《嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中7種母乳低聚糖的測定》（征求意見稿）

2嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中7種母乳低聚糖的測定DetectionofSevenHumanMilkOligosaccharidesPowder本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中母乳低聚糖含量的方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方乳粉和調(diào)制乳粉中母乳低聚糖的測定。2原理此方法可對七種母乳低聚糖進(jìn)行定量（2'-FL、3-FL、3'-SL、6'-SL、LNT、LNnT、DFL）。樣品經(jīng)水提取后，以淀粉葡萄糖苷酶或復(fù)合添加淀粉葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶進(jìn)行酶解，衍生后用熒光檢測器檢測，內(nèi)標(biāo)法定量。3試劑和材料除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級水。3.1試劑3.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。3.1.2乙酸（CH3COOH）。3.1.3甲酸銨（NH4HCO2）：色譜純。3.1.4二甲基亞砜（C2H6OS）。3.1.52-甲基吡啶硼烷復(fù)合物（C6H10BN）。3.1.62-氨基苯甲酰胺（C7H8N2O）。3.1.7淀粉葡萄糖苷酶溶液（3260U/mL）：Megazyme提供，E-AMGDF-40ML，4°C保存。3.1.8β-半乳糖苷酶溶液（4000U/mL）：Megazyme提供，E-BGLAN，4°C保存。3.2試劑配制3.2.150mM甲酸銨溶液：稱取6.3g甲酸銨，用水溶解并稀釋至2000mL。3.3標(biāo)準(zhǔn)品.22'-巖藻糖基乳糖（2'-FLC18H32O15，CAS號：41263-94-9）3-巖藻糖基乳糖（3-FLC18H32O15，CAS號：41312-47-4：純度≥98%。純度≥90%。33.3.33.3.43.3.53.3.6.83'-唾液酸乳糖鈉鹽（3'-SL）（C23H38NO19Na，CAS號：128596-80-5）：純度≥98%。6'-唾液酸乳糖鈉鹽（6'-SL）（C23H38NO19Na，CAS號：157574-76-0）：純度≥98%。乳糖-N-四糖（LNT）（C26H45NO21，CAS號：14116-68-8）：純度≥95%。乳糖-N-新四糖（LNnT）（C26H45NO21，CAS號：13007-32-4）：純度≥98%。乳糖二巖藻糖基四糖（DFL）（C24H42NO19，CAS號：20768-11-0）：純度≥95%。昆布三糖（C18H32O16，CAS號：3256-04-0）：純度≥95%。3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制3.4.1混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取2'-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、3'-唾液酸乳糖鈉鹽、6'-唾液酸乳糖鈉鹽、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、乳糖二巖藻糖基四糖各10mg（精確至0.1mg），置于10mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻。3.4.2內(nèi)標(biāo)儲備液（100mg/L）：準(zhǔn)確稱0.01g（精確至0.1mg）昆布三糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻。200μL、500μL，置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液的濃度分別為：1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L，臨用現(xiàn)配。4儀器和設(shè)備4.1高效液相色譜儀：帶熒光檢測器。4.2渦旋振蕩器。4.3水浴鍋4.4天平：感量為0.1mg和0.01g。4.5磁力攪拌器。4.6離心機(jī)。4.70.45μmPTFE濾膜。5分析步驟5.1試樣制備乳粉充分混勻后，取適量有代表性的試樣。稱取25.0g（精確至0.01g）試樣于燒杯中，然后加水?dāng)嚢柚镣耆芙?，轉(zhuǎn)移并定容至250mL容量瓶中?；靹蚝笤偃?.0mL溶解后的樣液，置于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。5.2酶解5.2.1添加低聚半乳糖的樣品量取0.1mL稀釋后的樣品提取液于2mL微量離心管中，加入50μL淀粉葡萄糖苷酶溶液（3.1.7）和10μLβ-半乳糖苷酶溶液（3.1.8），混勻，于60°C的水浴中酶解60min。同時，再量取0.1mL稀釋后的樣品提取液于另一2mL微量離心管中，加入50μL淀粉葡萄糖苷酶溶液（3.1.7），混勻，于60°C的水浴中酶解60min。5.2.2不添加低聚半乳糖的樣品量取0.1mL稀釋后的樣品提取液于2mL微量離心管中，加入50μL淀粉葡萄糖苷酶溶液（3.1.7），混勻，于60°C的水浴中酶解60min。45.3試液衍生化經(jīng)過酶解后的樣品，加入10μL內(nèi)標(biāo)儲備液（3.4.2）和0.1mL衍生試劑（3.2.2充分混勻，在65°C水浴中恒溫60min，取出冷卻至室溫。向微量離心管中加入乙腈并定容至1mL，渦旋混合，過0.45μmPTFE濾膜后，待測。另取0.1mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.4.3），與試樣同步進(jìn)行衍生。5.4儀器參考條件5.4.1色譜柱分析柱：XBridgeGlycanBEHAmide，2.5μm（填料粒徑）或相當(dāng)者。保護(hù)柱：XBridgeGlycanBEHAmide，2.5μm（填料粒徑）或相當(dāng)者。5.4.2柱溫：60℃。5.4.3進(jìn)樣量：10μL。5.4.4流速：0.8mL/min。5.4.5流動相：A為乙腈，B為50mM甲酸銨溶液。梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序（min）流速（mL/min）流動相A流動相B0.000.8904.000.89038.000.839.000.88042.000.88042.100.89048.000.8905.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（3.4.3）的衍生液分別注入高效液相色譜儀中，測定相應(yīng)的色譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)因子為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中響應(yīng)因子定義為目標(biāo)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值。5.6試樣溶液的測定在相同色譜條件下，將制備的試樣溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析。以保留時間定性，內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)線性回歸方程計算出試樣溶液中母乳低聚糖的濃度。6分析結(jié)果的表述6.1試樣中母乳低聚糖單體含量的計算公式試樣中母乳低聚糖單體的含量按式（1）計算：……（1）5式中：Xi——試樣中母乳低聚糖單體的含量，單位為毫克每百克（mg/100g），i代表7種母乳低聚糖；C——試樣測定液中母乳低聚糖的濃度，單位為微克每毫升(μg/mLV——初始稀釋體積，單位為毫升（mL）；DF——添加內(nèi)標(biāo)前任何額外稀釋的稀釋系數(shù)（最終體積/等分試樣體積），單位為毫升每毫升（mL/mL）；m——試樣的稱樣量，單位為克（g）；10——將濃度單位從μg/g換算為mg/100g的換算系數(shù)。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。6.2試樣中母乳低聚糖總量的計算公式試樣中母乳低聚糖總量的含量按式（2）計算X=X2’-FL+X3-FL+X3’-SL+X6’-SL+XLNnT+XLNT+XDFL （2）式中：X——試樣中母乳低聚糖的總量，單位為毫克每百克（mg/100g）。計算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7精密度在重復(fù)性條