05版微生物限度檢查法-課件

05版微生物限度檢查法

中國(guó)藥典2005版微生物限度檢查法在檢查項(xiàng)目、格式、語(yǔ)言表述等方面都有較多的增定和修訂。增訂中主要的有四項(xiàng)：一是三菌數(shù)測(cè)定的方法驗(yàn)證；二是控制菌檢查的方法驗(yàn)證；三是大腸菌群檢查法；四是梭菌檢查法。前言●微生物限度檢查在環(huán)境的潔凈度10000級(jí)和局部100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，其全過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，以防再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境必須定期按國(guó)家《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室(區(qū))懸浮粒子、浮游菌和沉降菌測(cè)試方法》現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。

●培養(yǎng)基、稀釋劑、實(shí)驗(yàn)器具等的滅菌，按滅菌法（見(jiàn)附錄XVII）的要求采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。培養(yǎng)溫度細(xì)菌和控制菌的培養(yǎng)溫度未改動(dòng)。霉菌和酵母菌的培養(yǎng)溫度20~25℃改為23~28℃。滅菌和培養(yǎng)溫度

一般隨機(jī)抽樣不少于檢驗(yàn)用量（2個(gè)以上最小包裝）的3倍量?！駲z驗(yàn)量指供試品一次檢驗(yàn)的用量。一般為10g或10ml；化學(xué)藥膜劑為100cm2；貴重或微量包裝的藥品可酌減（不得少于3g）。檢查沙門菌的供試品其檢驗(yàn)量增加10g或10ml。檢驗(yàn)量●供試液的制備用pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制備供試液或選用適宜的乳化劑、分散劑、中和劑制備供試液；其用量應(yīng)驗(yàn)證，在該檢驗(yàn)條件無(wú)抗菌作用。供試液制備妥后不得超過(guò)1h就加入檢驗(yàn)用培養(yǎng)基。

非水溶性供試品①供試品5g，司盤80、單硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80●②供試品10g，20ml無(wú)菌十四烷酸異丙酯和無(wú)菌玻璃珠，必要時(shí)再加適量十四烷酸異丙酯，充分振搖，使供試品溶解。然后加45℃100mlpH7.0蛋白胨氯化鈉緩沖液，振搖5-10分鐘，萃取，待油水分層后，水層過(guò)濾，貼膜培養(yǎng)。7類供試品供試液的制備，其中增訂：●非水溶性膜劑供試品化學(xué)藥膜劑取100cm2，剪碎，加100mlpH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液，浸泡，振搖，作供試液。一部中藥膜劑取50cm2，剪碎，適量的pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液（50或100ml）浸泡，振搖，以供試品浸液為供試液。（SOP2000版規(guī)定:中藥膜劑取30~50cm2，剪碎，加水100ml）。●腸溶及結(jié)腸溶制劑供試品10g，加100mlpH6.8無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（腸溶制劑）或pH7.6無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（結(jié)腸制劑）,于45℃水浴振搖，使溶解。

●氣霧劑、噴霧劑供試品取規(guī)定量供試品，置冷凍室冷凍1h，取出，迅速消毒供試品開(kāi)啟部位周圍，用無(wú)菌鋼錐鉆一小孔，放置室溫并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)容器，使拋射劑全部拋出。以無(wú)菌注射器吸出全部藥液，按標(biāo)示量加稀釋劑至足量（若含非水溶性成份，加適量無(wú)菌聚山梨酯-80液），使均勻，取相當(dāng)于10g或10ml的供試品，再稀釋成1∶10的供試液。

具抑菌活性的供試品當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，應(yīng)將供試液中的抑菌活性消除后，方能依法檢查。常用的方法有：

①培養(yǎng)基稀釋法取規(guī)定量的供試液，至較大量的培養(yǎng)基中，使單位體積內(nèi)的供試品含量減少至不具抑菌作用。測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)時(shí)，取同稀釋級(jí)2ml供試液等量分注多個(gè)平皿，按澆碟法操作，培養(yǎng)、計(jì)數(shù)。每1ml供試液所注各平皿生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)，取平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值按菌數(shù)報(bào)告規(guī)則報(bào)告菌數(shù)?？刂凭鷻z查時(shí)，可加大增菌培養(yǎng)基的用量。

