小分子端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展

小分子端粒酶抑制劑的研究進(jìn)展腫瘤的發(fā)生是多階段的復(fù)雜過(guò)程，原癌基因的激活、抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要分子根底。腫瘤細(xì)胞獲得無(wú)限增殖特性而成為永生化細(xì)胞，在這個(gè)過(guò)程中端粒酶起了重要作用，端粒酶的激活使腫瘤細(xì)胞的端粒不再進(jìn)行性縮短而得以維持，避開(kāi)了細(xì)胞正常的復(fù)制-衰亡機(jī)制的制約。研究發(fā)現(xiàn)，近90%的腫瘤細(xì)胞都有端粒酶活性，而正常細(xì)胞或組織中幾乎沒(méi)有檢測(cè)到端粒酶活性。端粒酶已成為當(dāng)今腫瘤新的標(biāo)志物和腫瘤治療的新靶點(diǎn)，抑制端粒酶的活性已成為腫瘤治療的一種新策略。本文作者就近年來(lái)出現(xiàn)的小分子端粒酶抑制劑進(jìn)行綜述。1端粒和端粒酶端粒(telomere)位于真核生物染色體3'末端，是由富含鳥(niǎo)嘌呤的DNA重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白組成的核蛋白復(fù)合物，它是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，能防止染色體DNA降解、末端融合、缺失及非正常重組，維持染色體的完整和穩(wěn)定，端粒結(jié)構(gòu)對(duì)于保持染色體結(jié)構(gòu)的完整性具有重要意義。研究證明，端粒與細(xì)胞的壽命密切相關(guān)。細(xì)胞在進(jìn)行分裂時(shí)，由于受DNA聚合酶的限制，每次分裂，染色體3'末端將持續(xù)喪失50～200b的DNA，端粒不斷縮短，當(dāng)其長(zhǎng)度減小到一定的臨界值時(shí)，細(xì)胞即趨向于衰老、死亡，因此，端粒被認(rèn)為是絕大多數(shù)體細(xì)胞的“生物鐘〞。端粒酶是一種特殊的DNA聚合酶，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它有3個(gè)主要組分:人端粒酶催化亞單位(thehumantelomerasereversetranscriptase，hTERT)、人端粒酶核糖核酸(hTR)，以及端粒酶相關(guān)蛋白(TP1/TLP1)。端粒酶能以自身的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成端粒的重復(fù)單元TTAGGG加到人染色體末端，使端粒延長(zhǎng)，阻止端粒隨細(xì)胞分裂而縮短，使細(xì)胞繞過(guò)衰老途徑成為永生化細(xì)胞，導(dǎo)致人類(lèi)腫瘤的發(fā)生。一般認(rèn)為，端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過(guò)程中的一個(gè)后期事件，端粒酶使腫瘤細(xì)胞的端粒不再進(jìn)行性縮短而得以維持，避開(kāi)了細(xì)胞正常的復(fù)制-衰亡機(jī)制的制約而獲得永生性。端粒酶在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞高表達(dá)而在正常細(xì)胞卻表達(dá)很少，這使得端粒酶成為人們熱衷研究的藥物作用靶點(diǎn)。近年來(lái)，以端粒酶為靶點(diǎn)的抑制劑廣被報(bào)道，例如:目前正處于Ⅰ期臨床試驗(yàn)的核苷類(lèi)端粒酶抑制劑GRN163L等，也有一些小分子抑制劑，如:非核苷類(lèi)端粒酶抑制劑BIBR1532、吖啶類(lèi)端粒酶抑制劑BRACO19、MST-312、FJ-5002等。2小分子端粒酶抑制劑2.1小檗堿及其類(lèi)似物小檗堿(berberine，1)又稱(chēng)黃連素，是中藥黃連的主要生物堿。小檗堿是一種異喹啉季銨生物堿，于1826年從Xanthoxylonclava樹(shù)皮中首次獲得。Naasani等人用比擬分析法對(duì)化合物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，并采用端粒重復(fù)序列擴(kuò)增(TRAP)法對(duì)端粒酶抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，小檗堿是一種中等強(qiáng)度的端粒酶抑制劑，其抑制活性的L50值約為35μmol·L-1。之后，他們又以小檗堿作為升級(jí)探針，采用比擬分析法篩選出小檗堿類(lèi)似物MKT-077(2)，它對(duì)端粒酶有較強(qiáng)的抑制作用，L50值約為5μmol·L-1。