小分子端粒酶抑制劑的研究進展

小分子端粒酶抑制劑的研究進展腫瘤的發(fā)生是多階段的復(fù)雜過程，原癌基因的激活、抑癌基因的失活是腫瘤發(fā)生的重要分子根底。腫瘤細胞獲得無限增殖特性而成為永生化細胞，在這個過程中端粒酶起了重要作用，端粒酶的激活使腫瘤細胞的端粒不再進行性縮短而得以維持，避開了細胞正常的復(fù)制-衰亡機制的制約。研究發(fā)現(xiàn)，近90%的腫瘤細胞都有端粒酶活性，而正常細胞或組織中幾乎沒有檢測到端粒酶活性。端粒酶已成為當今腫瘤新的標志物和腫瘤治療的新靶點，抑制端粒酶的活性已成為腫瘤治療的一種新策略。本文作者就近年來出現(xiàn)的小分子端粒酶抑制劑進行綜述。1端粒和端粒酶端粒(telomere)位于真核生物染色體3'末端，是由富含鳥嘌呤的DNA重復(fù)序列和端粒結(jié)合蛋白組成的核蛋白復(fù)合物，它是染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，能防止染色體DNA降解、末端融合、缺失及非正常重組，維持染色體的完整和穩(wěn)定，端粒結(jié)構(gòu)對于保持染色體結(jié)構(gòu)的完整性具有重要意義。研究證明，端粒與細胞的壽命密切相關(guān)。細胞在進行分裂時，由于受DNA聚合酶的限制，每次分裂，染色體3'末端將持續(xù)喪失50～200b的DNA，端粒不斷縮短，當其長度減小到一定的臨界值時，細胞即趨向于衰老、死亡，因此，端粒被認為是絕大多數(shù)體細胞的“生物鐘〞。端粒酶是一種特殊的DNA聚合酶，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，它有3個主要組分:人端粒酶催化亞單位(thehumantelomerasereversetranscriptase，hTERT)、人端粒酶核糖核酸(hTR)，以及端粒酶相關(guān)蛋白(TP1/TLP1)。端粒酶能以自身的RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成端粒的重復(fù)單元TTAGGG加到人染色體末端，使端粒延長，阻止端粒隨細胞分裂而縮短，使細胞繞過衰老途徑成為永生化細胞，導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)生。一般認為，端粒酶的激活是惡性腫瘤發(fā)生過程中的一個后期事件，端粒酶使腫瘤細胞的端粒不再進行性縮短而得以維持，避開了細胞正常的復(fù)制-衰亡機制的制約而獲得永生性。端粒酶在大多數(shù)腫瘤細胞高表達而在正常細胞卻表達很少，這使得端粒酶成為人們熱衷研究的藥物作用靶點。近年來，以端粒酶為靶點的抑制劑廣被報道，例如:目前正處于Ⅰ期臨床試驗的核苷類端粒酶抑制劑GRN163L等，也有一些小分子抑制劑，如:非核苷類端粒酶抑制劑BIBR1532、吖啶類端粒酶抑制劑BRACO19、MST-312、FJ-5002等。2小分子端粒酶抑制劑2.1小檗堿及其類似物小檗堿(berberine，1)又稱黃連素，是中藥黃連的主要生物堿。小檗堿是一種異喹啉季銨生物堿，于1826年從Xanthoxylonclava樹皮中首次獲得。Naasani等人用比擬分析法對化合物數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選，并采用端粒重復(fù)序列擴增(TRAP)法對端粒酶抑制活性進行評價，結(jié)果顯示，小檗堿是一種中等強度的端粒酶抑制劑，其抑制活性的L50值約為35μmol·L-1。之后，他們又以小檗堿作為升級探針，采用比擬分析法篩選出小檗堿類似物MKT-077(2)，它對端粒酶有較強的抑制作用，L50值約為5μmol·L-1。MKT-077是一種新的含硫花青染料類抗腫瘤抑制劑，Tatsuta等人研究發(fā)現(xiàn)，它提供了一種新的抗癌機制，即它在癌細胞(如結(jié)腸、乳腺、胰腺癌等)線粒體上聚集，使得作用在線粒體上的親脂性離子化合物離域。在前期研究根底上Naasani等人又以MKT-077作為升級探針進行新一輪的篩選，發(fā)現(xiàn)了MKT-077近親衍生物FJ-5002(3)，其L50值為2μmol·L-1，為小檗堿的17倍，具有較強的抑制活性。研究顯示，將白血病細胞U937和不同濃度的FJ-5002共同長時間培養(yǎng)，會引起不同程度的端粒喪失(從約10b到近4.0kb)及染色體不穩(wěn)定性和老化/危像特征，而且呈現(xiàn)出濃度依賴性，說明FJ-5002能有效地抑制端粒酶的活性。