②離心沉淀集菌法

取規(guī)定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20min（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分離心5min，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋劑至原規(guī)定量。

③薄膜過(guò)濾法采用開(kāi)放式薄膜過(guò)濾器。

④中和法凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋劑或培養(yǎng)基中。對(duì)藥品進(jìn)行微生物限度檢查法時(shí)，首先應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)方法的驗(yàn)證。如細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)該計(jì)數(shù)方法是否科學(xué)、準(zhǔn)確、客觀。若供試品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，計(jì)數(shù)方法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)，按供試液的制備，細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)增訂計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證菌株大腸埃希菌CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽孢桿菌、CMCC（B）63501白色念株菌CMCC(F)98001、黑曲霉菌CMCC(F)98003。菌液制備大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，白色念株菌接種真菌培養(yǎng)基、黑曲霉接種真菌培養(yǎng)基斜面，置規(guī)定溫度、時(shí)間，培養(yǎng)。取培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋成1ml含50~100cfu的菌液。

驗(yàn)證用菌株及菌液的制備

試驗(yàn)組

取規(guī)定量最低稀釋級(jí)的供試液1ml，和50~100cfu試驗(yàn)菌，每株菌做2個(gè)平板，按平板菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。采用薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)時(shí)，最后一次沖洗液中加入50-100cfu，過(guò)濾，培養(yǎng)，計(jì)數(shù)。

菌液組測(cè)定加入的試驗(yàn)菌液的菌數(shù)。

供試品對(duì)照組取規(guī)定量的供試液，按平板法測(cè)定供試品稀釋液本底的菌數(shù)。

稀釋劑對(duì)照組取稀釋液，加入試驗(yàn)菌，使菌濃度為每1ml供試液含50~100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定其菌數(shù)。驗(yàn)證試驗(yàn)應(yīng)獨(dú)立平行進(jìn)行3次，分別計(jì)算各次試驗(yàn)菌的回收率。

驗(yàn)證方法

試驗(yàn)組的菌回收率=[（試驗(yàn)組平均菌落數(shù)–供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)]×100%稀釋劑對(duì)照組的菌回收率=[（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)/菌液組的平均菌落數(shù)）]×100%結(jié)果判斷在三次平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率應(yīng)大于70%。若試驗(yàn)組的菌回收率均大于70%，符合驗(yàn)證試驗(yàn)，可按此方法測(cè)定細(xì)菌、霉菌和酵母菌數(shù)；若任一次平行試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率均小于70%，不符號(hào)驗(yàn)證試驗(yàn)，應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法、離心集菌法、過(guò)濾法、中和法等方法或這些方法聯(lián)合使用消除供試品抑菌活性，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。2.檢查法

（1）平皿法增訂陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋劑1ml，于無(wú)菌平皿中，注培養(yǎng)基，凝固，培養(yǎng)。每種計(jì)數(shù)培養(yǎng)基各做2個(gè)平板，均不得長(zhǎng)菌。修訂細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)的培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般48h，真菌72h；必要時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間5-7d。（細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間USP48-72h，Ep5d；真菌培養(yǎng)時(shí)間USP5-7d，EP5d。平皿法；平皿法和涂抹法）

在特殊情況下，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)霉菌、酵母菌或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)細(xì)菌，則應(yīng)分別點(diǎn)計(jì)霉菌、酵母菌、細(xì)菌菌落數(shù)，以菌落數(shù)高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計(jì)數(shù)結(jié)果報(bào)告。細(xì)菌數(shù)30~300，霉菌數(shù)30~100。①當(dāng)僅有1個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定，以該級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則當(dāng)同時(shí)有2個(gè)稀釋級(jí)的菌落數(shù)符合上述規(guī)定時(shí)，視兩者比值（比值為高稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值除以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值）而定。若比值不大于2，以兩稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的均值報(bào)告菌數(shù)；若比值大于2但不超過(guò)5時(shí)，以低稀釋級(jí)的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。當(dāng)出現(xiàn)比值大于5，或高稀釋級(jí)的菌落數(shù)大于或等于低稀釋級(jí)的菌落數(shù)等異常情況時(shí)，應(yīng)查明原因再行檢查，必要時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法的重新驗(yàn)證。③當(dāng)各稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)均小于30，以最低稀釋級(jí)的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。④各稀釋級(jí)的平板均無(wú)菌落生長(zhǎng)，或僅最低稀釋級(jí)的平板有菌落生長(zhǎng)，但平均菌落數(shù)小于1時(shí)，以＜1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。（2）薄膜過(guò)濾法。取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液，加至100ml稀釋劑中，混勻，過(guò)濾。用pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其它適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗方法和沖洗量同“方法的驗(yàn)證”。沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。

