不同來源的翹鱗香菇形態(tài)特征研究及交配型b位點(diǎn)解析

MorphologicalandBmating-typelocusanylysisofLentinns

squarrosulus

ABSTRACT

Ediblefungiasahealthyfood,whichislowinfatcontentandrichindietaryfiberand

protein,areverypopularamongconsumers.Lentinussquarrosuluswithbigmarketpotential

isonekindofrecentlydevelopedfungusstrains.

Themainfindingsofthisstudyareasfollows:

1.Fromthecultivatingresultof8wildstrainsofLentinussquarrosulus.Wegetthe

growingconditionofthiskindofmushroom.Thetemperatureis34chigherthanthatof

Lentinulaedodes.Thus,otherconditionsaresimilartothegrowingconditionsofLentinula

edodes.Temperaturechangingandclourchangingintodarkareneededforfruitbody

growing.Wegetfruitbodiesfromonly6strains.Thereare3kindsofthefruitbodies.

2.ITSregionof8strainsandLentinulaedodes135strainwereamplifiedbyPCR,

sequencedandcompared.Theresultindicatedthatthereare3groupsbetweentheITSregions

ofLentinussquarrosuluswasequaltotheresultofcultivatingandprovedthatstudying

ITSregioncanhelpusknowthedifferencesbetweendifferentstrains.

3.BydegeneratePCRoftwodikaryonstrains0826,QL7-6,whichweremorphological

diversity.Weobtainedtwopheromonereceptorgenes.Itwasidentifiedthatthetwo

pheromonereceptorssharedthehomology.

4.Thereareincompatibilityfactors:AandBfactors,whichcontroltheirmating,in

tetrapolarheterothallicmushroom.BymeansofdegeneratePCRandgenewalking,wecloned

thepheromonereceptorgeneonBmating-typeloci.Weobtainedonepheromonereceptor

geneLS-rcbl-BlfromthesporemonokaryonstrainNO.2ofL.squarrosulusstrainNO.7-4;

somesequencesofpheromonereceptorgeneLS-rcb2-B2fromthesporemonokaryonstrain

NO.5ofL.squarrosulusstrainNO.7-4.BasedtheDNAsequencesofpheromonereceptor

genefromBmatingtypefactorinL.squarrosulus,wedesignedtwogroupsofspecific

primers:rcbl-Bl-F,rcbl-Bl-R；rcb-B2-l,rcbl-B2-R,toamplifythefragmentofpheromone

receptorfromtheprotoplastmonokaryonstrainsandsporemonokaryonstrains.Weobtained

thepheromonereceptorfragmentfrommonokaryonstrainswiththematingtypefactorBl

usingspecificprimersrcbl-Bl-Frcbl-Bl-R;alsoobtainedthepheromonereceptorfragment

piiiiDIN.ID。ii_9irii_9ir\,IOMU4_iCMI□乙r\,2amrmyudiiagiiiDI11uer11

RrnmnnarfirAPtnrfnmthAPrntnPlaatmnnnkarvnnRITAinaandsPnrAmnnnkarvnnatcina

frommonokaryonstrainswiththematingtypefactorB2usingspecificprimersrcb-B2-F

rcbl-B2-R.

5.ThepheromonereceptorgeneencodedbyLS-rcbl-Blwereseventransmembrane

proteinsfollowingtheanalysisusingtheTMpredsoftware.Phylogeneticanalysisonamino

acidsofpheromonereceptorgeneLS-rcbl-Blaswellasother15kindsofbasidiomyceteswas

donebyusingtheNJmethodinPHYLIPsoftwarepackage.Theresultshowedthatthe

LentinussquarrosulussharedthesameclusterwiththeLentinulaedodes.

KEYWORDS:Lentinussquarrosulus,ITS,Bmating-typelocus,pheromonereceptor,

chromosomewalking

目錄

第一章緒論.........................................................1

1.翹鱗香菇的概況..................................................1

2.食用菌育種技術(shù)概況..............................................2

3.食用菌品種鑒定方法..............................................5

4.擔(dān)子菌交配型因子的研究進(jìn)展......................................7

5.課題的提出及意義...............................................12

第二章翹鱗香菇的形態(tài)學(xué)特征分析....................................13

2.1引言............................................................13

2.2材料與方法.....................................................13

2.3結(jié)果與分析.....................................................15

2.4討論.......................18

第三章翹鱗香菇ITS序列分析........................................20

3.1弓|言...........................................................20

3.2材料與方法.....................................................20

3.3結(jié)果與分析.....................................................24

3.4討論...........................................................27

第四章翹鱗香菇B交配型位點(diǎn)解析...................................28

4.1引言...........................................................28

4.2材料與方法.....................................................28

4.3結(jié)果與分析.....................................................32

4.4討論...........................................................45

第五章總結(jié)........................................................49

5.1本課題的結(jié)論...................................................49

5.2本課題創(chuàng)新點(diǎn)...................................................49

5.3存在的問題及展望...............................................50

參考文獻(xiàn).......................................................51

附錄...............................................................56

碩士期間發(fā)表論文及學(xué)術(shù)活動情況.....................................60

致謝..............................................................61

-6

32二口—T八

析...................................................................

東華人學(xué)碩I?論文

第一章緒論

食用菌以其獨(dú)特的生物學(xué)特性和生產(chǎn)方式成為農(nóng)業(yè)中的一個新型產(chǎn)業(yè)，越來

越受到人們的重視。1973年能源危機(jī)以后，喚醒了人們對農(nóng)業(yè)、工業(yè)廢棄物利用

的重視，在全球范圍內(nèi)開始利用農(nóng)作物秸稈、棉子殼、木屑等廢棄物質(zhì)米栽培食

用菌，通過生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)人類需要的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)并解決環(huán)境污染等問題。在中

國，自上個世紀(jì)80年代以來，隨著人工栽培食用菌技術(shù)的不斷進(jìn)步和推廣，以及

國民食品消費(fèi)結(jié)構(gòu)與層次的改善和提高，人工栽培食用菌迅猛發(fā)展。中國已成為

世界上的食用菌栽培量、加工、貿(mào)易最大國家。目前全國有直接從業(yè)人員1860

余萬人；生產(chǎn)品種90多個，產(chǎn)量1100多萬t,產(chǎn)值480億人民幣，出口60萬t,創(chuàng)

