動(dòng)物分子遺傳育種學(xué)第4章課件

概念：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是指通過DNA操作過程將外源基因整合在染色體基因組內(nèi)并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。

第三章轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種（自1982以來）已成功：小鼠、大鼠、兔、豬、綿羊、山羊、牛、雞、魚等多種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。第一節(jié)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的理論基礎(chǔ)染色體交換與基因轉(zhuǎn)移：聯(lián)會(huì)轉(zhuǎn)座子基因組內(nèi)轉(zhuǎn)基因（自然產(chǎn)生）

生物界的這些現(xiàn)象及其發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物得以產(chǎn)生的一個(gè)基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)基因的表達(dá)特征：（1）時(shí)空特異性表達(dá)（2）可控性表達(dá)（3）共抑制性（當(dāng)轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源基因存在同源關(guān)系時(shí)，二者的表達(dá)均受到抑制，其原因極其復(fù)雜，目前尚未完全清楚）（4）沉默現(xiàn)象原因：a.整和在不適當(dāng)?shù)牟课弧.被受體細(xì)胞識(shí)別為異己DNA后將其甲基化而失活。c.轉(zhuǎn)基因本身構(gòu)建不恰當(dāng)，而無法轉(zhuǎn)錄表達(dá)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率受精卵（開始）…轉(zhuǎn)基因動(dòng)物子代（結(jié)束）總成功率：陽性動(dòng)物子代數(shù)待轉(zhuǎn)基因受精卵數(shù)物種受胎率%產(chǎn)仔率%整和率%總成功率%牛20105-100.5羊40155-101豬40510-150.5圖5010101大鼠6010-20152小鼠80-244不同動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因成功率動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的技術(shù)：（1）上游技術(shù)：是指利用分子遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因改造，載體構(gòu)建，最后組裝成轉(zhuǎn)基因單位的一系列方法技術(shù)。（2）中游技術(shù)：

包括外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞、胚胎移植、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的繁育建系等。

（3）下游技術(shù)：

是指轉(zhuǎn)基因的整和表達(dá)情況的檢測。下游技術(shù)的檢測方法：（1）在染色體和DNA水平上：

a.Southern雜交b.PCR擴(kuò)增c.熒光原位雜交（2）在mRNA水平上：a.Nouthernblot雜交b.RT-PCR擴(kuò)增（3）在Pr水平上：Westernblot雜交。（4）表型水平上：檢測轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在生長速度、抗病性、產(chǎn)品質(zhì)量等方面與原來動(dòng)物有無差異。第二節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究方法轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的常用方法：（1）顯微注射法（2）逆轉(zhuǎn)錄病毒法（3）胚胎干細(xì)胞法（4）精子載體法顯微注射法：外源基因構(gòu)建準(zhǔn)備受精卵顯微注射胚胎移植轉(zhuǎn)基因檢測

優(yōu)點(diǎn)：（1）安全（無病毒基因組序列）（2）轉(zhuǎn)移率高（整合率達(dá)30%）（3）相對(duì)較短周期內(nèi)可得到純合體缺點(diǎn)：（1）設(shè)備昂貴，所需技術(shù)性很強(qiáng)。（2）轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)無法控制，通常為多拷貝，最多可達(dá)幾百個(gè)（3）通常在插入點(diǎn)引起突變（重組、缺失）造成動(dòng)物生理缺陷顯微注射法：逆轉(zhuǎn)錄病毒法：逆轉(zhuǎn)錄病毒：

是一種整合性的單鏈RNA病毒。該方法就是將外源基因重新組合在逆轉(zhuǎn)錄病毒載上，然后在去感染著床前或著床后的胚胎，將外源基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞內(nèi)，是目前開展動(dòng)物轉(zhuǎn)基因研究中最有效的方法一。優(yōu)點(diǎn):（1）整合率高。（2）單位點(diǎn)、單拷貝。（3）插入位點(diǎn)的克隆分析較容易。缺點(diǎn):（1）逆轉(zhuǎn)錄病毒容量小，轉(zhuǎn)移片段一般小于10kb，故被轉(zhuǎn)入基因通常無調(diào)空序列。（2）病毒基因組有可能與外源基因一起整合到受體細(xì)胞染色體上，造成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的污染，限制了其在商業(yè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中的應(yīng)用。逆轉(zhuǎn)錄病毒法：胚胎干細(xì)胞法

通過顯微注射法或逆轉(zhuǎn)錄病毒法將外源基因引入到ES細(xì)胞內(nèi)，使外源基因整合到ES基因組內(nèi)某一非必需基因位點(diǎn)上,再對(duì)ES細(xì)胞進(jìn)行篩選鑒定和培養(yǎng)擴(kuò)增,用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物.優(yōu)點(diǎn):(1)外源基因整合與表達(dá)可以在干細(xì)胞中檢測.(2)可以對(duì)外源基因進(jìn)行定點(diǎn)整合.缺點(diǎn):需要經(jīng)過多代的選育,才能得到純合的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物,這對(duì)牛、羊等產(chǎn)仔數(shù)少，世代間隔長的大動(dòng)物來講是很困難的。胚胎干細(xì)胞法精子載體法

