食品微生物檢驗方法手段

第四章

食品微生物檢驗方法手段在食品微生物學(xué)檢驗過程中，需要采用很多方法和手段。下面就幾種常用的檢驗方法作一些根本介紹。一、顯微鏡檢驗在食品微生物學(xué)檢驗中，為了能夠發(fā)現(xiàn)微生物或觀察其形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)，必須借助于顯微鏡。顯微鏡觀察的微生物標(biāo)本一般分為兩種：染色標(biāo)本和不染色標(biāo)本?！惨弧巢蝗旧珮?biāo)本的檢驗在食品微生物學(xué)檢驗中，檢驗不染色標(biāo)本是為了觀察微生物細(xì)胞在生活時期原有的形態(tài)、大小及確定細(xì)胞能否運動等。不染色標(biāo)本的根本制片方法有以下兩種：1、壓滴法在載波片上加一滴生理鹽水，再在其中滴加少許要觀察的含菌液體或少量要觀察的固體培養(yǎng)物，使菌體均勻分布在生理鹽水中，然后蓋上蓋玻片，即可進(jìn)行鏡檢。2、懸滴法將待觀察的含菌液體滴在蓋玻片上，然后將其反扣在凹玻片上，使液滴懸掛在凹室內(nèi)?！捕橙旧珮?biāo)本的檢驗染色標(biāo)本是將檢驗標(biāo)本根據(jù)檢驗?zāi)康?，按一定的方法涂片固定，用適當(dāng)?shù)娜玖先旧傻臉?biāo)本。經(jīng)過染色，微生物細(xì)胞與其背景的色差增加，鏡檢時更加清晰可見。染色標(biāo)本除能顯示微生物的形態(tài)、排列和一定的構(gòu)造外，還能顯示某些細(xì)胞成分的性質(zhì)及其分布的位置、區(qū)別活菌與死菌、鑒定微生物的種類。革蘭氏染色法革蘭氏染色法盧戈氏碘液媒染1min95%乙醇脫色20-30s番紅花紅復(fù)染1-2min革蘭氏染色法呈現(xiàn)第一次染色效果-紫色，革蘭氏染色陽性菌呈現(xiàn)第二次染色的效果-紅色革蘭氏染色陰性菌二、培養(yǎng)檢驗在食品微生物學(xué)檢驗中，別離培養(yǎng)是一項非常重要的工作，它對進(jìn)一步確定微生物的種類和研究它們的特性等都具有重要意義。微生物的接種和培養(yǎng)接種工具有：接種針、環(huán)、鉤、玻璃涂棒、接種圈、接種鋤、小解剖刀1．接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀A劃線接種：是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基外表作來回直線形的移動就可到達(dá)接種的目的。常用的接種工具是接種環(huán)、接種針。劃線接種是在斜面接種和平板劃線中常用的方法。B三點接種〔點植法〕：在研究霉菌的形態(tài)時常用此法。它是把少量的微生物接種在平板外表成等邊三角形的三點上，讓它各自獨立形成菌落來觀察研究它們的形態(tài)。除三點外，還有一點或多點接種的。C穿刺法接種：在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時常用此法。所用工具是接種針，培養(yǎng)基是半固體培養(yǎng)基。具體做法：用接種針蘸取少量菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺，如某細(xì)菌具有鞭毛而能運動，那么在穿刺線周圍能夠生長。D澆混接種〔傾注法〕：是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后倒入冷卻至45左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就到達(dá)了稀釋的目的。待平板凝固后，置適宜溫度下培養(yǎng)，就可長出單個生物菌落。E涂布接種〔涂布法〕：與傾注法略有不同,即先倒好平板，讓其凝固，然后將菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在外表作來回左右的涂布，讓菌液分布均勻，就可長出單個的微生物菌落。

F液體接種：