匯9億多美元。食用菌已經(jīng)躍居我國繼糧、棉、油、果、菜之后的第六大農(nóng)副產(chǎn)

品和重要的創(chuàng)匯農(nóng)產(chǎn)品。同時，伴隨著品種優(yōu)良化，栽培標(biāo)準(zhǔn)化和市場品牌化進(jìn)

程，食用菌生產(chǎn)在我國已早現(xiàn)產(chǎn)、小化發(fā)展態(tài)勢，已成為大農(nóng)業(yè)的一個重要組成部

分⑴。

食用菌中蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、維生素及微量元素含量豐富，是一類珍貴

的保健食品⑵。近年來，國內(nèi)外對食用菌中活性物質(zhì)的研究取得了一些成果，學(xué)

者們的研究主要在食用菌中蛋白質(zhì)的抗病毒、抗腫瘤和多糖抗腫瘤及作為癌癥輔

助治療藥劑等方面⑶。

1.翹鱗香菇的概況

1.1翹鱗香菇的分類地位

翹鱗香菇是一種新近開發(fā)的具有很大市場潛力的食用菌新品種，它屬真菌

界(Eumycota)、擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina)、擔(dān)子菌綱(Eubasidiomycetes)、

層菌亞綱(Hymenomycetiae)、多孔菌目(Polypo-rales)、香菇科(Lcntinaceae)、香

菇屬(Lentinus),Lentinussquarrosulus?翹鱗香菇，又稱獐子菌、仲

帽、獐頭菌，子實(shí)體中等至大型。

1.2翹鱗香菇的形態(tài)特性和分布

翹鱗香菇的菌蓋初期突起，后扁平，中部臍狀或下凹，有時呈淺漏斗狀，

淺粉灰色，表面有暗灰色到黑褐色瓦狀大鱗片，趨向中央特別大并翹起，呈同

心環(huán)狀排列，菌蓋直徑6-10cm,故稱翹鱗香菇。菌肉近白色，菌柄中生或稍偏

生，上下等粗或基部膨大，中實(shí)、平滑、淡白色，后期變淡褐色。翹鱗香菇屬

于近裸香菇I’】(白斗菇，八擔(dān)柴菇，翹鱗香菇，白菇，白香菇，鱗斗菇)生于

混交林或闊葉林的腐木、木樁及鐵道枕木上。是熱帶國家例如馬來西亞、尼日

尼亞等國較為常見的一種天然食用菌，翹鱗香菇在我國主要分布于貴州、云南、

廣東、廣西、海南、福建、西藏、臺灣。

東華大學(xué)碩I:論文

1.3翹鱗香菇的栽培現(xiàn)狀

翹鱗香菇是新近開發(fā)的具有很大市場潛力的食用菌新品種，鑒丁翹鱗香菇在

熱帶地區(qū)雨季（4-10月）才可見，野生較多，大規(guī)模為其人工培養(yǎng)的很少見。

1.4翹鱗香菇的食藥用價值

尼日尼亞學(xué)者Gbolagade⑸指出翹鱗香菇子實(shí)體有降低血中膽固醇的作用，

并含有較豐富的多糖類物質(zhì)，其含有的蛋白質(zhì)可以是動物蛋白的替代品，在尼R

尼亞的鄉(xiāng)村居民和買不起肉的人群中非常受歡迎。翹鱗香菇在幼嫩時味道鮮美，

但老后或雨多浸濕者帶苦味。

本課題組人員用體外細(xì)胞模型，對翻鱗香菇的菌絲體和子實(shí)體的醇提物和水

提物進(jìn)行了腫瘤細(xì)胞抑制實(shí)臉和免疫活性調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)，顯示翹鱗香菇菌絲體和子實(shí)

體的醇提物體外抑制腫瘤細(xì)胞生長有一定作用。目前，對翹鱗香菇的研究正處在

起步階段，我們深信，隨著研究的不斷深入，翹鱗香菇將更加受到人們的關(guān)注，

并展現(xiàn)出更廣闊的前景。

2.食用菌育種技術(shù)概況

優(yōu)良品種是保證食用菌產(chǎn)業(yè)稔步，健康發(fā)展的基礎(chǔ)。隨著人們對食用菌營養(yǎng)

價值和藥用價值認(rèn)識的提高以及食用菌產(chǎn)業(yè)所帶來的經(jīng)濟(jì)效益的增加，育種工作

便成為受關(guān)注的熱點(diǎn)之一，主要的育種手段有人工選擇育種，雜交育種，原生質(zhì)

體融合及基因工程育種。

2.1人工選擇育種

本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)階段的翹鱗香菇育種方法就是人工選擇育種進(jìn)行馴化栽培。人工

