-核苷酸代謝(0002)課件

第十三章核酸的酶促降解和核苷酸代謝本章討論核酸酶的類(lèi)別和特點(diǎn)，對(duì)核苷酸的生物合成和分解代謝作一般介紹。第一節(jié)核酸的酶促降解返回第三節(jié)核苷酸的合成代謝第二節(jié)核苷酸的分解代謝第一節(jié)核酸的酶促降解

核苷酸酶核苷磷酸解酶

核酸核苷酸核苷堿基+核糖-1-P磷酸核酸酶核苷水解酶堿基+核糖脫氧核糖核酸酶(DNase)核糖核酸酶(RNase)非特異性核酸酶核酸酶

1、核酸酶的分類(lèi)（1）根據(jù)對(duì)底物的專(zhuān)一性分為（2）根據(jù)切割位點(diǎn)分為核酸內(nèi)切酶核酸外切酶2、核酸酶的特異性3、限制性?xún)?nèi)切酶外切核酸酶對(duì)核酸的水解位點(diǎn)5′

p

p

p

pOHB

p

p

p

p3′BBBBBBB牛脾磷酸二酯酶（5′端外切5得3）蛇毒磷酸二酯酶（3′端外切3得5）內(nèi)切核酸酶對(duì)RNA的水解位點(diǎn)示意圖5′

p

p

p

pOHPyPuPyPy1′

p

p

pGACU

p

p

pGA3′RNAaseIRNAaseIRNAaseT1RNAaseT1Pu：嘌呤Py：嘧啶

限制性?xún)?nèi)切酶

類(lèi)型

命名和意義限制片段的長(zhǎng)度限制圖

原核生物中存在著一類(lèi)能識(shí)別外源DNA雙螺旋中4-8個(gè)堿基對(duì)所組成的特異的具有二重旋轉(zhuǎn)對(duì)稱(chēng)性的回文序列，并在此序列的某位點(diǎn)水解DNA雙螺旋鏈，產(chǎn)生粘性末端或平末端，這類(lèi)酶稱(chēng)為限制性?xún)?nèi)切酶（ristrictionendonuclease）。限制性?xún)?nèi)切酶的命名EcoRI序號(hào)屬名種名株名例：EcoRI，這是從大腸桿菌（Ecoli）R菌珠中分離出的一種限制性?xún)?nèi)切酶Hind例：流感Haemophilusinfluengaed（屬名）（種名）（株系）I—特異性甲基化酶II—GTPyPuACIII—AAGCTT限制性?xún)?nèi)切酶的意義

限制性?xún)?nèi)切酶是分析染色體結(jié)構(gòu)、制作DNA限制圖譜、進(jìn)行DNA序列測(cè)定和基因分離、基因體外重組等研究中不可缺少的工具，是一把天賜的神刀，用來(lái)解剖纖細(xì)的DNA分子。限制片段的長(zhǎng)度

根據(jù)估算，識(shí)別六核苷酸順序的的限制酶大約在4096（46）個(gè)鹼基對(duì)長(zhǎng)的DNA分子中有一個(gè)切點(diǎn)，而通常大多數(shù)肽鏈的不超過(guò)1000氨基酸殘基。因此，由識(shí)別六核苷酸順序的的限制酶產(chǎn)生的DNA片段接近一個(gè)原核生物基因的大小，這個(gè)性質(zhì)使得這些限制酶可以用于建造和克隆有用的重組DNA分子。為了獲取更大的DNA片段，可以采用限制酶部分降解的方法，也可以選用識(shí)別8～10個(gè)核苷酸順序的限制酶。限制圖的定義和構(gòu)建

限制圖（亦稱(chēng)物理圖譜）是DNA的限制性?xún)?nèi)切酶酶解片斷沿DNA分子的物理位置的排列順序以及各片斷的相對(duì)長(zhǎng)度和絕對(duì)長(zhǎng)度。由于限制性?xún)?nèi)切酶能在獨(dú)特順序切割雙鏈DNA產(chǎn)生大的DNA片段，它們提供了一種以堿基對(duì)為單位距離給DNA分子作圖的方法，在確定DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的過(guò)程中，限制圖的構(gòu)建是一項(xiàng)必不可少的工作。