陰性對(duì)照試驗(yàn)取試驗(yàn)用的稀釋劑2ml同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。目的：檢驗(yàn)稀釋劑或沖洗液、吸管、濾器、培養(yǎng)基、環(huán)境和操作技術(shù)是否符合無(wú)菌性要求。

培養(yǎng)和計(jì)數(shù)培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)方法同平皿法，每片濾膜上的菌落數(shù)應(yīng)不多于100個(gè)。菌數(shù)報(bào)告規(guī)則以相當(dāng)于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報(bào)告菌數(shù)；若最低稀釋級(jí)的濾膜上無(wú)菌落生長(zhǎng)，以＜1報(bào)告菌數(shù)（1g或1ml供試品/濾膜），或1＜乘以稀釋倍數(shù)的值報(bào)告菌數(shù)。

控制菌檢查1.方法的驗(yàn)證

對(duì)供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)對(duì)檢查法的科學(xué)、準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法是否適合該藥品的控制菌檢查。若藥品的組分或原法的檢驗(yàn)條件有改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢查法應(yīng)重新驗(yàn)證。驗(yàn)證時(shí)按各品種項(xiàng)下微生物限度規(guī)定控制菌選擇相應(yīng)菌株驗(yàn)證，驗(yàn)證大腸菌群檢查法時(shí)，應(yīng)用大腸埃希菌作為驗(yàn)證菌株。驗(yàn)證試驗(yàn)按供試液的制備和控制菌檢查法的規(guī)定及下列要求進(jìn)行。

菌株大腸埃希菌CMCC（B）44102、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、乙型副傷寒沙門菌CMCC（B）50094、銅綠假單胞菌CMCC（B）10104、生孢梭菌CMCC（B）64941。

菌液制備將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物接種營(yíng)養(yǎng)肉湯、生孢梭菌新鮮培養(yǎng)物接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，培養(yǎng)18~24h，取培養(yǎng)物1ml用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液稀釋至1ml含10~100cfu。驗(yàn)證方法①試驗(yàn)組：取規(guī)定量供試液及10～100cfu試驗(yàn)菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應(yīng)控制菌檢查法進(jìn)行檢查。當(dāng)采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取供試液，過(guò)濾、沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。

②陰性菌對(duì)照組：設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的特異性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。結(jié)果判定陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查；試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。

2.檢查法供試品的控制菌應(yīng)按已驗(yàn)證的方法進(jìn)行控制菌檢查，增菌培養(yǎng)基的實(shí)際用量同“方法的驗(yàn)證”。

陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)供試品進(jìn)行控制菌檢查時(shí)，應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的加菌量為10～100cfu，方法同供試品的控制菌檢查。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對(duì)照試驗(yàn)取稀釋劑10ml加入100ml（或200ml）相應(yīng)控制菌檢查用的增菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

控制菌檢查的步驟：取供試液接種增菌培養(yǎng)基，增菌、分離培養(yǎng)，革蘭染色、生化試驗(yàn)等基本未變動(dòng)，僅一些控制菌保留了前幾項(xiàng)主要生化鑒別試驗(yàn)，刪去了一些生化鑒別方法，這樣的刪節(jié)、簡(jiǎn)寫，主要是節(jié)省篇幅。并不是刪去，可以不做。如有可疑菌落，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、革蘭染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否是要檢查的控制菌。