從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，到入液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中，或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固體培養(yǎng)基中都可稱液體接種。G注射接種：

是用注射的方法，將待接的微生物轉(zhuǎn)至活的生物體內(nèi)如人或其他動物中，常見的是疫苗預(yù)防接種，來預(yù)防某些疾病。H活體接種：是專門用于培養(yǎng)病毒或其他病原微生物的一種方法，因為病毒必須接種于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖?；铙w可以是整個動物也可以是某個離體的活組織如猴腎，也可以是發(fā)育的雞胚。接種的方式是注射，也可以是拌料喂養(yǎng)。在食品微生物學(xué)檢驗中，根據(jù)被檢材料的不同和檢驗步驟中的要求不同，在同一種培養(yǎng)基上可以有不同的接種方法。在進(jìn)行菌落總數(shù)測定時，用的是傾注法接種，再進(jìn)行各種被檢微生物得別離時，常采用劃線法接種，雖然他們用的都是瓊脂平板，但接種方法各異。食品微生物學(xué)檢驗中常用的接種方法有涂布法、劃線法、傾注法、定植法、穿刺法。傾注平板法〔2〕微生物的培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)時是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)：這種微生物在培養(yǎng)時，需要有氧氣參加，否那么不能生長良好，實驗是中斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床震蕩，使外界的空氣源源不斷的進(jìn)入瓶中。厭氧培養(yǎng)：這類微生物在培養(yǎng)時，不需要氧氣參加。在厭氧微生物的培養(yǎng)過程中，最重要的一定是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。可采用以下方法除去氧氣。〔1〕降低培養(yǎng)基中的氧化復(fù)原電位：常將復(fù)原劑谷胱甘肽，硫基酸鹽等，加如到培養(yǎng)基中，即可到達(dá)目的，有的將一些動物死的或活的組織如牛心羊腦參加到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長?！?〕化合去氧法：主要有焦性沒食酸吸收氧氣，用磷吸收氧氣；用好氧菌與厭氧菌混合培養(yǎng)吸收氧氣，用植物的組織如發(fā)芽的種子吸收氧氣，用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。〔3〕隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)，用石蠟油封存，半固體穿刺培養(yǎng)〔4〕替代驅(qū)氧：用CO2驅(qū)代氧，用氮氣驅(qū)代氧，用真空驅(qū)代氧，用氫氣驅(qū)代氧，用混合氣體驅(qū)代氧2．培養(yǎng)結(jié)果的觀察各種微生物經(jīng)過培養(yǎng)后，表現(xiàn)出一定特征，這在食品微生物學(xué)檢驗中，是鑒別微生物種類的重要依據(jù)。〔1〕固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征的觀察細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上，經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)，即可出現(xiàn)肉眼可見的菌落，每種細(xì)菌都有一定的菌落形態(tài)和特征，主要包括菌落的大小、形狀、邊緣形態(tài)、顏色、透明度等觀察菌落的形態(tài)特征，通常先用肉眼觀察，再用放大鏡仔細(xì)觀察，必要時可用低倍鏡觀察?！?〕液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)特征的觀察主要是液體的渾濁度是否產(chǎn)生沉淀，液體外表有無菌膜形成，有無附著菌環(huán)，培養(yǎng)液的顏色以及是否產(chǎn)氣等?！?