MKT-077是一種新的含硫花青染料類(lèi)抗腫瘤抑制劑，Tatsuta等人研究發(fā)現(xiàn)，它提供了一種新的抗癌機(jī)制，即它在癌細(xì)胞(如結(jié)腸、乳腺、胰腺癌等)線(xiàn)粒體上聚集，使得作用在線(xiàn)粒體上的親脂性離子化合物離域。在前期研究根底上Naasani等人又以MKT-077作為升級(jí)探針進(jìn)行新一輪的篩選，發(fā)現(xiàn)了MKT-077近親衍生物FJ-5002(3)，其L50值為2μmol·L-1，為小檗堿的17倍，具有較強(qiáng)的抑制活性。研究顯示，將白血病細(xì)胞U937和不同濃度的FJ-5002共同長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)，會(huì)引起不同程度的端粒喪失(從約10b到近4.0kb)及染色體不穩(wěn)定性和老化/危像特征，而且呈現(xiàn)出濃度依賴(lài)性，說(shuō)明FJ-5002能有效地抑制端粒酶的活性。近年來(lái)，對(duì)化合物1～3的研究報(bào)道很少，Wadhwa等人進(jìn)行體內(nèi)活性研究發(fā)現(xiàn)MKT-077沒(méi)有表現(xiàn)出良好的端粒酶抑制活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)端粒酶抑制作用不是MKT-077誘導(dǎo)的癌細(xì)胞毒性作用的主要原因，因此已經(jīng)停止進(jìn)一步的研究。2.2苯乙烯類(lèi)Kim等人對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選得到3個(gè)硝基苯乙烯類(lèi)化合物DPNS(4)、DNS(5)、NVN(6)，他們均表現(xiàn)出一定的抑制端粒酶活性(L50值分別為0.4、2.7、2.57μmol·L-1)，其中化合物DPNS(4)的活性最正確，但它對(duì)DNA聚合酶、RNA聚合酶以及逆轉(zhuǎn)錄酶沒(méi)有抑制作用。一系列的酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)證明DPNS是一個(gè)混合型的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，與端粒基底物以及三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)的抑制鍵合位點(diǎn)不同。在DPNS的存在下，隨著腫瘤細(xì)胞株的增殖其端粒顯著缺失，最終趨于衰老凋亡。由此可見(jiàn)，DPNS是一個(gè)高選擇性的體外端粒酶小分子抑制劑，具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)的價(jià)值。勃林格殷格翰公司開(kāi)發(fā)的芳基乙烯類(lèi)端粒酶抑制劑BIBR1532(7)、BIBR1519(8)體外抑制端粒酶活性的L50值分別為93、470nmol·L-1。研究說(shuō)明，BIBR1532(7)能選擇性地抑制端粒酶的活性，使端粒縮短，細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯，限制了癌細(xì)胞的增殖。Damm等人研究發(fā)現(xiàn)，BIBR1532對(duì)鞍區(qū)生殖細(xì)胞瘤(GCT)衍生的細(xì)胞株2102EP細(xì)胞有顯著的抑制作用。在10μmol·L-1BIBR1532條件下培養(yǎng)2102EP細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞群體倍增值(PDs)到達(dá)300時(shí)，端粒的長(zhǎng)度從(18.5±0.59)kb降至(8.9±0.1)kb。Mueller等人研究發(fā)現(xiàn)，BIBR1532對(duì)顱骨軟骨肉瘤細(xì)胞端粒酶具有強(qiáng)的抑制作用，可縮短端粒的長(zhǎng)度，降低含端粒酶的顱骨軟骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)能力。Parsch等人合成了與BIBR1532構(gòu)型相反的化合物221-32(9)，其活性與BIBR1532相當(dāng)，研究說(shuō)明此類(lèi)化合物的構(gòu)型不是活性決定因素，這為此類(lèi)化合物的作用方式研究提供了根底。2.3喹啉類(lèi)多篇文獻(xiàn)報(bào)道喹啉和異喹啉類(lèi)化合物顯示出良好的生物活性，尤其是在酶抑制劑中得到廣泛的應(yīng)用。例如:Colangelo等人報(bào)道的鉑化合物ptquin8(10)具有顯著的抑制端粒酶活性。