大腸埃希菌

取供試液10ml直接或處理后接種至100ml的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24小時(shí)，必要時(shí)可延至48小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5mlMUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5、24小時(shí)在366nm紫外光下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽(yáng)性；不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽(yáng)性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對(duì)照應(yīng)為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。

如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性、靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽(yáng)性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽(yáng)性，則應(yīng)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)、或生長(zhǎng)的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與表1所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)進(jìn)行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為大腸埃希菌。（ChP、BP、USP）大腸菌群菌落形態(tài)特征菌落疑似者再進(jìn)行確證試驗(yàn)菌落接種到膽鹽乳糖發(fā)酵管，產(chǎn)酸產(chǎn)氣報(bào)告檢出大腸菌群，否則判未檢出培養(yǎng)基菌落形態(tài)曙紅亞甲藍(lán)瓊脂呈紫黑色、紫紅色、紅色或者粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。麥康凱瓊脂呈鮮桃紅色或者粉紅色，圓形，扁平或稍凸起，邊緣整齊，表面光滑，濕潤(rùn)。大腸埃希菌在EMB、MAC上的特征生化試驗(yàn)

沙門菌修訂

取供試品10g或10ml加至200ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，為試驗(yàn)組。取10ml稀釋液加至200ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，為陰性對(duì)照組。培養(yǎng)18~24h，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。取上述培養(yǎng)物1ml，接種四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，培養(yǎng)后，劃線分離膽鹽硫乳瓊脂（或SS）或MacC(或EMB)培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)18～24h（必要時(shí)延長(zhǎng)至40～48h）。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或生長(zhǎng)的菌落不同于表中所列的特征，判供試品未檢出沙門菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落特征與表中所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選2～3個(gè)菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種培養(yǎng)18～24小時(shí)，如斜面未見(jiàn)紅色、底層未見(jiàn)黃色或斜面黃色、底層無(wú)黑色，判供試品未檢出沙門菌否則，應(yīng)取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)和血清凝集試驗(yàn)，確認(rèn)是否為沙門菌。（ChP、BP、USP）增菌培養(yǎng)預(yù)增菌取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基3瓶，每瓶各100ml，2瓶加入1：10供試液各10ml，其中1瓶加入對(duì)照菌液0.1ml(含菌量為50～100個(gè)cfu/ml)作陽(yáng)性對(duì)照，第3瓶加入稀釋劑10ml作陰性對(duì)照，培養(yǎng)18～24h后觀察。搖動(dòng)陰性對(duì)照瓶后應(yīng)清亮透明，無(wú)菌生長(zhǎng)，否則試驗(yàn)無(wú)效增菌培養(yǎng)輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶及陽(yáng)性對(duì)照培養(yǎng)瓶，分別吸取1ml各接種于1管四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h。陽(yáng)性對(duì)照管應(yīng)呈現(xiàn)混濁分離培養(yǎng)輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽(yáng)性對(duì)照增菌培養(yǎng)瓶，以接種環(huán)分別沾取1～2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂(DHL)或沙門菌志賀菌瓊脂(SS)平板及曙紅亞甲藍(lán)(EMB)瓊脂或麥康凱瓊脂平板各1個(gè)，倒置培養(yǎng)24～48h。檢查平板上有無(wú)疑似沙門菌菌落沙門菌在分離平板上的菌落形態(tài)特征見(jiàn)表平板沙門菌屬亞屬ⅠⅡⅣⅤ沙門菌亞屬Ⅲ膽鹽硫乳瓊脂(DHL)無(wú)色或微帶橙色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑、中等大小或較小，產(chǎn)H2S的菌落中心或幾乎全黑色發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色，中心帶黑色，遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株菌落與亞屬ⅠⅡⅣⅤ同沙門菌屬志賀菌屬瓊脂(S.S)無(wú)色或微帶粉色，透明或半透明，邊緣整齊、光滑，中等大小或較小，產(chǎn)H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多數(shù)菌落無(wú)黑色中心同膽鹽硫乳瓊脂平板。