選擇育種是指采用人丁方法，定向選擇自然條件下發(fā)生的有益變異并使其不斷積

累，從而獲得獲得所需的新品種。

人工選擇育種可以通過收集野生資源，對其進(jìn)行馴化栽培，或者對引進(jìn)品種

進(jìn)行適應(yīng)性栽培試驗(yàn)，盡而篩選優(yōu)良菌株并加以保存和推廣應(yīng)用。我國福建三明

真菌研究所于1993年首次從臺灣農(nóng)業(yè)試驗(yàn)所的彭金騰教授處引進(jìn)原產(chǎn)歐洲的杏

鮑菇菌株，之后又收集和分離了10個來自世界各地的杏鮑菇菌株⑹，把杏鮑菇自

然季節(jié)栽培技術(shù)推廣至我國。王淑芳等⑺通過定向馴化試驗(yàn)選育出了杏鮑菇優(yōu)良

品種HRX。優(yōu)良的香菇品種7401、7402、7405、廣香5號、廣香7號、廣香9號、

241和8210等均是通過人工選擇法篩選得到的⑻。

需要指出的是人工選擇不能改變個體基因型，它只是利用并積累自然條件下

發(fā)生的有益變異。此外，山環(huán)境條件引起的非遺傳變異，并不能得到保留，而且

此種方法既費(fèi)時又費(fèi)力。但是，人工選擇育種是食用菌發(fā)展初期選育優(yōu)良品種簡

單而有效的方法之一，是各種育種方法的基礎(chǔ)。

2

東華大學(xué)碩I論文

今后乃至很長的一段時間，充分利用新技術(shù)和新方法，全面系統(tǒng)地對我國豐

富的食用菌野生資源和栽培品種進(jìn)行調(diào)查、采集、分離、保臧和種性研究（包括

外部形態(tài)、生理習(xí)性、營養(yǎng)價值、遺傳特性），以滿足人工選擇育種需要足夠的

野生菌種資源和選擇可遺傳的有益變異的需要陰，也是一個很重要的研究方向。

以下幾種方法雖然在食用菌育種工作中已經(jīng)比較普遍，但是目前還沒有關(guān)于

下述育種方法在翹鱗香菇育種中的報(bào)道。

2.2誘變育種

誘變育種是利用物理或化學(xué)誘變劑處理樣品細(xì)胞群體，提高其突變率，然后

從群體中選出符合育種目標(biāo)的突變株。物理誘變劑有非電離輻射類的紫外線、激

光以及能引起電離輻射的X-射線、丫一射線和快中子等；化學(xué)誘變劑主要是烷化

劑、堿基類似物、口丫唯類化合物，它們的誘變機(jī)理均為引起基因突變〔此⑴。目前，

以菌絲片段和原牛質(zhì)體為誘變材料,通過y-射線、紫外線、激光和太空輻射后，

食用菌生理生化和遺傳特性發(fā)生變化及新品種選育研究的報(bào)道較多。

輻射誘變育種技術(shù)相對人工選擇育種來說操作要簡單一些，且提高了食用菌

遺傳突變的機(jī)率，為選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗的食用菌品種提供了新的途徑。但由

于整個基因組在誘變時都接受同樣處理，也會產(chǎn)生一些不利突變，有益變異的機(jī)

率相當(dāng)小，選育工作量還是相當(dāng)龐大，目前在食用菌高產(chǎn)菌株的誘變育種中，成

效特別顯著的例子還為數(shù)不多。

2.3原生質(zhì)體融合育種

20世紀(jì)60年代出現(xiàn)了原生質(zhì)體融合技術(shù)，是指通過破壁得到的不同遺傳類型

的原生質(zhì)體，在融合劑的誘導(dǎo)下融合，最終達(dá)到部分或整套基因的交換和重組，

從而獲得重組子，產(chǎn)生新的品種和類型。它在食用菌品種選育上的應(yīng)用，能使食

用菌遠(yuǎn)緣雜交、相同交配型雜交及共生菌根菌的馴化栽培成為可能。它為利用野

生種質(zhì)資源、擴(kuò)大現(xiàn)有栽培種基因、縮短育種周期、提高工作效率開辟了一個新

途徑。但是，食用菌原生質(zhì)體融合育種技術(shù)的進(jìn)展同其他生物相比，要落后很多，

食用菌不同科、屬或種間原生質(zhì)體融合研究只不過是最近15年左右的事情。

原生質(zhì)體融合技術(shù)是在細(xì)胞水平上使親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的不同種屬間物種的遺

傳物質(zhì)進(jìn)行交換，擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)交流的范圍，增加了變異創(chuàng)造的途徑和選擇范

圍。但屬間融合子穩(wěn)定性差、生產(chǎn)性能不佳，在目前甚至今后較長的一段時間內(nèi)

要獲得突破有一定的難度［⑵。

2.4基因工程育種

基因工程是在基因水平上的遺傳操作，它是采取一定的方法從某一供體生物

中提取所需要的基因，在離體條件下用適當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶切割，再與載體

連接起來并一起導(dǎo)入受體生物細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)，從而選育出新品種，它是

3

東華大學(xué)偵I:論文

人們在分子生物學(xué)理論指導(dǎo)卜自行設(shè)計(jì)基因藍(lán)圖，可實(shí)現(xiàn)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的菌株間

雜交，比常規(guī)育種優(yōu)越很多的定向育種新技術(shù)。

基因工程育種的大致過程為先利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行雜交親本的選

擇、雜交種的鑒定及親子遺傳相關(guān)性分析，再克隆分離目的基因，分析其序列特

征和表達(dá)特性，然后進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)化子口大

基因工程育種技術(shù)是在分子水平上對食用菌遺傳物質(zhì)進(jìn)行操作，它所創(chuàng)造的

新物種在自然演化中不一定能出現(xiàn)，作為一種可控的育種手段，必將在食用菌育

種中發(fā)揮重要的作用。食用菌產(chǎn)量、品質(zhì)、抗性和耐貯等相關(guān)重要基因緊密連鎖

的分子標(biāo)記的尋找、基因的克隆、表達(dá)與功能驗(yàn)證，適宜載體的構(gòu)建和高效穩(wěn)定

遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立等方面是今后食用菌育種的主要研究課題【⑷。

2.5雜交育種

雜交是指不同遺傳類型之間的交配，使遺傳基因重新組合，創(chuàng)造出兼有雙親

優(yōu)點(diǎn)的新品利％雜交育種是目前食用菌新品種選育中使用最廣泛、收效最明顯的

育種手段。雜交是遺傳物質(zhì)的一種在細(xì)胞水平上的重組過程，由于食用菌能產(chǎn)生

有性抱子，因此，原則上都可以像高等植物那樣通過有性雜交進(jìn)行育種，從而獲

得綜合雙親優(yōu)良性狀的新品種。潘迎捷【⑸（1993）等發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體單核化是香菇、

平菇、金針菇等異宗結(jié)合食用菌的菌絲體在原生質(zhì)體制備過程中的一個普遍現(xiàn)

象，并認(rèn)為原生質(zhì)體單核體不僅是一個重要的遺傳材料，而且這一技術(shù)的應(yīng)用為

食用菌育種研究開辟了一個新的途徑，擴(kuò)大了雜交材料的范圍。用于雜交育種的

材料主要有單核體菌株和雙核體菌株兩種，其中單核體應(yīng)用較多，又分為原生質(zhì)

體單核體和抱子單核體兩種。雜交育種的方法有對稱雜交和非對稱雜交兩種〔⑹。

2.5』對稱雜交

用于雜交的單核菌絲可通過擔(dān)抱子單抱分離獲得，亦可采用雙核菌絲原生質(zhì)

體單核化的方式獲得。對稱雜交的基本遺傳特征是兩個單核體親本的核基因和細(xì)