體外腫瘤細(xì)胞MCF-7模型試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1×10-9mol·L-1和1×10-5mol·L-1的ptquin8作用下，24h后端粒酶活性分別降低了12%和46%。Kim等人報(bào)道了化合物2，3，7-三氯-5-硝基喹喔啉(TNQX，11)，它是一個(gè)混合型的非競(jìng)爭(zhēng)性端粒酶抑制劑(L50值為0.14μmol·L-1)，它對(duì)DNA聚合酶、RNA聚合酶以及逆轉(zhuǎn)錄酶沒(méi)有抑制作用。白葉藤堿(cryptolepine，12)是一種天然的吲哚喹啉類(lèi)生物堿，此化合物及其鹽酸鹽在非洲曾經(jīng)作為抗瘧疾藥物，分子水平研究證實(shí)白葉藤堿能影響DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性。最新研究發(fā)現(xiàn)，一些白葉藤堿結(jié)構(gòu)衍生物能與DNA的G-四鏈體結(jié)構(gòu)相互作用并且顯示出一定的端粒酶抑制活性。Zhou等人設(shè)計(jì)了一系列喹叨啉(quindoline，13)類(lèi)似物14～23，以尋找新型的端粒酶抑制劑。構(gòu)效關(guān)系研究說(shuō)明:在喹叨啉11位引入供電子基團(tuán)(如取代氨基等)，其端粒酶抑制活性顯著提高(L50值:喹叨啉大于138μmol·L-1，衍生物14～23為0.44～12.3μmol·L-1)，其中化合物21(SYUIQ-5)的活性最好，其L50值為0.44μmol·L-1，在裸鼠中的藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)具有劑量依賴(lài)性，主要通過(guò)Cyp3A1/2進(jìn)行代謝。Lu等人對(duì)SYUIQ-5進(jìn)行改造，設(shè)計(jì)了26個(gè)5-N-甲基喹叨啉化合物(如24～27)，此類(lèi)化合物在芳喹啉的5位帶有正電荷。核磁共振以及分子模擬研究證實(shí)，化合物分布在外部G-四鏈體以及正電荷的引入能夠增強(qiáng)化合物的穩(wěn)定性?；衔?4在一無(wú)細(xì)胞體系中能顯著抑制端粒酶的活性，其對(duì)白血病細(xì)胞HL60、淋巴瘤細(xì)胞CA46增殖的長(zhǎng)期效應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，24能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增長(zhǎng)的中斷、細(xì)胞衰老以及端粒的縮短等過(guò)程。化合物25與不同類(lèi)型的DNA有強(qiáng)的結(jié)合能力，與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的結(jié)合尤為突出。在前期研究的根底上，Tan等人以SYUIQ-5作為參考分子設(shè)計(jì)合成了4個(gè)依靛藍(lán)酮類(lèi)化合物28～31，4個(gè)化合物均表現(xiàn)出端粒酶抑制活性(L50值分別為7.8、9.3、9.0、15.2μmol·L-1)，用端粒限制性片段(telomericrestrictionfragment，TRF)長(zhǎng)度法對(duì)化合物28在白血病細(xì)胞HL60、淋巴瘤細(xì)胞CA46中進(jìn)行端粒酶活性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，在0.9μmol·L-1時(shí)HL60、CA46細(xì)胞端粒長(zhǎng)度均發(fā)生縮短，濃度達(dá)1.8μmol·L-1時(shí)兩者端粒分別縮短為1.1kb和2.3kb。2.4蒽醌類(lèi)蒽醌類(lèi)化合物具有瀉下、抗菌消炎作用，其抗癌作用也不斷被報(bào)道。自20世紀(jì)60年代意大利科學(xué)家首先研究并證實(shí)了柔紅霉素及阿霉素的療效以來(lái)，蒽醌類(lèi)抗腫瘤藥物得到了很大的開(kāi)展，目前，已有多種蒽醌類(lèi)藥物應(yīng)用于臨床。Huang等人報(bào)道了兩類(lèi)雙取代的蒽醌類(lèi)化合物32、33，這兩類(lèi)化合物具有良好的抑制端粒酶活性。構(gòu)效關(guān)系研究說(shuō)明:當(dāng)取代基R為CH2NHCH2CH3和CH(CH3)NH(CH2)3N(CH3)2時(shí)，1，5-二氨基取代蒽醌類(lèi)化合物(32)的活性最好，L50值分別為5.0、2.0μmol·L-1;氮原子上烷基取代鏈延長(zhǎng)、縮短，或者沒(méi)有氮原子連接，活性有不同程度的降低，而1位、5位被硫原子以及酰氧基取代時(shí)，活性保持不變。