常規(guī)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇方法

常規(guī)凍存方法下面以腫瘤細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞為例，介紹常規(guī)凍存細(xì)胞的詳細(xì)過(guò)程。?主要材料儀器設(shè)備：普通冰箱和-700C?-800C超低溫冰箱、液氮凍存罐、高速離心機(jī)等；凍存管：容量為1ml或1.5ml;(3)冷凍保護(hù)液：一般是以5份小牛血清、4份細(xì)胞培養(yǎng)基與1份DMSO混合而成?，F(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴溶解；(4)待凍存細(xì)胞：各種腫瘤細(xì)胞或雜交瘤細(xì)胞。?操作過(guò)程待凍存細(xì)胞懸液的制備按常規(guī)方法消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)物，制備單細(xì)胞懸液，并計(jì)算細(xì)胞總數(shù)；將細(xì)胞懸液以800?1000r/min離心5min，去上清夜；向細(xì)胞沉淀物中加入冷凍保護(hù)液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1x106?1x107個(gè)/ml；按每管1?1.5ml的量分裝于凍存管內(nèi)，擰緊管蓋；在凍存管上做好標(biāo)記，包括細(xì)胞代號(hào)及凍存日期。分級(jí)冷凍⑴先將凍存管放入普通冰箱冷藏室(4?80C)，約30min;接著將凍存管置于普通冰箱冷凍室(-100C?-200C)，約30?60min;將凍存管轉(zhuǎn)入低溫冰箱(-800C)，放置過(guò)夜；最后將凍存管投入液氮保存。記錄做好凍存記錄。記錄內(nèi)容包括凍存日期、細(xì)胞代號(hào)、凍存管數(shù)、凍存過(guò)程中降溫的情況、凍存位置以及操作人員。?凍存結(jié)果如此凍存的細(xì)胞，其存活率可達(dá)90%以上。?討論在使用DMSO前，不要對(duì)其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。高壓滅菌反而會(huì)破壞其分子結(jié)構(gòu)，以致降低冷凍保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有毒，故在配制時(shí)最好帶手套在將細(xì)胞凍存管投入液氮時(shí)，動(dòng)作要小心、輕巧，以免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。若液氮濺出，可能對(duì)皮膚造成凍傷。操作過(guò)程中最好帶防凍手套、面罩、工作衣或防凍鞋。應(yīng)注意控制凍存細(xì)胞的質(zhì)量。既要在凍存前保障細(xì)胞具有高活力，還要確保無(wú)微生物污染，這樣的細(xì)胞才具有凍存價(jià)值。另夕卜，在每批細(xì)胞凍存一段時(shí)間后，要復(fù)蘇1?2管，以觀察其活力以及是否受到微生物的污染。凍存細(xì)胞的復(fù)蘇?主要材料儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、高速離心機(jī)；培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液。?復(fù)蘇過(guò)程調(diào)配370C?400C的溫水，或?qū)⒑銣厮∠涞臏囟日{(diào)節(jié)至370C?400C;從液氮中取出凍存管，立即投入37°C?400C溫水中迅速晃動(dòng)，直至凍存液完全溶解；將細(xì)胞凍存懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，加入約5ml培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻；將細(xì)胞懸液經(jīng)800?1000r/min離心5min，棄上清夜；(5)向細(xì)胞沉淀內(nèi)加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，補(bǔ)足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。復(fù)蘇第二天上午更換新鮮培養(yǎng)基，以棄去殘余DMSO。?結(jié)果復(fù)蘇后的細(xì)胞應(yīng)該保持其凍存時(shí)的活力，活細(xì)胞數(shù)達(dá)90%以上。?討論細(xì)胞凍存懸液一旦融解后，要盡快