限制圖制作方法示例：末端標(biāo)記單酶切法SV-40基因組限制性酶譜SV-40病毒基因組限制性物理圖譜末端標(biāo)記法繪制物理圖譜

將待測(cè)DNA分子的一端用放射性同位素標(biāo)記，部分酶解；電泳分離，只有帶同位素的片段出現(xiàn)在放射自顯影圖上；.分析：放射自顯影圖上譜線(xiàn)的數(shù)目相當(dāng)于完全酶解片段的數(shù)目；相鄰譜線(xiàn)堿基對(duì)數(shù)目之差就是兩個(gè)相鄰點(diǎn)之間這段DNA片段的大小。

例：某組蛋白基因片段共5900bp，末端標(biāo)記后用HpaII部分酶解得到五個(gè)片段，分子量分別為：5900bp；4210bp；3260bp；2950bp；1020bp。畫(huà)出該DNA分子的物理圖譜。193010201020bp2950bp3260bp5900bp4210bp3101690950

+-

Mark限制性?xún)?nèi)切酶解法

部分酶解法將待測(cè)DNA用限制性?xún)?nèi)切酶完全水解，電泳后得完全酶解圖譜.再將待測(cè)DNA進(jìn)行部分酶解(限制酶量、降低溫度、縮短反應(yīng)時(shí)間),電泳后獲得部分酶解圖譜.對(duì)完全酶解和部分酶解片段長(zhǎng)度進(jìn)行比較分析，根據(jù)片段重疊原理組建物理圖譜.

例：有一174經(jīng)HindII酶解所得片段，分子大小為1030bp，其用AluI完全水解得四個(gè)片段：A750bp，B150bp，C80bp，D50bp；用AluI部分水解得三個(gè)片段：800bp，230bp，130bp。請(qǐng)推斷A、B、C、D的排列順序。CABD1508050750230130800+AluI酶解圖譜BACDMark-完全部分第二節(jié)核苷酸的降解二、嘧啶的降解一、嘌呤的降解

核苷酸酶

核苷磷酸化酶核苷酸核苷堿基+（脫氧）戊糖-1-P磷酸嘌呤的分解及“痛風(fēng)癥”產(chǎn)生和治療尿囊酸尿素CO2+NH3腺嘌呤脫氨酶黃嘌呤氧化酶尿酸氧化酶黃嘌呤氧化酶鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶腺嘌呤次黃嘌呤黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤尿囊素尿酸NCHHHONCH次黃嘌呤類(lèi)似物別嘌呤醇黃嘌呤類(lèi)似物別黃嘌呤嘧啶的分解胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶二氫尿嘧啶二氫胸腺嘧啶-脲基丙酸-脲基異丁酸-氨基異丁酸-丙氨酸第三節(jié)核苷酸的合成代謝一、核糖核苷酸的生物合成二、脫氧核糖核苷酸的生物合成三、各種核苷酸的相互轉(zhuǎn)變核糖核苷酸的生物合成1、嘌呤核苷酸的生物合成(1)從頭合成途徑(2)補(bǔ)救合成途徑(自學(xué))2、嘧啶核苷酸的生物合成(1)從頭合成途徑(2)補(bǔ)救合成途徑(自學(xué))嘌呤環(huán)上各原子的來(lái)源來(lái)自谷氨酰胺的酰胺氮來(lái)自“甲酸鹽”來(lái)自天冬氨酸來(lái)自甘氨酸來(lái)自CO2來(lái)自“甲酸鹽”IMP的生物合成5-磷酸核糖焦磷酸5-磷酸核糖胺甘氨酸甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨酰胺核苷酸甲酰甘氨咪核苷酸5-氨基咪唑核苷酸5-氨基咪唑-4-羧核苷酸5-氨基咪唑-4-琥珀基-甲酰胺核苷酸5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸5-甲酰氨基咪唑-4-氨甲酰核苷酸次黃嘌呤核苷酸（IMP）甲酰THFAIMP轉(zhuǎn)變?yōu)镚MP和AMP嘌呤核苷酸合成補(bǔ)救途徑（自學(xué)）

磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶嘌呤+PRPPA(G)MP+PPi嘌呤+1-P-核糖嘌呤核苷