胞質(zhì)基因均等的重組在一個新形成的雜交細(xì)胞中。由兩個遺傳組成不同的親本雜

交產(chǎn)生的后代，在菌絲長勢、抗逆性、產(chǎn)量和品質(zhì)上表現(xiàn)出與雙親不同的連續(xù)變

異，從這種變異中，我們可以篩選出符合育種目標(biāo)的優(yōu)良菌株。這是食用菌菌種

改良中產(chǎn)生新的種質(zhì)資源的一個主要方法和手段。此法要求雜交后代能表現(xiàn)出較

強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，所以要通過對親本多種性狀遺傳差異進(jìn)行綜合分析，選擇具有較

大遺傳差異的雙親。通過對稱雜交實(shí)現(xiàn)親本遺傳物質(zhì)的組合和交換以產(chǎn)生新的種

質(zhì)，在我國香菇菌種的選育上成就矚目。目前，我國香菇生產(chǎn)中相當(dāng)數(shù)量的菌種

都來源于對稱雜交育種，其中最為典型的是由福建省三明真菌研究所蔡衍山等選

育的Cr02、Cr04''0

252非對稱雜交

4

東華大學(xué)碩I:論文

非對稱雜交方法是建立在布勒現(xiàn)象基礎(chǔ)上，其主要原理是以需改良菌株的原

生質(zhì)體單核體為受體，以能提供改良菌株所需性狀的雙核菌株為供體進(jìn)行雜交。

在這種雜交中，供體和受體的遺傳物質(zhì)不均等的分配在后代中，形成了一個同質(zhì)

異核的基因組后代，它是一個具有一套完整的受體細(xì)胞質(zhì)和分別來自供體和受體

兩個異核的遺傳重組體。

非對稱雜交是針對已具備多種優(yōu)良性狀但需進(jìn)一步改良的菌種而建立的一

種育種方法。該法除具對稱雜交優(yōu)點(diǎn)外，后代遺傳性狀和表型更接近受體，受體

一方可以完全地保持其全部遺傳性狀。因此，非對稱雜交具有獨(dú)特的遺傳背景與

優(yōu)勢，而且由于只需一個親本進(jìn)行單核菌絲的制備，另一親本為正常雙核菌種，

減輕了工作量。此法也為一些優(yōu)良食用菌菌種在有限的遺傳范圍內(nèi)進(jìn)行提純復(fù)壯

提供了一條新的途徑。在食用菌育種工作上，利用非對稱雜交方法也成功培育出

了優(yōu)良新品種。優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆性強(qiáng)、栽培適應(yīng)性廣的香菇品種申香10號就是

迪世半以氽父世EF皿感,tf'J由T超駐菅姑具內(nèi)莉溫出姑的荷TI,悵如好一特‘住，

可以設(shè)計(jì)出以翹鱗香菇雙核體為供體，以其他近緣菌株單核體為受體的非對稱雜

交實(shí)驗(yàn)，以期改良菌種耐高溫性。

但是，雜交育種也有一些局限性，它雖能夠產(chǎn)生新的基因組合，但不能產(chǎn)生

新的基因，雜交育種步驟較繁瑣，工作量較大。今后，應(yīng)利用最新的分子生物學(xué)

手段進(jìn)行食用菌種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系評價鑒定，尋找與優(yōu)良性狀緊密

連鎖的分子標(biāo)記，將DNA分子標(biāo)記輔助選擇與雜交育種技術(shù)相結(jié)合，減少以往

雜交育種工作中親本選擇的盲目性，提高育種效率【皿。

3.食用菌品種鑒定方法

用于食用菌菌種鑒定的方法主要有：形態(tài)學(xué)鑒定、以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的

分子標(biāo)記。如果能將各種鑒定方法相結(jié)合使用，可給菌株一個盡可能詳盡的定義。

3.1形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)特征在真菌分類鑒定中占據(jù)著重要地位，特別是大型擔(dān)子菌的分類，

最初多用宏觀性狀，即外部形態(tài)，如子實(shí)體的形狀、大小和顏色、表面是否平滑、

粗糙或有毛，菌肉的質(zhì)地和氣味，菌蓋與菌褶或菌管分離的難易程度以及孩子印

的色澤等除此之外，細(xì)胞學(xué)性狀等也可以作為分類依據(jù)。該方法簡便直觀，容易

操作，在食用菌品種鑒定中是一個重要的指標(biāo)。

但是由于真菌的某些形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)易受外界環(huán)境和栽培條件的

影響，許多檢驗(yàn)結(jié)果難以量化，并且難以區(qū)分變異來源，影響品種遺傳特性的判

斷。在食用菌生產(chǎn)過程中，同一個品種不同栽培方式產(chǎn)生的子實(shí)體形態(tài)特征有差

異，覆土栽培和非覆土栽培產(chǎn)生的子實(shí)體形態(tài)也有差異。因此單純利用形態(tài)特征

進(jìn)行真菌菌株分類鑒別容易產(chǎn)生分歧〔2叫

5

東華大學(xué)碩I:論文

3.2DNA分子標(biāo)記

-

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小丁I陀畛且按以灰艮Hi國UNA小r歹念旺仲「蘋四/E包兄也E，7廠廠4小七

技術(shù)在食用菌遺傳圖譜構(gòu)建，遺傳多樣性，育種及菌株鑒定等方面的應(yīng)用倍受親

睞。DNA分子標(biāo)記通常也稱為DNA指紋圖譜，是指能反映生物個體或種群間基

因組中某種差異特征的DNA片段，狹義的分子標(biāo)記特指DNA標(biāo)記。所以DNA分

子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種理想的遺傳標(biāo)。

日前一口"，后山粉了十種分子林岸一i甬堂一過叱仆彳烷汜相捉苴其水質(zhì)理可

r-t，■-'??，I，/、.1?>/T^、7I(IXWY，?y??I???-^―?.，—??》■、?I/、I.|?—V

分為三大類，分別是以分子雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如RFLP；以PCR技術(shù)核心

的標(biāo)記，如RAPD、ISSR等；以DNA序列為基礎(chǔ)的標(biāo)記技術(shù)，如SCAR標(biāo)記技

術(shù)。不同的分子標(biāo)記在種質(zhì)資源評價、菌種菌株鑒別方面的研究均有報(bào)道，并取

得了成效，這里不一--贅述。

3.3木亥糖彳本DNA(rDNA)

