/LEDTA(pH8.0）50mL和0.5gSDS,加水至100mL。使用前應(yīng)保證SDS充分溶解，若出現(xiàn)結(jié)晶，應(yīng)放在50℃水浴中溶解10min。A.1.21mol/LTris·Cl(pH8.0)：稱取12.11gTris，溶于80mL水中，用濃HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL，高壓滅菌。A.1.30.5mol/LEDTA(pH8.0):稱取18.61gEDTANa2·2H20，溶于80mL水中，在磁力加熱攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH2g左右調(diào)節(jié)溶液的pH值至8.0，加水定容至100mL，高壓滅菌。A.2飽和酚的制備飽和酚的制備宜在通風(fēng)櫥或通風(fēng)良好的條件下進(jìn)行。A.3TE緩沖液的配制A.3.11mol/LTris.CI(pH7.6稱取12.11gTris，溶于80mL水中，用濃HCI調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.6，加水定容至100mL，高壓滅菌。A.3.20.5mol/LEDTA(pH8.O):同A.1.3。A.4RNA酶(10mg/mL）的配制稱取RNA酶1mg,溶于100TE緩沖液中，70℃水浴10min，緩慢冷卻至室溫。A.5瓊脂糖凝膠的配制A.5.1將100ml瓊脂糖凝膠溶液（濃度一般為0.82在微波爐中融化，加入5μLGoldView，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，冷卻至不燙手時(shí)倒入已封口并放好梳子（距底板1.0mm左右）的載膠板上，凝膠厚度在3mm、5mm為宜，待凝膠完全凝固后放入電泳槽中備用。