當(dāng)R基團(tuán)為CH2NHCH2CH3時(shí)，2，6-二氨基取代蒽醌類(lèi)化合物(33)的活性最正確，L50值為0.1μmol·L-1;氮原子上烷基鏈增長(zhǎng)，活性略有降低(如R為CH2NHCH2CH2CH3，L50值降為2μmol·L-1)。在前期構(gòu)效關(guān)系研究的根底上，Huang等人又對(duì)這類(lèi)化合物做了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)改造，在蒽醌母核的1、2位拼上氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，得到系列化合物34，該系列化合物雖然只具有中等端粒酶抑制活性，但卻顯示出良好的細(xì)胞毒性。2.5黃酮類(lèi)黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于植物界，其生物活性多種多樣，近年來(lái)其防癌與抗癌活性成為人們研究的熱點(diǎn)，含有黃酮結(jié)構(gòu)的端粒酶抑制劑也陸續(xù)被報(bào)道。四羥基黃酮類(lèi)化合物35端粒酶抑制活性的L50值為0.2μmol·L-1，Menichincheri等人對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造設(shè)計(jì)合成了一系列衍生物36～39，L50值依次為0.82、0.6、0.80、0.13μmol·L-1，其中，化合物39的活性?xún)?yōu)于先導(dǎo)化合物35。將C環(huán)鄰羥基用取代的咪唑環(huán)替換，并將B環(huán)羥基用甲氧基替換得到化合物40，其活性與先導(dǎo)化合物相當(dāng)，L50值為0.47μmol·L-1，而其結(jié)構(gòu)與先導(dǎo)物35相比有較大改變，可以作為新的結(jié)構(gòu)類(lèi)型進(jìn)行更深入的研究。Liu等人報(bào)道了一系列新型的含黃酮結(jié)構(gòu)的2-氯吡啶衍生物41～45，并對(duì)所有化合物進(jìn)行了細(xì)胞毒活性、Taq聚合酶以及端粒酶活性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，化合物44、45對(duì)細(xì)胞株SGC-7901的細(xì)胞毒活性［L50值分別為(22.28±6.26)mg·L-1和(18.45±2.79)mg·L-1］優(yōu)于陽(yáng)性對(duì)照藥5-氟尿嘧啶［L50值為(7.38±0.98)mg·L-1］，化合物41～45均具有一定的端粒酶抑制活性，其中，化合物44的活性最正確，L50值為(0.8±0.07)μmol·L-1。構(gòu)效關(guān)系研究說(shuō)明:黃酮母核2位或7位羥基被2-氯吡啶芐基取代時(shí)活性增強(qiáng)(44、45)，5位為羥基時(shí)活性顯著提高(44)，因此推測(cè)5位羥基可能為此類(lèi)化合物活性的必需基團(tuán)。為了研究此類(lèi)化合物的作用機(jī)制，Liu等人又以活性最好的化合物44與端粒酶活性靶點(diǎn)(PDB3DU6)進(jìn)行分子模擬對(duì)接，對(duì)接示意圖及結(jié)合模式見(jiàn)圖1，對(duì)接結(jié)果顯示:化合物44的1位氧、4位羰基和5位羥基、7位醚鍵氧原子、C環(huán)嘧啶上氮原子分別與Gln308、Arg194、Asp254、Gly314等氨基酸殘基形成4個(gè)氫鍵，2-氯吡啶環(huán)插入到由Lys189、Asn369、Ile252、Arg253組成的疏水口袋內(nèi)，對(duì)化合物的活性有著很重要的影響。除上述黃酮類(lèi)化合物之外，一些黃酮類(lèi)似物也被陸續(xù)報(bào)道具有抑制端粒酶活性。Rao等人檢測(cè)了14個(gè)合成或者天然的化合物在人類(lèi)肺腺癌A549株中對(duì)端粒酶的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮衍生物46(HTMC)具有強(qiáng)的端粒酶抑制活性，在50μmol·L-1HTMC作用下，24h后肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞增殖降低59%，HTMC還能降低人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HTMC對(duì)端粒酶以及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制是通過(guò)釋放Ca2+離子來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Seimiya等人報(bào)道的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯類(lèi)似物47(MST-199)也是一個(gè)黃酮衍生物，其端粒酶抑制活性的L50值達(dá)0.38μmol·L-1，這些化合物的發(fā)現(xiàn)為黃酮類(lèi)抗癌藥物的研究提供了新的方向。