核糖體作為蛋白質(zhì)合成機(jī)器，是所有細(xì)胞最基本的細(xì)胞器，核糖體RNA是

核糖體的基本組成部分。rRNA作為細(xì)胞中最古老的分子之一，具有功能和進(jìn)化

上的同源性，是研究生命起源和早期生物進(jìn)化以及分子系統(tǒng)學(xué)的“活化石”。編碼

rRNA基因的核糖體DNA(rDNA)在進(jìn)化上相當(dāng)保守，近年來成為研究高級分類

再I，元J，分J子??李結(jié)學(xué)4i的j,隹、、、占,、、、【21】。

真菌核糖體DNA是由轉(zhuǎn)錄單位和非轉(zhuǎn)錄的間隔區(qū)組成的重復(fù)單位，在基因

組中串聯(lián)排列。如圖1所示，一個真菌核糖體DNA重復(fù)單位包括：18S、5.8S、

26S、5s四個基因,以及兩個內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)

和兩個轉(zhuǎn)錄單位間隔區(qū)(intergenicspacer,IGS)共八個部分。

圖1真菌rDNA位點(diǎn)圖示

其中，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的進(jìn)化較快，常用于屬內(nèi)種間系統(tǒng)發(fā)育研究［22-23】。

Alvarez調(diào)查近幾年發(fā)表的關(guān)于植物屬或?qū)僖韵滤较到y(tǒng)發(fā)育的文獻(xiàn)，其中66%

文章應(yīng)用了ITS的序列，更重要的是，34%的文章是完全建立在單獨(dú)的ITS序列

分析的基礎(chǔ)上的123由此可見ITS序列分析在系統(tǒng)發(fā)育研究中的重要性。

目前,，用于擴(kuò)增ITS不同區(qū)域的一系列保守引物已經(jīng)設(shè)計(jì)成功3】，如圖2

所示。在真菌遺傳研究中被廣泛應(yīng)用的是通用引物對ITS1/ITS4?

6

東華大學(xué)碩I:論文

ITS1F

ITS5

ITS1ITS3

SR6R5.8SR

5.8S

5.8SLR1

ITS2ITS4

ITS-1ITS-2

ITS4R

圖2用于ITS擴(kuò)增的引物

陳春濤等用RFLP研究工香菇主栽品種的ITS區(qū)段及線粒體DNA(mtDNA)

的小區(qū)段，結(jié)果表明同種內(nèi)菌間的rDNA具有相對的遺傳穩(wěn)定性；菌株間在所研

究的區(qū)段有很高的遺傳相似性囤。秦蓮花等用ITS和SSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合鑒

別香菇生產(chǎn)用種DI,這些都為ITS技術(shù)應(yīng)用于食用菌菌株快速準(zhǔn)確鑒定提供了技

術(shù)依據(jù)。

4.擔(dān)子菌交配型因子的研究進(jìn)展

4.1擔(dān)子菌的典型生活史

擔(dān)子菌是以擔(dān)子為有性劑子、擔(dān)抱子獨(dú)特地形成于擔(dān)子外面的菌類總稱。擔(dān)

子菌的減數(shù)分裂發(fā)生在抱子臺這個特殊的細(xì)胞中，所產(chǎn)生的擔(dān)抱子在細(xì)胞外發(fā)

育。這與其他主要的蕈菌有所不同，例如子囊菌的減數(shù)分裂是在子囊細(xì)胞進(jìn)行

的，所產(chǎn)生的囊泡子在細(xì)胞中發(fā)育。

灰蓋鬼傘(Ccinereus)作為擔(dān)子菌的模式菌株,‘它的生活史是最具有代表性

的。有性擔(dān)抱子萌發(fā)形成具有單核細(xì)胞的無性單核菌絲〔2叫兩個可親和的單核菌

絲通過融合，質(zhì)配進(jìn)而形成有性雙核菌絲體。緊接著是進(jìn)行核的交換：引入的核

迅速遷移并穿過它的交配細(xì)胞進(jìn)入到一個新的單核頂端細(xì)胞，在新的單核頂端細(xì)

D/tr-U.nI、AAt4?+J壬!]-r^占八.WrUX/I.r=nih-AA?\T*r號山Z4TJU/tAA/\右11FlA九A人'-k/口

〃巴十，*71，、口次刁案IJI、口'JT*及±1嗎少1PJ刀-冏。J火乂血的〃巴tTJTT衣7E'廠及狂，

它包括了鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的形成。鎖狀聯(lián)合確保了每個雙核菌絲細(xì)胞保持它的“雙

核分配”的核，一個核進(jìn)入鎖狀聯(lián)合細(xì)胞并進(jìn)行分裂，另一個核在雙核菌絲細(xì)胞

的主要部分中進(jìn)行分裂。隔膜使得它們產(chǎn)生3個細(xì)胞，一個新的雙核細(xì)胞和兩個

單核細(xì)胞[2叫每個細(xì)胞含有不同的核。當(dāng)鎖狀聯(lián)合細(xì)胞頂端與近頂端細(xì)胞融合時，

核分裂也就完成了。分裂的核遷移并進(jìn)入到它的可親和體中。這在每個頂端細(xì)胞

的分離的過程中反復(fù)著。當(dāng)受到環(huán)境刺激時，雙核發(fā)育成有組織分化的子實(shí)體，

核融合也最終完成。但是緊接著發(fā)生減數(shù)分裂和有性擔(dān)抱子的形成。擔(dān)抱子彈射,

7

東華大學(xué)碩I:論文

待環(huán)境條件適宜時，擔(dān)抱子萌發(fā)又開始新的生活周期。

圖3灰蓋鬼傘的生活史

另外還存在一些有隔擔(dān)子菌綱，它們的生活史和灰蓋鬼傘有區(qū)別，產(chǎn)生裸露

的抱子，我們可以用玉米黑粉菌（U.may出s）生活史來描述這一類擔(dān)子菌的生活

史特征。玉米黑粉菌中，是一種寄生于玉米上的致病菌。它存在由出芽生殖得到

的寄生單抱子，具有不同a交配型基因的擔(dān)孩子可以融合，融合之后菌絲變長，

在尖端形成接合管，如果b位點(diǎn)也是親和的，那么就可以形成雙核菌絲了。雙核

菌絲在宿主中生長到一定階段之后，感染宿主，雙核菌絲分化成二倍體的池子，

經(jīng)減數(shù)分裂形成四種單倍體細(xì)胞，四倍體細(xì)胞形成原菌絲，原菌絲出芽形成擔(dān)抱

子。至于玉米黑粉菌的雙核體是不是會有鎖狀聯(lián)合以及宿主植物在玉米黑粉菌的

雙核體形成及核配過程中起到的作用現(xiàn)在還不清楚，但是同其它擔(dān)子菌一樣，a、

b交配型基因在雙核體形成和維持過程中都是必須的13”