〕半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)特征的觀察主要是其是否需氧及其運動情況，是在上部還是在下部深層生長，是沿穿刺線生長還是樹根樣生長?！踩成瘜嶒灨鞣N微生物含有各自獨特的酶系統(tǒng)，用于進(jìn)行代謝活動，在代謝過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物也有各自的特點，可借此區(qū)別和鑒定微生物的種類。利用這種特點可鑒別微生物。生化試驗或生化反響是通過利用生物化學(xué)的方法來測定微生物的代謝產(chǎn)物、代謝方式和條件等來鑒別細(xì)菌的類別、屬種的試驗。在進(jìn)行生化實驗時，必須采用純培養(yǎng)，嚴(yán)禁其他種類的微生物污染，否那么會出現(xiàn)錯誤的結(jié)果，生化實驗工程很多，應(yīng)根據(jù)檢驗?zāi)康倪m中選擇。1.糖醇類代謝試驗此類實驗主要用于觀察微生物對某些糖類分解的能力以及不同的分解產(chǎn)物，從而進(jìn)行微生物的鑒定，常見的實驗有以下幾種〔1〕糖醇類發(fā)酵試驗不同的微生物可對各種糖類、醇類等進(jìn)行分解，但不同的微生物的分解能力和產(chǎn)物都不相同，如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖〔產(chǎn)酸產(chǎn)氣〕，沙門氏菌只分解葡萄糖不能分解乳糖〔只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣〕。根據(jù)這一特點，在進(jìn)行大腸菌群測定時，可采用乳糖發(fā)酵實驗，當(dāng)大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時，培養(yǎng)基內(nèi)的溴甲酚紫指示劑由藍(lán)紫色變?yōu)辄S色。乳糖膽鹽發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象〔2〕甲基紅實驗?zāi)承┪⑸锶绱竽c桿菌、志賀氏菌等，在糖代謝過程中能分解葡萄糖產(chǎn)生多種有機酸，酸類增多會使培養(yǎng)物的濃度增大。當(dāng)培養(yǎng)基的PH低于4.5時，甲基紅指示劑是紅色〔陽性反響〕；有些細(xì)菌產(chǎn)酸量少，培養(yǎng)基的PH保持在6.2以上，指示劑呈現(xiàn)黃色〔陰性反響〕〔3〕V-P試驗?zāi)承┪⑸锬芊纸馄咸烟钱a(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸經(jīng)縮合、脫羧生成中性的乙酰甲基甲醇，在堿性環(huán)境中被空氣中的氧氣氧化生成二乙酰，在萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰與蛋白胨中所含的胍基成分作用生成紅色化合物，即V-P試驗陽性。1.糖醇類代謝試驗〔4〕七葉苷水解試驗原理：七葉苷被細(xì)菌分解后，生成葡萄糖和七葉素，七葉素與Fe2+結(jié)合，生成黑色化合物，使培養(yǎng)基呈黑色，以此鑒別細(xì)菌。試驗方法：將待試純培養(yǎng)物少許，接種于七葉苷培養(yǎng)基，于36±1℃培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。結(jié)果觀察與記錄〔1〕培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃睾谏撸瑸殛栃?，記錄?〔2〕培養(yǎng)基不變色者，為陰性，記錄-〔三〕生化實驗七葉苷水解試驗單增李斯特氏菌陽性〔5〕B-半乳糖苷酶試驗有些微生物在含有乳糖或B-半乳糖苷化合物的存在下，產(chǎn)生B-半乳糖苷酶，這種酶具有活力，經(jīng)一系列反響，使培養(yǎng)物變成深黃色?！?〕產(chǎn)硫化氫試驗〔沙門氏菌檢驗〕某些微生物如沙門氏菌、變形桿菌、枯草桿菌、酵母菌等能水解蛋白質(zhì)中含硫氨基酸〔如胱氨酸、半胱氨酸〕產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與二價鐵離子或鉛離子生成黑色的硫化鉛或硫化鐵。