但發(fā)酵乳糖無(wú)黑色中心的菌落與大腸埃希菌不能區(qū)別曙紅亞甲藍(lán)瓊脂(EMB)無(wú)色或微帶橙色，透明或半透明，中等大小，邊緣整齊光滑發(fā)酵乳糖的菌株菌落為紫色。遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬ⅠⅡⅣⅤ同麥康凱瓊脂(MacC)同曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色，不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬ⅠⅡⅣⅤ同菌落特征補(bǔ)充由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無(wú)色半透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在DHL瓊脂平板上較為明顯在SS瓊脂平板上，H2S特征有時(shí)不明顯，沙門菌屬亞屬Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生H2S，在有H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別陽(yáng)性對(duì)照平板上，應(yīng)有沙門菌落形態(tài)特征的菌落生長(zhǎng)，否則，應(yīng)查明原因。若為供試品抑菌成分所致，須重新制備供試液，消除抑菌成分影響后再行檢查由于藥物的影響或非典型菌株的存在，沙門菌菌落可呈現(xiàn)非典型形態(tài)，如色澤變深，菌落粗糙等，應(yīng)注意辨別菌落與結(jié)果報(bào)告如陽(yáng)性對(duì)照平板有典型菌落生長(zhǎng)，供試品平板均未生長(zhǎng)或無(wú)疑似菌落生長(zhǎng)，則報(bào)告1g或1ml供試品未檢出沙門菌菌落傳純從每個(gè)供試品的分離平板上挑取2～3個(gè)疑似菌落(無(wú)色或微帶橙色，產(chǎn)H2S的菌落；無(wú)色或微帶橙色、不產(chǎn)H2S的菌落；紅色，產(chǎn)H2S的菌落)分別接種于三糖鐵瓊脂斜面，接種時(shí)應(yīng)以接種針輕輕接觸單個(gè)菌落中心部位，沾取培養(yǎng)物劃線于三糖鐵瓊脂斜面（或者克氏雙糖鐵瓊脂斜面，制備可以查閱相關(guān)工具書）并穿刺到底層或先穿刺底層再劃線斜面，培養(yǎng)24±2h，觀察結(jié)果三糖鐵瓊脂反應(yīng)疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng)①斜面紅色(產(chǎn)堿)，底層黑色(產(chǎn)H2S)并顯示黃色(產(chǎn)酸)；②斜面紅色，底層黃色；③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。多數(shù)沙門菌在三糖鐵瓊脂上產(chǎn)生氣體，使底層瓊脂出現(xiàn)氣泡或使瓊脂斷裂，但也有不產(chǎn)生氣體的菌種。對(duì)在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無(wú)黑色，或斜面及底層均為紅色者可以排除沙門菌。脲酶試驗(yàn)用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，劃線接種于脲瓊脂斜面，培養(yǎng)4及24h，觀察結(jié)果。紅色為陽(yáng)性反應(yīng)，沙門菌屬為陰性反應(yīng)，與變形桿菌相區(qū)別賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種在賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基中，同時(shí)接種一支不含賴氨酸的同樣培養(yǎng)基作為對(duì)照管，培養(yǎng)24～48h觀察結(jié)果。對(duì)照管黃色(產(chǎn)酸)，試驗(yàn)管呈紫色為陽(yáng)性反應(yīng)(賴氨酸脫羧產(chǎn)堿)；試驗(yàn)管黃色為陰性反應(yīng)。沙門菌應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)動(dòng)力試驗(yàn)用接種針沾取培養(yǎng)物，穿刺接種于半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂管中，培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。有動(dòng)力的細(xì)菌能在穿刺線以外的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散生長(zhǎng)使培養(yǎng)基呈混濁現(xiàn)象；無(wú)動(dòng)力的細(xì)菌僅能沿穿刺線生長(zhǎng)，不向外擴(kuò)散，培養(yǎng)基仍呈清晰透明狀；無(wú)動(dòng)力表現(xiàn)的培養(yǎng)物，應(yīng)在室溫保留2～3天后，再行觀察。沙門菌除雞雛沙門菌及無(wú)動(dòng)力的變種外，均具有周身鞭毛，能運(yùn)動(dòng)靛基質(zhì)試驗(yàn)用接種環(huán)沾取少許培養(yǎng)物，接種到蛋白胨水培養(yǎng)基中，照大腸桿菌檢查法靛基質(zhì)試驗(yàn)項(xiàng)下操作、判斷結(jié)果。沙門菌應(yīng)為陰性反應(yīng)血清學(xué)凝集試驗(yàn)?zāi)磻?yīng)的觀察將玻片前后傾斜數(shù)次，以暗色背景襯底，在良好的照明條件下進(jìn)行觀察，任何程度的凝集現(xiàn)象都是陽(yáng)性反應(yīng)。陽(yáng)性反應(yīng)通常在3min內(nèi)發(fā)生。有時(shí)因血清效價(jià)低、反應(yīng)遲緩時(shí)，應(yīng)將玻片置培養(yǎng)皿內(nèi)，并放一個(gè)濕棉球在旁邊，蓋上皿蓋，經(jīng)約20min，再觀察結(jié)果凝集試驗(yàn)的結(jié)果判定如試驗(yàn)及對(duì)照試驗(yàn)均出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為非特異反應(yīng)，須對(duì)該菌株培養(yǎng)物進(jìn)行處理后再作凝集試驗(yàn)當(dāng)培養(yǎng)物與0多價(jià)1血清未出現(xiàn)凝集現(xiàn)象時(shí)，應(yīng)以接種環(huán)取上述斜面培養(yǎng)物，置于含少量0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液的試管中，制成濃菌懸液，在100℃水浴中保溫30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷后再以此處理后的菌懸液與沙門菌0多價(jià)1血清按上法作凝集試驗(yàn)。如出現(xiàn)凝集，仍判為陽(yáng)性反應(yīng)；如不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，則為陰性反應(yīng)

