高中生物選修1生物技術(shù)實(shí)踐 知識(shí)點(diǎn)匯總

本中士物送修一金物我木實(shí)栽和軟魚(yú)總輅

4題一銬餞發(fā)鑄技水的應(yīng)用課題一半港《。果拂的制行

1、發(fā)酵：通過(guò)微生物技術(shù)的培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)大量代謝產(chǎn)物的過(guò)程。

2、有氧發(fā)酵：醋酸發(fā)酵無(wú)氧發(fā)酵：酒精發(fā)酵乳酸發(fā)酵

3、酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌酵母菌的生殖方式：出芽生殖（主要）分裂生殖抱子生殖

酸

4、在有氧條件下，酵母菌進(jìn)行有氧呼吸,大量繁殖。C6Hl2O6+6O2-6CO2+6H2O

酶

5、在無(wú)氧條件下，酵母菌能進(jìn)行酒精發(fā)酵。C6H1206-2C2HS0H+2C02

6、20℃左右展適宜酵母菌繁殖酒精發(fā)酵時(shí)一般將溫度控制在18C-25c

7、在葡萄酒自然發(fā)酵的過(guò)程中，起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型典菌。在發(fā)酵過(guò)程中，

隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進(jìn)入發(fā)酵液，使葡萄酒呈現(xiàn)深紅色。在缺氧呈酸性的發(fā)酵

液中，酵母菌可以生長(zhǎng)繁殖，而絕大多數(shù)其他微生物都因無(wú)法適應(yīng)這一環(huán)境而受到制約。

8、醋酸菌是單細(xì)胞細(xì)菌（原核生物），代謝類(lèi)型是異養(yǎng)需氧型,生殖方式為二分裂

9、當(dāng)氧氣、糖源都充足時(shí)，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸;當(dāng)缺少糖源時(shí)，醋酸菌將乙醇變?yōu)?/p>

乙醛，再將乙醛變?yōu)榇姿?。C2H50H+O2^CH3C0OH+6H20

10、控制發(fā)酵條件的作用①醋酸菌對(duì)氧氣的含量特別敏感，當(dāng)進(jìn)行深層發(fā)酵時(shí)，即使只是短時(shí)間中

斷通入氧氣，也會(huì)引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最適生長(zhǎng)溫度為30?35C,控制好發(fā)酵溫度，使

發(fā)酵時(shí)間縮短，乂減少雜菌污染的機(jī)會(huì)。③有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧

化。

11、實(shí)驗(yàn)流程：挑選葡萄f沖洗f榨汁f酒精發(fā)酵f果酒（一醋酸發(fā)酵f果醋）

12、酒精檢驗(yàn)：果汁發(fā)酵后是否有酒精產(chǎn)生，可以用重格酸鉀來(lái)檢驗(yàn)。在酸性條件下,重銘酸鉀與

酒精反應(yīng)呈現(xiàn)灰綠色。先在試管中加入發(fā)酵液2mL,再滴入物質(zhì)的量濃度為3mol/L的H2S0,3滴,

振蕩混勻，最后滴加常溫下飽和的重鋁酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顏色

13、充氣口是在醋酸發(fā)酵時(shí)連接充氣泵進(jìn)行充氣用的；排氣口是在酒精發(fā)酵時(shí)用

來(lái)排出二氧化碳的；出料口是用來(lái)取樣的。排氣口要通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)而彎曲的膠管與

瓶身相連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。開(kāi)口向下的目的是有利于二氧

化碳的排出。使用該裝置制酒時(shí)，應(yīng)該關(guān)閉充氣口；制醋時(shí)，應(yīng)該充氣口連接氣

泵，輸入氧氣。

嶷難解率

(1)你認(rèn)為應(yīng)該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？

應(yīng)該先沖洗，然后再除去枝梗,以避免除去枝梗時(shí)引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機(jī)會(huì)。

(2)你認(rèn)為應(yīng)該從哪些方面防止發(fā)酵液被污染？

如：要先沖洗葡萄，再除去枝梗；榨汁機(jī)、發(fā)酵裝置要清洗干凈，并進(jìn)行酒精消毒；每次排氣

時(shí)只需擰松瓶蓋，不要完全揭開(kāi)瓶蓋等。

(3)制葡萄酒時(shí)，為什么要將溫度控制在18?25℃?制葡萄醋時(shí)，為什么要將溫度控制在

30?35℃?