2－志賀氏菌3－沙門氏菌4－大腸桿菌〔3〕尿素酶檢驗〔沙門氏菌檢驗〕某些微生物如普通變形桿菌屬、檸檬酸桿菌屬、奇異變形桿菌屬、沙門氏菌的個別變種能產(chǎn)生尿素酶，分解培養(yǎng)基的尿素而產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基變成堿性，最終粉紅色指示劑〔酚紅〕變?yōu)榧t色。硝酸鹽復(fù)原試驗操作步驟：接種硝酸鹽肉湯，35℃培養(yǎng)5天，參加0.2ml的試劑A,再參加0.2ml的試劑B,輕搖混合。呈粉紅色、玫瑰紅色、橙色、棕色者說明有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽復(fù)原陽性。假設(shè)無顏色變化，須參加少量鋅粉變紅者為陰性〔硝酸鹽未被復(fù)原〕不變?yōu)殛栃浴瞾喯跛猁}已分解成氨和氮〕觸酶試驗左側(cè)陽性、右側(cè)陰性為對照4.有機酸鹽和氨鹽利用試驗〔1〕檸檬酸鹽利用試驗?zāi)承┪⑸铩伯a(chǎn)氣桿菌〕能利用氨鹽作為唯一氮源，同時利用檸檬酸鹽作為唯一碳源。他們可在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長，并分解檸檬酸鈉而生成碳酸鈉，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，培養(yǎng)基中的指示劑溴百里酚藍(lán)，由原來的草綠色變?yōu)樗{(lán)色。〔2〕丙二酸鹽利用試驗琥珀酸脫氫酶是三羧酸循環(huán)中一個重要環(huán)節(jié)。丙二酸與琥珀酸會競爭琥珀酸脫氫酶，在丙二酸濃度較高的情況下，琥珀酸脫氫酶不能被釋放出來催化琥珀酸脫氫反響，從而抑制了三羧酸循環(huán)反響進(jìn)行，微生物的生長也受到了抑制，也有些微生物在丙二酸鈉培養(yǎng)基上能夠生長，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性，溴百里酚藍(lán)，由原來的草綠色變?yōu)樗{(lán)色，說明這些微生物能夠利用丙二酸鹽。5.毒性酶試驗〔1〕卵磷脂酶試驗有些微生物能產(chǎn)生卵磷脂酶，即X-毒素，在有鈣離子存在時，能迅速分解卵磷脂，生成脂肪和水溶性磷酸膽堿，當(dāng)這些微生物在卵黃胰胨培養(yǎng)液中生長時，可出現(xiàn)白色沉淀〔脂肪〕?！?〕血漿凝固酶試驗致病性葡萄球菌〔金黃葡萄球菌〕能產(chǎn)生血漿凝固酶，他們可直接作用于血漿中的纖維蛋白，也可作用于血漿凝固酶原，是之成為血漿凝固酶，從而使抗凝的血漿發(fā)生凝固，這是鑒定致病球菌的重要指標(biāo),是否是致病球菌主要看它是否產(chǎn)生凝固酶.有凝塊均勻混濁均勻混濁生理鹽水金黃色葡萄球菌血漿凝固酶實驗〔3〕鏈激酶試驗A型溶血鏈球菌能產(chǎn)生鏈激酶〔溶解纖維蛋白酶〕，該酶能激活人體血液中的血漿蛋白酶原，形成血漿蛋白酶，而后溶解纖維蛋白。在檢驗溶血鏈球菌時，常以他們是否能溶解凝固的人血漿來判斷是否為A型溶血鏈球菌，融化的時間越短，表示該菌產(chǎn)生的鏈激酶越多。5.其他生化試驗〔氰化鉀抗性試驗〕氰化鉀是呼吸鏈末端的抑制劑，在含有氰化鉀的培養(yǎng)基中，有的微生物呼吸鏈末端受到抑制，阻斷了生物氧化，故不能生長：有的微生物那么對氰化鉀有抗性，在含有氰化鉀的培養(yǎng)基中仍然能生長。本實驗常用于腸桿菌科〔沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，食物中毒，傷寒，副傷寒，敗血癥。〕〔五〕動物試驗在食品微生物學(xué)檢驗中，動物試驗也是重要的手段之一，經(jīng)常用于病原微生物的別離與鑒定，病原微生物的致病性測定，微生物毒素的毒力測定以及免疫血清的制備。某些病原微生物或他們的代謝產(chǎn)物，接種于易感動物后，可在段時間內(nèi)發(fā)病甚至死亡。如一些沙門氏菌能產(chǎn)生強烈的腸毒素和內(nèi)毒素，將他們的培養(yǎng)液進(jìn)行家兔的靜脈注射，可是家兔在24~36小時死亡，有如經(jīng)煮沸的金黃葡萄球菌濾液進(jìn)行幼貓靜脈注射時，15~30分鐘即