8

東華大學(xué)做I論文

圖4玉米黑粉菌的生活史

交配型基因在擔(dān)子菌中的作用是阻止自交從而維持種群中的遺傳多樣性。在

擔(dān)子菌中，不需要特殊的生殖細(xì)胞融合，只要體細(xì)胞可以融合就滿足了交配的條

件。交配型基因控制遺傳本質(zhì)上不同的個體中的核相互融合形成雙倍體核。雙倍

體核再進(jìn)行有性抱子形成之前的減數(shù)分裂。自身不育的物種被稱為異宗結(jié)合，而

那些能自交的物種被稱為同宗結(jié)合⑶］。擔(dān)子菌絕大多數(shù)是異宗結(jié)合，并且具有一

個明顯的特征就是含有多對等位交配型基因。

4.2交配型系統(tǒng)的類型和交配型因子研究進(jìn)展

4.2.1交配型系統(tǒng)

大多數(shù)擔(dān)子菌是異宗配合進(jìn)行有性生殖的，該過程有一個或兩個遺傳因子決

定，由一個因子決定交配型的機(jī)制稱為二極性交配系統(tǒng)卬】；由兩個獨(dú)立分配的因

子控制的交配稱為四極性交配系統(tǒng)用］。二極性交配系統(tǒng)的遺傳結(jié)構(gòu)相對簡單，A

因子是唯一的控制因子，它實(shí)際上由兩個緊密連鎖的基因簇組成，四極性交配系

統(tǒng)中，A和B因子分別對應(yīng)位于不同染色體上的兩個交配型位點(diǎn)(Matingtype

locus),兩個單核菌絲相遇，只有當(dāng)它們形成AaApBaB。型時，才能產(chǎn)生具有鎖

狀聯(lián)合的雙核體，完成整個有性生活史。

在擔(dān)子菌模式菌種中，交配型是由兩個不連鎖的位點(diǎn)上的基因所決定的

例如食用菌中的A和B,玉米黑粉菌中的a和b。一般認(rèn)為A因子控制核配對與

鎖狀聯(lián)合的形成，B因子控制核遷移與鎖狀聯(lián)合的融合可親和的交配也就是

交配位點(diǎn)上不同的等位基因相結(jié)合的一個過程。例如灰蓋鬼傘和裂褶菌中的

A1B1XA2B2,玉米黑粉菌U.maydis中的alblxa2b2。

9

東華人學(xué)碩I:論文

Indr|)endcnlofMatingType

llyphalFusion

itfiviivCmiif<>l

NuclearMigraiion

SeptalDissolucion

AGeneControl

NuclcaiPairing

ClampCellTonnation

Co-ordinatcNuclearDivision

ClumpCellSeptalion

BGeneControl

ClampCellF?usion

.1andBGeneControl

Maintenanceof(heDikaryron

圖5A、B交配型基因?qū)疑w鬼傘的雙核體形成和維持的調(diào)我作用

4.2.1交配型因子研究進(jìn)展

通過對灰蓋鬼傘的交配型因子的研究得出，A因子由3個功能獨(dú)立的亞單位

所組成，每個亞單位是編碼2種不同的同源結(jié)構(gòu)域蛋白［36］。B因子同樣由3個功

能獨(dú)立的亞單位所組成，每今-亞單位編碼1個信息索受體和2個信息素"71。

(a)TheAlocusofCopnnuscuiereus(b)TheBIccusofCopnnuscm^reus

Group1Group2Group3Group1Group2Group3

HOIHD2HD1HD2HC-1HD2

—(■??<■■■I.■■■——4-8Hocus

Encode

Honieodomamproteins

Heterodimerize

todikaryon-specific

transcriptionfactor

Activationdomain

Nuclearlocalization

signal、HD2

DNA-bmdmg

HD1-----domain

DNA-bmding<DNA

domain

Recognition

dimenzation

domain

Transcriptionalactivation

圖6灰蓋鬼傘交配型A、B位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)

根據(jù)同源結(jié)構(gòu)域序列的不同，A位點(diǎn)的交配型蛋白分成兩個具體的亞組；HD1

和HD2oHD1類的同源結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是非典型的，主要是因?yàn)樗x保守

10

東華人學(xué)碩I:論文

的同源結(jié)構(gòu)域序列（尤其在識別螺旋中）并在螺旋的空隙處發(fā)生變化。HD2類的

蛋白具有序列的特征結(jié)構(gòu)，這使得它們更相似于保守序列.只有當(dāng)來自于一個交

配異二聚物的HD1蛋白與另一個交配異二聚物中的HD2蛋白相結(jié)合時，才發(fā)生

細(xì)胞內(nèi)的有性親和的識別，并形成一個功能性的控制蛋白【3”這個異二聚物被推

定為轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合前體基因中唯一的靶位點(diǎn)。它會使得細(xì)胞完成一個新的

發(fā)育途徑。不進(jìn)行交配的細(xì)胞不能形成轉(zhuǎn)錄因子，因此也就不能進(jìn)行有性發(fā)育。

很明顯，細(xì)胞內(nèi)的可親和蛋白的識別是很重要的。一個HD1蛋白不能與由相

同的不交配細(xì)胞編碼的任何HD2蛋白異二聚化。否則A因子的控制途徑不需要

交配就可以激活了。同源結(jié)構(gòu)域的氨基酸末端區(qū)域是用來區(qū)分可親和與不可親和

作用的，在識別的區(qū)域內(nèi)，用關(guān)鍵的殘基來代替會影響蛋白的特異性13叫

信息素信號對食用菌的交配與有性發(fā)育起著必要的作用。在交配型8位點(diǎn)中，

編碼信息素和7次跨膜信息素受體的多等位基因是相互隔開的RO1。研究已經(jīng)分離

出灰蓋鬼傘的交配型8位點(diǎn)。序列分析和轉(zhuǎn)化分析鑒定了編碼3個7次跨膜受體

基因和6個信息素前體基因，共9個基因，長度總共為17kb。9個基因的排列顯

示出該位點(diǎn)山三個功能獨(dú)立的亞單位所組成。

像A位點(diǎn)一樣，B位點(diǎn)具有特異性是取決于3個功能獨(dú)立的基因。而且，這

些基因?qū)儆讵?dú)立的亞單位。亞單位內(nèi)的每個等位基因是由一個“盒”組成，其中包

括了個受體和兩個信息素基因⑷］。兩個種交配只需個亞單位的盒不同，并是

可親和的。

blocusalocus

圖7玉米黑粉菌交配型a、b位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)