2.6吖啶類(lèi)安吖啶是第一個(gè)吖啶類(lèi)抗癌藥，由Cain等人于1974年首次合成，其抗癌作用機(jī)制類(lèi)似于蒽醌類(lèi)，它與腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對(duì)有相互作用，從而阻止DNA作為DNA復(fù)制和RNA合成的模板。近年來(lái)陸續(xù)有文獻(xiàn)報(bào)道吖啶類(lèi)端粒酶抑制劑，Gowan等人報(bào)道了3，6，9-三取代的吖啶類(lèi)端粒酶抑制劑BRACO19(48)，這個(gè)化合物是當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的最具潛力的無(wú)細(xì)胞體系端粒酶抑制劑，L50值為(115±18)nmol·L-1，而且不會(huì)引起急性細(xì)胞毒性。Harrison等人合成了一些BRACO19的類(lèi)似物，通過(guò)改變?nèi)〈奈恢?，得?，6，9-、2，7，9-、3，6，9-三取代的吖啶類(lèi)衍生物(49)，活性研究結(jié)果證實(shí)，這些化合物均具有端粒酶抑制活性，其中，3，6，9-三取代物活性最強(qiáng)，其他方式的取代其活性都有不同程度的降低。Heald等人報(bào)道了一組吖啶鹽類(lèi)化合物50～55，在端粒重復(fù)擴(kuò)增分析(TRAP)法評(píng)價(jià)中，這些化合物都顯示出良好的端粒酶抑制活性，化合物52、53的活性尤為突出，構(gòu)效關(guān)系研究說(shuō)明:N上甲基取代優(yōu)于乙基，小分子基團(tuán)有利于活性的提高;陰離子決定化合物的水溶性，陰離子為I-時(shí)水溶性較MeOSO-3差;當(dāng)R由甲基變?yōu)镕取代時(shí)，對(duì)四鏈體等結(jié)構(gòu)選擇性增強(qiáng)，如與化合物52(RHPS3)相比，53(RHPS4)對(duì)三鏈體和四鏈體DNA等結(jié)構(gòu)有較好的選擇性，而且溶于水，在pH值5.0～9.0的條件下保持穩(wěn)定，能有效地導(dǎo)入到腫瘤細(xì)胞中，已成為此類(lèi)端粒酶抑制劑的先導(dǎo)化合物，有待于更深一步的研究。2.7噻唑酮類(lèi)Hayakawa等人對(duì)包含16000個(gè)合成化合物庫(kù)進(jìn)行了篩選，篩選出4個(gè)強(qiáng)端粒酶抑制活性的噻唑酮類(lèi)化合物56～59，構(gòu)效關(guān)系研究說(shuō)明:芳環(huán)上引入吸電子基團(tuán)有利于活性提高，取代基的位置與類(lèi)型也對(duì)化合物活性有一定的影響，間位取代優(yōu)于對(duì)位取代，如化合物56(TMPI)抑制端粒酶的活性最強(qiáng)(TRAP評(píng)價(jià)法)，L50值達(dá)1μmol·L-1，優(yōu)于化合物58、59，其對(duì)真核生物DNA聚合酶α、β以及人艾滋病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(HIVRT)等無(wú)抑制作用，因此對(duì)端粒酶具有高選擇性。研究顯示，用1mmol·L-1的二硫蘇糖醇或者谷胱甘肽能抑制TMPI的作用，這種抑制可能作用于半胱氨殘基，TMPI對(duì)端粒酶的作用有助于尋找新型抗腫瘤藥物。2.8其他類(lèi)Kakiuchi等人研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物60(TELIN)，在無(wú)細(xì)胞體系TRAP評(píng)價(jià)中發(fā)現(xiàn)，TELIN是一個(gè)強(qiáng)端粒酶抑制劑，端粒酶抑制活性的L50值為0.3μmol·L-1。動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)顯示，TELIN不是與DNA蛋白結(jié)合而是與端粒酶蛋白結(jié)合，是競(jìng)爭(zhēng)性與非競(jìng)爭(zhēng)性混合型端粒酶抑制劑。Yin等人研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小的線(xiàn)型分子三亞乙基四胺(61，TETA)，它具有較強(qiáng)的端粒酶抑制作用(L50=7.8μmol·L-1)，且其急性毒性較低，TE