近年來，對化合物1～3的研究報道很少，Wadhwa等人進行體內(nèi)活性研究發(fā)現(xiàn)MKT-077沒有表現(xiàn)出良好的端粒酶抑制活性，實驗結(jié)果顯示，對端粒酶抑制作用不是MKT-077誘導(dǎo)的癌細胞毒性作用的主要原因，因此已經(jīng)停止進一步的研究。2.2苯乙烯類Kim等人對化合物庫進行虛擬篩選得到3個硝基苯乙烯類化合物DPNS(4)、DNS(5)、NVN(6)，他們均表現(xiàn)出一定的抑制端粒酶活性(L50值分別為0.4、2.7、2.57μmol·L-1)，其中化合物DPNS(4)的活性最正確，但它對DNA聚合酶、RNA聚合酶以及逆轉(zhuǎn)錄酶沒有抑制作用。一系列的酶動力學實驗證明DPNS是一個混合型的非競爭性抑制劑，與端?；孜镆约叭姿崦撗鹾颂呛塑?dNTP)的抑制鍵合位點不同。在DPNS的存在下，隨著腫瘤細胞株的增殖其端粒顯著缺失，最終趨于衰老凋亡。由此可見，DPNS是一個高選擇性的體外端粒酶小分子抑制劑，具有進一步研究開發(fā)的價值。勃林格殷格翰公司開發(fā)的芳基乙烯類端粒酶抑制劑BIBR1532(7)、BIBR1519(8)體外抑制端粒酶活性的L50值分別為93、470nmol·L-1。研究說明，BIBR1532(7)能選擇性地抑制端粒酶的活性，使端粒縮短，細胞生長阻滯，限制了癌細胞的增殖。Damm等人研究發(fā)現(xiàn)，BIBR1532對鞍區(qū)生殖細胞瘤(GCT)衍生的細胞株2102EP細胞有顯著的抑制作用。在10μmol·L-1BIBR1532條件下培養(yǎng)2102EP細胞株，當細胞群體倍增值(PDs)到達300時，端粒的長度從(18.5±0.59)kb降至(8.9±0.1)kb。Mueller等人研究發(fā)現(xiàn)，BIBR1532對顱骨軟骨肉瘤細胞端粒酶具有強的抑制作用，可縮短端粒的長度，降低含端粒酶的顱骨軟骨肉瘤細胞的生長能力。Parsch等人合成了與BIBR1532構(gòu)型相反的化合物221-32(9)，其活性與BIBR1532相當，研究說明此類化合物的構(gòu)型不是活性決定因素，這為此類化合物的作用方式研究提供了根底。2.3喹啉類多篇文獻報道喹啉和異喹啉類化合物顯示出良好的生物活性，尤其是在酶抑制劑中得到廣泛的應(yīng)用。例如:Colangelo等人報道的鉑化合物ptquin8(10)具有顯著的抑制端粒酶活性。體外腫瘤細胞MCF-7模型試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在1×10-9mol·L-1和1×10-5mol·L-1的ptquin8作用下，24h后端粒酶活性分別降低了12%和46%。Kim等人報道了化合物2，3，7-三氯-5-硝基喹喔啉(TNQX，11)，它是一個混合型的非競爭性端粒酶抑制劑(L50值為0.14μmol·L-1)，它對DNA聚合酶、RNA聚合酶以及逆轉(zhuǎn)錄酶沒有抑制作用。白葉藤堿(cryptolepine，12)是一種天然的吲哚喹啉類生物堿，此化合物及其鹽酸鹽在非洲曾經(jīng)作為抗瘧疾藥物，分子水平研究證實白葉藤堿能影響DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的活性。最新研究發(fā)現(xiàn)，一些白葉藤堿結(jié)構(gòu)衍生物能與DNA的G-四鏈體結(jié)構(gòu)相互作用并且顯示出一定的端粒酶抑制活性。Zhou等人設(shè)計了一系列喹叨啉(quindoline，13)類似物14～23，以尋找新型的端粒酶抑制劑。構(gòu)效關(guān)系研究說明:在喹叨啉11位引入供電子基團(如取代氨基等)，其端粒酶抑制活性顯著提高(L50值:喹叨啉大于138μmol·L-1，衍生物14～23為0.44～12.3μmol·L-1)，其中化合物21(SYUIQ-5)的活性最好，其L50值為0.44μmol·L-1，在裸鼠中的藥動學性質(zhì)具有劑量依賴性，主要通過Cyp3A1/2進行代謝。Lu等人對SYUIQ-5進行改造，設(shè)計了26個5-N-甲基喹叨啉化合物(如24～27)，此類化合物在芳喹啉的5位帶有正電荷。核磁共振以及分子模擬研究證實，化合物分布在外部G-四鏈體以及正電荷的引入能夠增強化合物的穩(wěn)定性?；衔?4在一無細胞體系中能顯著抑制端粒酶的活性，其對白血病細胞HL60、淋巴瘤細胞CA46增殖的長期效應(yīng)實驗顯示，24能夠誘導(dǎo)細胞增長的中斷、細胞衰老以及端粒的縮短等過程?