在玉米黑粉菌中，交配型位點(diǎn)的定義先于對交配型基因的性質(zhì)了解，后來的

研究發(fā)現(xiàn)食用菌中的A基因相當(dāng)于玉米黑粉菌中的b基因，B基因相當(dāng)于玉米

FFI業(yè)八-dttrL!~,AA.七七rn/OCTr\

忐仍國十TJd圣⑷、國/7o

在每個b位點(diǎn)上有兩個基因。分別定義為bE和bW,兩者的轉(zhuǎn)錄是不同的HL

bE基因編碼HD1蛋白，bW編碼HD2蛋白。僅兩個多肽就足以滿足交配〔4叫這

一對多肽必須包括一個HD1蛋白和一個HD2蛋白。例如一個bE蛋白和一個bW

蛋白。多肽必須來自于不同的交配型。例如bEl和bW2或者是bE2和bWl。盡

管這樣，食用菌中的A位點(diǎn)上的基因比玉米黑粉菌b位點(diǎn)匕的基因多，相應(yīng)地

在細(xì)胞內(nèi)更多的可親和的與不可親和的交配體基因產(chǎn)物需要加以區(qū)分開來1的。

a位點(diǎn)的兩個等位基因，al和a2,它們是由不相似的DNA序列所組成，序

11

東華大學(xué)碩I:論文

列中間具有同源區(qū)域口式每個位點(diǎn)含有兩個基因，這兩個基因編碼一個交配特異

性信息素基因和相應(yīng)的受體基因口”編碼信息素受體的基因分別為pral和pra2o

編碼信息素或交配因子的基因分別為mfal和mfa214。而且a2位點(diǎn)含有兩個基

因Iga2和rga2,這兩個基因的功能還不清楚，但是是由信息索反應(yīng)途徑所激活〔4叫

5.課題的提出及意義

食用菌產(chǎn)業(yè)，隨著市場競爭的FI趨激烈，其產(chǎn)量和質(zhì)量成為決定企業(yè)能否生

存的關(guān)鍵。作為一種農(nóng)產(chǎn)品，食用菌的產(chǎn)量和質(zhì)量不僅僅取決于生產(chǎn)條件，更取

決于作為生物學(xué)基礎(chǔ)的菌種。目前，傳統(tǒng)加工技術(shù)和工藝，限制了大部分菇農(nóng)的

生產(chǎn)，在盛夏時期由于天氣炎熱不得不停止生產(chǎn)，這樣難以適應(yīng)多樣化的社會需

求以及消費(fèi)者對加工品的質(zhì)量要求。因而在引進(jìn)適宜在高溫條件下出菇的新種，

并對其進(jìn)行深入研究，擴(kuò)大食用菌品系資源，增加優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株勢在必行。

本研究先從翹鱗香菇的形態(tài)學(xué)著手，首先對8株翹鱗香菇菌株進(jìn)行出菇實(shí)驗(yàn)，

證實(shí)其可以在較高溫度下出菇，具有馴化應(yīng)用前景。分析其形態(tài)特征，從外部特

征對菌株進(jìn)行鑒定，再通過ITS序列分析分類鑒定，最后結(jié)合通過對交配型因子

B位點(diǎn)信息素受體基因的克隆和分析。為制鱗香菇的進(jìn)化分類提供一些參考依

據(jù)，對其交配型B位點(diǎn)進(jìn)行解析，指導(dǎo)今后的育種工作。本研究將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)

鑒定方法與分子生物學(xué)研究方法相結(jié)合，從系統(tǒng)分類學(xué)角度為判斷翹鱗香菇的分

類地位提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

12

東華大學(xué)碩I:論文

第二章翹鱗香菇的形態(tài)學(xué)特征分析

2.1引言

形態(tài)學(xué)特征在真菌分類鑒定中占據(jù)著重要的地位，特別是大型擔(dān)子菌的分

類，最初多用宏觀性狀，即外部形態(tài)，如子實(shí)體的形狀、大小和顏色，菌肉質(zhì)地

和氣味，菌蓋與菌褶或菌管分離的難易程度以及抱子印的色澤甚至是有無鎖狀聯(lián)

合等。但是真菌的形態(tài)學(xué)特征易受到外界環(huán)境和栽培條件的影響，如空氣濕度、

溫度等因素，從而影響品種特性的判斷，因此單純利用形態(tài)特征進(jìn)行真菌菌株分

類鑒定容易產(chǎn)生分歧。雖然不能單純利用形態(tài)學(xué)進(jìn)行品種鑒別，但該方法的優(yōu)點(diǎn)

是簡便直觀，容易操作。

對于野生菌株在不了解其生物學(xué)背景下，對其出菇觀察，可以作為品種鑒定

中的一個輔助指標(biāo)。本研究對8個野生菌株進(jìn)行出菇實(shí)驗(yàn)，對子實(shí)體外部特征進(jìn)

行分析，并根據(jù)池子單核體的分離結(jié)果，對翹鱗香菇的交配型進(jìn)行初探。

2.2材料與方法

2.2.1供試菌株

表1供試菌株

菌株序號保藏中心編號一菌株源地

1.0825上海

2.0826美國

3.0827美國

4.麗水浙江

5.0182上海

6.MQL馬來西亞

7.QL7-4海南

8.QL7-6海南

2.2.2供試培養(yǎng)基

(1)PDA培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸鐳水1000mL,

pH自然。用于母種培養(yǎng)、擔(dān)抱子分離和雜交培養(yǎng)。

(2)栽培培養(yǎng)基

木屑(85%)、熟皮(15%)、每瓶干重(240克)、含水量(60%-62%)。

2.2.3主要儀器

13

東華大學(xué)做I論文

滅菌鍋、超凈工作臺、培養(yǎng)空、栽培房、生化培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡等。