銅綠假單胞菌

膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)18～24h。特征性菌落，純培養(yǎng)，革蘭染色，鏡檢及氧化酶試驗(yàn)，綠膿菌素試驗(yàn)。若疑似菌為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試。若氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陽(yáng)性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性及綠膿菌素試驗(yàn)陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的生化試驗(yàn)，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

取亞碲酸鈉肉湯（或營(yíng)養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基培養(yǎng)18~24h，必要時(shí)可延至48h的培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)24～72h。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)或生長(zhǎng)的菌落不同于表5所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。若平板上生長(zhǎng)的菌落與表5所列的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落，分別接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)18～24h。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h，作血漿凝固酶試驗(yàn)。增訂大腸菌群和梭菌檢查法。大腸菌群（Coliform或Coliformbacteria）

作為水質(zhì)糞便污染的指示菌已有80多年的歷史。大腸菌群是指在37℃生長(zhǎng)時(shí)能發(fā)酵乳糖，24h內(nèi)產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌。符合上述定義的細(xì)菌除大腸埃希菌屬外，還包括腸桿菌科的腸桿菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯菌屬。大腸菌群基本上包括了正常人畜腸道內(nèi)的全部需氧的革蘭陰性桿菌，較大腸埃希菌更具代表性，且存活時(shí)間較長(zhǎng)。故檢出大腸埃希菌，一般認(rèn)為藥品受糞便的近期污染；而檢出大腸菌群，則表示藥品受糞便的近期或遠(yuǎn)期污染。以大腸菌群作為口服藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的控制菌，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義，更能反映藥品的衛(wèi)生質(zhì)量