；衔?5與不同類型的DNA有強的結(jié)合能力，與G-四鏈體結(jié)構(gòu)的結(jié)合尤為突出。在前期研究的根底上，Tan等人以SYUIQ-5作為參考分子設(shè)計合成了4個依靛藍酮類化合物28～31，4個化合物均表現(xiàn)出端粒酶抑制活性(L50值分別為7.8、9.3、9.0、15.2μmol·L-1)，用端粒限制性片段(telomericrestrictionfragment，TRF)長度法對化合物28在白血病細胞HL60、淋巴瘤細胞CA46中進行端粒酶活性評價，結(jié)果顯示，在0.9μmol·L-1時HL60、CA46細胞端粒長度均發(fā)生縮短，濃度達1.8μmol·L-1時兩者端粒分別縮短為1.1kb和2.3kb。2.4蒽醌類蒽醌類化合物具有瀉下、抗菌消炎作用，其抗癌作用也不斷被報道。自20世紀60年代意大利科學家首先研究并證實了柔紅霉素及阿霉素的療效以來，蒽醌類抗腫瘤藥物得到了很大的開展，目前，已有多種蒽醌類藥物應(yīng)用于臨床。Huang等人報道了兩類雙取代的蒽醌類化合物32、33，這兩類化合物具有良好的抑制端粒酶活性。構(gòu)效關(guān)系研究說明:當取代基R為CH2NHCH2CH3和CH(CH3)NH(CH2)3N(CH3)2時，1，5-二氨基取代蒽醌類化合物(32)的活性最好，L50值分別為5.0、2.0μmol·L-1;氮原子上烷基取代鏈延長、縮短，或者沒有氮原子連接，活性有不同程度的降低，而1位、5位被硫原子以及酰氧基取代時，活性保持不變。當R基團為CH2NHCH2CH3時，2，6-二氨基取代蒽醌類化合物(33)的活性最正確，L50值為0.1μmol·L-1;氮原子上烷基鏈增長，活性略有降低(如R為CH2NHCH2CH2CH3，L50值降為2μmol·L-1)。在前期構(gòu)效關(guān)系研究的根底上，Huang等人又對這類化合物做了進一步的結(jié)構(gòu)改造，在蒽醌母核的1、2位拼上氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，得到系列化合物34，該系列化合物雖然只具有中等端粒酶抑制活性，但卻顯示出良好的細胞毒性。2.5黃酮類黃酮類化合物廣泛存在于植物界，其生物活性多種多樣，近年來其防癌與抗癌活性成為人們研究的熱點，含有黃酮結(jié)構(gòu)的端粒酶抑制劑也陸續(xù)被報道。四羥基黃酮類化合物35端粒酶抑制活性的L50值為0.2μmol·L-1，Menichincheri等人對其進行結(jié)構(gòu)改造設(shè)計合成了一系列衍生物36～39，L50值依次為0.82、0.6、0.80、0.13μmol·L-1，其中，化合物39的活性優(yōu)于先導(dǎo)化合物35。將C環(huán)鄰羥基用取代的咪唑環(huán)替換，并將B環(huán)羥基用甲氧基替換得到化合物40，其活性與先導(dǎo)化合物相當，L50值為0.47μmol·L-1，而其結(jié)構(gòu)與先導(dǎo)物35相比有較大改變，可以作為新的結(jié)構(gòu)類型進行更深入的研究。Liu等人報道了一系列新型的含黃酮結(jié)構(gòu)的2-氯吡啶衍生物41～45，并對所有化合物進行了細胞毒活性、Taq聚合酶以及端粒酶活性評價，結(jié)果顯示，化合物44、45對細胞株SGC-7901的細胞毒活性［L50值分別為(22.28±6.26)mg·L-1和(18.45±2.79)mg·L-1］優(yōu)于陽性對照藥5-氟尿嘧啶［L50值為(7.38±0.98)mg·L-1］，化合物41～45均具有一定的端粒酶抑制活性，其中，化合物44的活性最正確，L50值為(0.8±0.07)μmol·L-1。構(gòu)效關(guān)系研究說明:黃酮母核2位或7位羥基被2-氯吡啶芐基取代時活性增強(44、45)，5位為羥基時活性顯著提高(44)，因此推測5位羥基可能為此類化合物活性的必需基團。為了研究此類化合物的作用機制，Liu等人又以活性最好的化合物44與端粒酶活性靶點(PDB3DU6)進行分子模擬對接，對接示意圖及結(jié)合模式見圖1，對接結(jié)果顯示:化合物44的1位氧、4位羰基和5位羥基、7位醚鍵氧原子、C環(huán)嘧啶上氮原子分別與Gln308、Arg194、Asp254、Gly314等氨基酸殘基形成4個氫鍵，2-氯吡啶環(huán)插入到由Lys189、Asn369、Ile252、Arg253組成的疏水口袋內(nèi)，對化合物的活性有著很重要的影響。