A(G)MPATP

ADP嘧啶核苷酸從頭合成途徑

c、UMP轉(zhuǎn)變?yōu)镃TPCTPCTP合成酶

ATPGlnH2OUMPUDPUTP

a、嘧啶環(huán)上原子的來(lái)源b、UMP的從頭合成嘧啶環(huán)上各原子的來(lái)源

天冬氨酸CO2NH3NNCCCC654321H2N-CO-P氨甲酰磷酸尿嘧啶核苷酸合成途徑天冬氨酸氨甲酰天冬氨酸二氫乳清酸乳清酸乳清苷酸尿嘧啶核苷酸氨甲酰磷酸嘧啶核苷酸補(bǔ)救合成途徑（自學(xué)）尿嘧啶+PRPP尿嘧啶+1-P-核糖尿嘧啶核苷+ATPUMP+PPi尿嘧啶核苷+PiUMP+ADP脫氧核苷酸的合成

2、脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成1、脫氧核苷酸的合成硫氧還蛋白參與的核糖核苷酸的還原反應(yīng)核糖核苷酸還原酶NADP+NADPH+H+硫氧還蛋白還原酶FADATP、Mg2+硫氧還蛋白（還原型）SHSH硫氧還蛋白（氧化型）SSOP-P-CH2NOHOH核糖核苷二磷酸OP-P-CH2NOHH+H2O脫氧核糖核苷二磷酸核糖核苷酸的還原反應(yīng)FAD核糖核苷酸還原酶ATP、Mg2+硫氧還蛋白SHSH硫氧還蛋白SS硫氧還蛋白還原酶核糖核苷二磷酸+H2O脫氧核糖核苷二磷酸FADH2谷氧還蛋白SS谷氧還蛋白SHSHNADP+NADPH+H+谷氧還蛋白還原酶OP-P-CH2NOHOHOP-P-CH2NOHHGSSG2GSH谷胱甘肽還原酶硫氧還蛋白參與的核糖核苷酸的還原反應(yīng)核糖核苷酸還原酶示意圖底物特異性調(diào)節(jié)位點(diǎn)酶活性調(diào)節(jié)位點(diǎn)催化部位B1亞基B2亞基脫氧胸腺嘧啶核苷酸的合成

胸腺嘧啶核苷酸合成酶NADPH+H++SerNADP++Gly

N5、N10—CH2—FH4

FH2二氫葉酸還原酶Ser羥甲基轉(zhuǎn)移酶ONHNOdR-PCH3ONHNOdR-P核苷酸合成前體類(lèi)似物與抗癌、抗菌藥物

根據(jù)酶的抑制原理，在癌癥的化學(xué)治療或抗菌治療中，往往選用一些底物類(lèi)似物（抗代謝物）抑制胸苷酸合成酶或二氫葉酸合成酶的合成，使胸苷酸不能合成，例如：1、氨基蝶呤、氨甲蝶呤、三甲氧芐氨嘧啶為葉酸類(lèi)似物，是二氫葉酸還原酶抑制劑，可抑制癌細(xì)胞和細(xì)菌生長(zhǎng)；2、5ˊ-氟脲嘧啶、5ˊ

-氟脫氧脲嘧啶在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟脫氧脲嘧啶核苷酸為脫氧胸腺嘧啶核苷酸類(lèi)似物，是脫氧胸腺嘧啶核苷酸合成酶的自殺性抑制劑（suicideinhibitor），可作為抗癌藥物。

5-氟脫氧脲嘧啶核苷酸作為胸苷酸合成酶自殺性底物的機(jī)理FONHNOdR-PS-酶FONHNOdR-PHS-酶F

ONHNOdR-PHCH2-FH4胸苷酸合成酶、5-氟脫氧脲嘧啶核苷酸和亞甲基四氫葉酸三元復(fù)合物的形成葉酸和四氫葉酸（FH4）葉酸四氫葉酸HH105N5，N10-CH2-FH4N5-CHO-FH4CH2CHO一碳基團(tuán)的來(lái)源與轉(zhuǎn)變S-腺苷蛋氨酸N5-CH2-FH4N5N10-

CH2-FH4N5