利用精子作為轉(zhuǎn)移外源基因的載體，通過受精將外源基因帶入卵細(xì)胞，并整合在染色體上的一種方法。實(shí)際上很早以前，人們就已發(fā)現(xiàn)，通過受精過程，精子可以將外源基因帶入卵細(xì)胞。但到目前為止，人們尚不清楚這種過程的確切機(jī)制。不過這并不影響精子載體法在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中的應(yīng)用。精子與外源基因結(jié)合的部位：（1）精子的整個(gè)頭部區(qū)域。（2）精子的頭前區(qū)域。（3）精子的頭后區(qū)域。該種結(jié)合一般不出現(xiàn)在精子的尾部。影響精子與外源基因結(jié)合的因素：（1）外源基因的大?。ù髢?yōu)于小）。（2）精子頭部的特異性蛋白質(zhì)（有促進(jìn)）（3）清洗精子（有促進(jìn)）外源基因的存在方式：（1）整合到受體細(xì)胞的染色體上。（2）外源基因以附加體的形式存在（易丟失，但通過設(shè)計(jì)增加自主復(fù)制序列可以穩(wěn)定存在，并正確表達(dá)而得到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物）。優(yōu)點(diǎn)：（1）方法簡單實(shí)用，只通過人工受精就可生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。（2）以附加體形式得到的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在理論上可以不受受體基因組的影響，以達(dá)到特異性表達(dá)精子載體法第三節(jié)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種包括兩個(gè)方面：（1）常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種：直接轉(zhuǎn)入高產(chǎn)基因（低產(chǎn)高產(chǎn)）。（2）動(dòng)物生物反應(yīng)器（乳腺、血液等）。常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種：在國內(nèi)外均開展了相關(guān)技術(shù)的研究。例如：轉(zhuǎn)入人GH基因的豬在生長速度、飼料利用率、胴體瘦肉率方面有了明顯的改善。但轉(zhuǎn)基因普遍體質(zhì)下降，表現(xiàn)出病態(tài)現(xiàn)象，特別是胃病、關(guān)節(jié)病明顯增加。因此，如用常規(guī)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物培育新的動(dòng)物品種尚需做很多基礎(chǔ)性研究工作。綿羊和魚:這兩種動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因個(gè)體沒有發(fā)現(xiàn)健康和繁殖性能方面的異常，大有希望培育新品種應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。列外:非常規(guī)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種（動(dòng)物生物反器）：

動(dòng)物生物反應(yīng)器的出現(xiàn)生物技術(shù)領(lǐng)域和畜牧業(yè)的一次革命，具有重要而深遠(yuǎn)的意義。畜產(chǎn)品工業(yè)產(chǎn)品

目前發(fā)展最快的是動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，用來生產(chǎn)藥用蛋白或酶蛋白，是一種全新的生產(chǎn)模式，其優(yōu)越性：（1）動(dòng)物乳腺是一個(gè)封閉系統(tǒng)，可避免外源基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物健康造成的危害。（2）乳腺組織對(duì)外源表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行正確的加工和修飾，使其具有天然產(chǎn)品相似的生物活性。（3）在乳腺中表達(dá)的目的基因可以遺傳（可擴(kuò)繁）利用動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)產(chǎn)品時(shí)，不同動(dòng)物其開發(fā)利用價(jià)值差異極大。故在選擇轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，需考慮如下因素：（1）世代間隔（2）產(chǎn)仔數(shù)（3）抗病力（4）飼養(yǎng)成本（5）目的基因產(chǎn)物的多少不同轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開發(fā)利用價(jià)值比較及評(píng)價(jià)物種優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)評(píng)價(jià)牛產(chǎn)奶量高，易飼養(yǎng)世代間隔長，成本高理想動(dòng)物山羊泌乳性能良好產(chǎn)奶量比牛低理想動(dòng)物豬世代間隔短，產(chǎn)仔數(shù)多轉(zhuǎn)基因豬生活、繁殖力差開發(fā)價(jià)值不大兔乳蛋白含量高，繁殖率高產(chǎn)奶量低有開發(fā)價(jià)值鼠乳腺表達(dá)許多蛋白，可作為生物反應(yīng)器的模型產(chǎn)奶量極低有開發(fā)價(jià)值昆蟲蠶、蠅等昆蟲繁殖率特高，飼養(yǎng)成本低，外源基因易整和，易于大規(guī)模生產(chǎn)。蠅類使人心理不舒服成本低，開發(fā)價(jià)值大。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中存在的主要問題：（1）外源基因的整合率和總成功率低，已經(jīng)整合的外源基因易于丟失，遺傳率也低。（2）外源基因的表達(dá)不理想。（3）外源基因常導(dǎo)致受體動(dòng)物基因突變或功能紊亂。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的育種前景：

目前，人們?cè)谵D(zhuǎn)基因動(dòng)物育種中，已經(jīng)取得了一定的經(jīng)濟(jì)效益。特別是非常規(guī)性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物育種中。動(dòng)物生物反應(yīng)器投資相對(duì)少，效益大，無公害。荷蘭的Genpharm公司（1990）培育的帶有人LF的轉(zhuǎn)基因奶牛，制造嬰兒奶粉的年產(chǎn)值達(dá)50億美元。

英國的PPL公司（1991）培育