除上述黃酮類化合物之外，一些黃酮類似物也被陸續(xù)報道具有抑制端粒酶活性。Rao等人檢測了14個合成或者天然的化合物在人類肺腺癌A549株中對端粒酶的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃酮衍生物46(HTMC)具有強的端粒酶抑制活性，在50μmol·L-1HTMC作用下，24h后肺癌細胞A549細胞增殖降低59%，HTMC還能降低人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的表達。進一步研究發(fā)現(xiàn)，HTMC對端粒酶以及人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶活性的抑制是通過釋放Ca2+離子來實現(xiàn)的。Seimiya等人報道的表沒食子兒茶素沒食子酸酯類似物47(MST-199)也是一個黃酮衍生物，其端粒酶抑制活性的L50值達0.38μmol·L-1，這些化合物的發(fā)現(xiàn)為黃酮類抗癌藥物的研究提供了新的方向。2.6吖啶類安吖啶是第一個吖啶類抗癌藥，由Cain等人于1974年首次合成，其抗癌作用機制類似于蒽醌類，它與腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對有相互作用，從而阻止DNA作為DNA復(fù)制和RNA合成的模板。近年來陸續(xù)有文獻報道吖啶類端粒酶抑制劑，Gowan等人報道了3，6，9-三取代的吖啶類端粒酶抑制劑BRACO19(48)，這個化合物是當時發(fā)現(xiàn)的最具潛力的無細胞體系端粒酶抑制劑，L50值為(115±18)nmol·L-1，而且不會引起急性細胞毒性。Harrison等人合成了一些BRACO19的類似物，通過改變?nèi)〈奈恢?，得?，6，9-、2，7，9-、3，6，9-三取代的吖啶類衍生物(49)，活性研究結(jié)果證實，這些化合物均具有端粒酶抑制活性，其中，3，6，9-三取代物活性最強，其他方式的取代其活性都有不同程度的降低。Heald等人報道了一組吖啶鹽類化合物50～55，在端粒重復(fù)擴增分析(TRAP)法評價中，這些化合物都顯示出良好的端粒酶抑制活性，化合物52、53的活性尤為突出，構(gòu)效關(guān)系研究說明:N上甲基取代優(yōu)于乙基，小分子基團有利于活性的提高;陰離子決定化合物的水溶性，陰離子為I-時水溶性較MeOSO-3差;當R由甲基變?yōu)镕取代時，對四鏈體等結(jié)構(gòu)選擇性增強，如與化合物52(RHPS3)相比，53(RHPS4)對三鏈體和四鏈體DNA等結(jié)構(gòu)有較好的選擇性，而且溶于水，在pH值5.0～9.0的條件下保持穩(wěn)定，能有效地導(dǎo)入到腫瘤細胞中，已成為此類端粒酶抑制劑的先導(dǎo)化合物，有待于更深一步的研究。2.7噻唑酮類Hayakawa等人對包含16000個合成化合物庫進行了篩選，篩選出4個強端粒酶抑制活性的噻唑酮類化合物56～59，構(gòu)效關(guān)系研究說明:芳環(huán)上引入吸電子基團有利于活性提高，取代基的位置與類型也對化合物活性有一定的影響，間位取代優(yōu)于對位取代，如化合物56(TMPI)抑制端粒酶的活性最強(TRAP評價法)，L50值達1μmol·L-1，優(yōu)于化合物58、59，其對真核生物DNA聚合酶α、β以及人艾滋病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(HIVRT)等無抑制作用，因此對端粒酶具有高選擇性。研究顯示，用1mmol·L-1的二硫蘇糖醇或者谷胱甘肽能抑制TMPI的作用，這種抑制可能作用于半胱氨殘基，TMPI對端粒酶的作用有助于尋找新型抗腫瘤藥物。2.8其他類Kakiuchi等人研究發(fā)現(xiàn)了一個1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生物60(TELIN)，在無細胞體系TRAP評價中發(fā)現(xiàn)，TELIN是一個強端粒酶抑制劑，端粒酶抑制活性的L50值為0.3μmol·L-1。動力學試驗顯示，TELIN不是與DNA蛋白結(jié)合而是與端粒酶蛋白結(jié)合，是競爭性與非競爭性混合型端粒酶抑制劑。Yin等人研究發(fā)現(xiàn)了一個小的線型分子三亞乙基四胺(61，TETA)，它具有較強的端粒酶抑制作用(L50=7.8μmol·L-1)，且其急性毒性較低，TE