2.2.4栽培方法

采用850mL袋栽，每袋裝濕料600g（含水量60?62%）后蓋上海綿蓋，⑵C高

壓滅菌2h。滅菌后放入冷卻室，待瓶體完全冷卻、中心料溫低F25c后接種，

接種量為3%（v/v）,然后置于室溫24-25C,培養(yǎng)50d左右菌絲可長滿袋。

當(dāng)在培養(yǎng)料和塑料袋間出現(xiàn)一些零星的隆起物：培養(yǎng)料表面出現(xiàn)褐色色素且

有淡黃水珠分泌；手握菌袋感覺重量明顯減輕且稍有彈性時.說明菌絲發(fā)育已經(jīng)

成熟，可以移出培養(yǎng)室，栽培出菇。

選擇最高氣溫維持在28-32C時移至栽培房出菇，菇房內(nèi)溫度要求保持在

80%以上，自然環(huán)境的溫差刺激使其現(xiàn)蕾，出菇。菇蕾形成后，子實(shí)體逐漸長大

至適度成熟時采收。

2.2.5栽培性狀觀察

跟蹤子實(shí)體的生長情況，觀察栽培的子實(shí)體的菌蓋、菌柄、菌褶的形態(tài)特征。

2.2.6抱子的采集

采用池子印法收集抱子。挑選發(fā)育成熟的子實(shí)體，剪去菌柄，讓帶有菌褶的

一面平貼在平板上，置于25℃培養(yǎng)箱24h后收集泡子，置于4℃下備用。

2.2.7狗子單核體的分離和單核體菌絲的確認(rèn)

刮取少量的抱子用無菌水稀釋抱子至104個/mL（血球計(jì)數(shù)板法），每皿涂布

100uL于PDA平板中（培養(yǎng)皿直徑為9cm,培養(yǎng)基量約為20mL/皿）。25℃下

黑暗暗室中倒置培養(yǎng)8-10d,在平板上形成肉眼可見微小聯(lián)成片的菌落后，用接

種針挑取適當(dāng)大小的菌絲塊轉(zhuǎn)接于PDA平板上.繼續(xù)培養(yǎng)5d（條件同上），重復(fù)

挑取轉(zhuǎn)接1~2次，直到獲得純培養(yǎng)菌落,最后在菌落邊緣挑小菌絲塊壓制水玻片于

顯微鏡下（放大300倍）觀察菌絲有無鎖狀聯(lián)合，菌絲有鎖狀聯(lián)合的為雙核體。

2.2.8翹鱗香菇原生質(zhì)體的制備和再生方法

將翹鱗香菇接種在PDA平板上活化約五天后，無菌條件下將平板表面菌

絲刮卜（可攜帶少量培養(yǎng)基），置于均質(zhì)儀中，加入約50mlpD液體培養(yǎng)基，高

低速間隔打碎約30s,分別傾倒在兩個盛有25mlpD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每

瓶約倒20ml,25℃靜置培養(yǎng)。

菌絲培養(yǎng)3-5d后，用帶有濾膜的漏斗過濾，經(jīng)無菌水沖洗，用滅菌吸水紙

吸干水分。用0.6mol/L的甘露醇配制1.5%的溶壁酶溶液6ml,經(jīng)孔徑為0.45R《

的細(xì)菌過濾器過濾除菌后，將菌絲轉(zhuǎn)移到酶液中，使其均勻散開.35c酶解3h,

間或搖晃，使菌絲與酶液充分接觸。

14

東華大學(xué)碩I:論文

酶解結(jié)束后，用帶有棉塞的注射器過濾除去殘留菌絲，3000r/min離心lOmin,

傾去上清液，原生質(zhì)體沉淀用0.6mol/L的甘露醇洗滌1-2次后用血球計(jì)數(shù)板鏡檢

計(jì)數(shù)，將懸液稀釋到最佳濃度（一般為IO,個/ml）,梯度涂布于再生培養(yǎng)基PDMS

平板上（303，W，50似），25c恒溫培養(yǎng)6-7天后可見星芒狀再生菌落。挑

每H出現(xiàn)的較小菌落轉(zhuǎn)移到PDA平板中，每個平板放7-8個，直到不再有再生

菌落出現(xiàn)或無法挑到單菌落為止。所挑菌落長到直徑0.5cm以上時，挑其邊緣菌

絲鏡檢，無鎖狀聯(lián)合的為單核體，編號保臧，有鎖狀聯(lián)合的為雙核菌絲，棄之，

一般雙核菌落較大，可通過肉眼進(jìn)行粗篩。

2.2.9交配型分析

從獲得的單核菌株任選一個為測試菌株T1,并初定其交配型為A1B1,讓T1

與所有的單核菌株進(jìn)行第一輪配對，從與T1交配親和（形成鎖狀聯(lián)合）的單核菌

株中選一個T2作為第二輪的測試菌株，與所有的單核菌株進(jìn)行第二輪配對，則

T2的交配型為A2B2,從與Tl、T2都不親和的單核菌株中選一個T3作為第三輪測

試菌株，與所有的單核菌株進(jìn)行第三輪配對，最后再從與T3親和的單核菌株中選

一個T4與所有的單核菌株進(jìn)行第四輪配對。通過此法把翹鱗香菇的單核菌株分為

四組；讓Tl、T2、T3和T4進(jìn)行兩兩配對，再根據(jù)親和反應(yīng)（發(fā)生鎖狀聯(lián)合），

平貼反應(yīng)和柵欄反應(yīng)等現(xiàn)象，來確定T3和T4的交配型，如果T3的交配型為A1B2,

T4的交配型為A2B1,Ar（A因子的重組型）既能與T1親和又能與T4親和，Br（B

因子的重組型）既能與T1親和又能與T3親和，從而確定含有Ar或Br的交配型。

2.3結(jié)果與分析

2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定

對8株翹鱗香菇的出菇進(jìn)行了跟蹤觀察，記錄了它們的菌絲體時期、后熟時

期、轉(zhuǎn)色時期、子實(shí)體發(fā)育期，開傘期的形態(tài)特征。部分圖片見下：

圖8菌絲體時期

15

東華大學(xué)碩士論文

圖9后熟圖10轉(zhuǎn)色

圖11子實(shí)體發(fā)育