大腸埃希菌屬枸櫞酸菌屬克雷伯菌屬腸桿菌屬ⅠⅡⅢⅣⅠⅡⅠⅡⅢⅣⅠⅡI+-+--+-+---+M++++++------V-P------++++++C----++++-+++H2S------------乳糖（44℃）+--+-----+--大腸菌群分類1.腸桿菌中能迅速發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的4類細(xì)菌，只有大腸埃希菌才能代表人和動(dòng)物糞便的污染。樣本中撿出大腸菌群時(shí)，還得確認(rèn)是否是大腸埃希菌。直接檢查E.coli，一步到位。64年我國(guó)食品衛(wèi)生亦采用檢查大腸埃希菌，一步到位。但多數(shù)采取檢查大腸菌群，然后確定是否是糞便來(lái)源，二步到位。2.檢查大腸菌群乳糖發(fā)酵的4類菌，其衛(wèi)生學(xué)意義是相同的，都是來(lái)自人和動(dòng)物的糞便污染，檢查大腸菌群即可。WHO50年來(lái)一貫的方法，在大多數(shù)國(guó)家推行。為了與國(guó)際接軌，我國(guó)74年開(kāi)始采用國(guó)際通用的大腸菌群檢查法。3.只要是發(fā)酵型的細(xì)菌，便可認(rèn)為是大腸菌群。采用葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)檢測(cè)，包括了腸桿菌科所有的細(xì)菌。前蘇聯(lián)20世紀(jì)50年代引入我國(guó)，一直沿用到20世紀(jì)60年代初期。大腸菌群檢查方法1.食品衛(wèi)生國(guó)標(biāo)方法初發(fā)酵，3管或5管膽鹽乳糖培養(yǎng)基，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；EMB分離培養(yǎng)，挑選多個(gè)可疑菌落，復(fù)發(fā)酵確證，報(bào)告MPN。2.WHO假定試驗(yàn)，MacC肉湯或乳糖胰胨肉湯，產(chǎn)氣，假定陽(yáng)性；不產(chǎn)氣，再培養(yǎng)24h，產(chǎn)氣，假定陽(yáng)性假定陰性；不產(chǎn)氣，假定陰性。證實(shí)試驗(yàn)陽(yáng)性管接種煌綠乳糖膽鹽肉湯2管，1管37℃48h，產(chǎn)氣，報(bào)告檢出大腸菌群。1管44℃24h，產(chǎn)氣，報(bào)告檢出耐熱大腸菌群

大腸菌群的檢查方法是成熟的，在食品大腸菌群檢查中已廣泛使用。但藥品不同于食品，有些藥品有抑菌作用，因此在藥品中檢查大腸菌群，必須采用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)供試品進(jìn)行處理，消除其抑菌作用后方可檢查。同時(shí)從方法學(xué)的可信度考慮，應(yīng)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。因此，推薦的大腸菌群檢查法是經(jīng)過(guò)大量考察驗(yàn)證、準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)便易行的方法。初步考察結(jié)果表明，大腸菌群的檢出率遠(yuǎn)高于大腸埃希菌，糞大腸菌群的檢出率為零。不難看出，以大腸菌群作為口服藥品的控制菌較為合理，更具實(shí)際意義。

取乳糖膽鹽發(fā)酵管3支，分別加入1：10供試液1ml(供試品量0.1g或0.1ml)，1：100供試液1ml(供試品0.01g或0.01ml)，1：1000供試液1ml(供試品0.001g或0.001ml)。另取1支乳糖膽鹽發(fā)酵管，加1ml稀釋劑，作陰性對(duì)照。各管置36±1℃培養(yǎng)18~24h，陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

乳糖膽鹽發(fā)酵管若無(wú)菌生長(zhǎng)，或有菌生長(zhǎng)但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣（或產(chǎn)酸不產(chǎn)氣），報(bào)告供試品未檢出大腸菌群；如有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，應(yīng)將產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)瓊脂或麥康凱瓊脂平板上，培養(yǎng)18～24h，。如平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，或有菌落生長(zhǎng)但不發(fā)酵乳糖、非革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌的菌落，判該管未檢出大腸菌群；如平板上生長(zhǎng)的菌落與表3所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，為革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌的菌落，應(yīng)做確證試驗(yàn)。確證試驗(yàn)

取上述平板上的可疑菌落4～5個(gè)，各接種1支乳糖發(fā)酵管，培養(yǎng)24～48h。凡產(chǎn)酸產(chǎn)氣、革蘭陰性無(wú)芽孢桿菌判該管檢出大腸菌群。反之，判該管未檢出大腸菌群。根椐檢出大腸菌群的管數(shù)，按表2報(bào)告供試品每1g或1ml的大腸菌群數(shù)。

梭菌（Clostridium）

取供試液10ml（相當(dāng)于供試品1g、1ml）2份，其中1份置80℃保溫10min后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接至100ml的0.1%新鮮庖肉培養(yǎng)基中。陰性對(duì)照加入的稀釋劑為10ml。各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)72～96小時(shí)。如試驗(yàn)管不出現(xiàn)混濁、產(chǎn)氣、消化碎肉、臭氣等現(xiàn)象，判供試品未檢出梭菌；否則，應(yīng)取上述培養(yǎng)物0.2ml，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)48～72小時(shí)。若平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長(zhǎng)，應(yīng)挑選2～3個(gè)菌落分別進(jìn)行革蘭染色和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)。

過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過(guò)氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，否則為陰性。若上述可疑菌落為革蘭陽(yáng)性梭菌，有或無(wú)卵圓形或球形的芽孢，過(guò)氧化氫酶陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。結(jié)果判斷原規(guī)定5條，刪去了1條。這4條的先后順序做了調(diào)整，突出重點(diǎn)。供試品若檢出控制菌或其他致病菌，按一次檢出為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)試。3種菌數(shù)任一項(xiàng)不合格，應(yīng)從同一批樣品中隨機(jī)抽樣，復(fù)試2次，以3次結(jié)果均值報(bào)告。眼科用藥的霉菌和酵母菌菌數(shù)復(fù)試報(bào)告，須以2次復(fù)試結(jié)果均不得長(zhǎng)菌，方可判供試品不合格。3種菌數(shù)和控制菌任一項(xiàng)不合格，判該供試品不符合規(guī)定。刪去了在特殊情況下，營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)霉菌、酵母菌，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)細(xì)菌，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌數(shù)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)進(jìn)行比較，以菌落數(shù)多的培養(yǎng)基中的菌數(shù)判斷結(jié)果。

●培養(yǎng)基增訂乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基，乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基；庖肉培養(yǎng)基，0.1%葡萄糖庖肉培養(yǎng)基，哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基。原培養(yǎng)基中的錯(cuò)別字已訂正。●試藥一部增訂11種；二部增訂7種?！裨囈涸鲇?種。●稀釋劑增訂2種。pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液無(wú)菌聚山梨酯80氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

名詞統(tǒng)一

震蕩-振搖、三角瓶-錐形瓶、大腸桿菌-大腸埃希菌、綠膿桿菌-銅綠假單胞菌、破傷風(fēng)桿菌-破傷風(fēng)梭菌、混勻-搖勻、平皿-平板、菌苔-新鮮菌苔、生藥-藥材、革蘭氏染色-革蘭染色、沙門氏菌-沙門菌、……

中國(guó)藥典2005版

微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

非無(wú)菌藥品的微生物限度標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑、對(duì)患者健康潛在的危害而制訂的。藥品的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、銷售及新藥標(biāo)準(zhǔn)制訂、進(jìn)口藥品標(biāo)準(zhǔn)復(fù)核、考察藥品質(zhì)量、仲裁、原料及輔料等檢驗(yàn)中，除另有規(guī)定外，其微生物限度均以本標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。中國(guó)藥典2005版一部

微生物限度標(biāo)準(zhǔn)

1.制劑通則、品種項(xiàng)下要求無(wú)菌的制劑及標(biāo)示無(wú)菌的制劑應(yīng)符合無(wú)菌檢查法規(guī)定。2.口服制劑2.1不含藥材原粉的制劑細(xì)菌數(shù)1g不得過(guò)103個(gè)。1ml不得過(guò)102個(gè)；霉菌和酵母菌數(shù)1g或1ml不得過(guò)102個(gè)；大腸埃希菌1g或1ml不得檢出。2.2含藥材原粉的制劑細(xì)菌數(shù)1g不得過(guò)104個(gè)（丸劑1g不得過(guò)3×104個(gè)）；1ml不得過(guò)5×102個(gè)；霉菌和酵母菌數(shù)1g或1ml不得過(guò)102個(gè)；大腸埃希菌1g或1ml不得檢出；大腸菌群數(shù)1g小于102個(gè)，1ml小于10個(gè)。2.3含豆豉、神曲等發(fā)酵成分的制劑細(xì)菌數(shù)1g不得過(guò)105個(gè)。1ml不得過(guò)103個(gè)；霉菌和酵母菌數(shù)1