溫度是酵母菌生長(zhǎng)和發(fā)酵的重要條件。20C左右最適合酵母菌的繁殖。因此需要將溫度控制在其最

適溫度范圍內(nèi)。而醋酸菌是適溫菌，最適生長(zhǎng)溫度為30?35℃,因此要將溫度控制在30?35℃。

(4)果酒發(fā)酵變?yōu)楣装l(fā)酵需要改變的條件有哪些？

通入氧氣、提高溫度。

總給累涌制作多累錯(cuò)制作的對(duì)比「

果酒制作果醋制作

酵母菌醋酸菌

菌種

附著在葡萄皮上野生酵母購(gòu)買(mǎi)，食醋中分離

發(fā)來(lái)源

菌，或者分離獲得純凈酵母

酵曲AT電奔

單細(xì)胞，真核生物，單細(xì)胞，原核生物

分類(lèi)地位

出芽生殖、抱子生殖二分裂生殖

菌繁殖方式

30?35℃

發(fā)溫度18C-25C

10-12天7-8天

時(shí)間

酵

前期有氧，后期無(wú)氧有氧

氧氣

條發(fā)酵液的酸性條件發(fā)酵液的酸性條件

pH

有氧條件下，大量繁殖：糖源充足：

醐

醐

C6Hl2。6+202f2c。2+2CBC00H

C6Hl2。6+602+6H2。f6C02+

+2H0

反12H2O2

缺少糖源：

應(yīng)無(wú)氧條件下，酒精發(fā)酵：酶

嗅味、幅嘗、鏡檢酵母菌、嗅味、品嘗、鏡檢醋酸菌、觀

結(jié)果檢測(cè)

重鋁酸鉀檢測(cè)酒精察菌膜、檢測(cè)前后pH變化

聯(lián)系醋酸發(fā)酵可以在酒精發(fā)酵的基礎(chǔ)上進(jìn)行

鐳鹿二腐丸的制6

1、多種微生物參與了豆腐的發(fā)酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉

是一種絲狀真菌。代謝類(lèi)型是異養(yǎng)需氧型。生殖方式是苑子生殖。營(yíng)腐生生活。

2、原理：毛霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質(zhì)分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將

脂肪水解為甘油和脂肪酸。

3、實(shí)驗(yàn)流程：讓豆腐上長(zhǎng)出毛霉一加鹽腌制一加鹵湯裝瓶一密封腌制

4、釀造腐乳的主要生產(chǎn)工序是將豆腐進(jìn)行前期發(fā)酵和后期發(fā)酵。

前期發(fā)酵的主要作用：1.創(chuàng)造條件讓毛霉生長(zhǎng)。2.使毛霉形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期發(fā)酵主要是酶與微生物協(xié)同參與生化反應(yīng)的過(guò)程。通過(guò)各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳

的香氣。（后期發(fā)酵，毛霉被殺死不等于所有微生物被殺死）

5、將豆腐切成3cmX3cmXlcm的若干塊。所用豆腐的含水量為70%左右，水分過(guò)多則腐乳不易成

形。

?毛霉的生長(zhǎng)：條件：將豆腐塊平放在籠屜內(nèi)，將籠屜中的控制在15?18C,并保持一定的溫度。

來(lái)源：1.來(lái)自空氣中的毛霉抱子2.直接接種優(yōu)良毛霉菌種時(shí)間：5天

?加鹽腌制：將長(zhǎng)滿(mǎn)毛霉的豆腐塊分層整齊地?cái)[放在瓶中，同時(shí)逐層加鹽，隨著層數(shù)的加高而增加

鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時(shí)間約為8天左右。

.用鹽腌制時(shí)，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過(guò)低，不足以抑制微生物的生長(zhǎng)，可能導(dǎo)致豆腐腐敗

變質(zhì)；鹽的濃度過(guò)高會(huì)影響腐乳的口味

?食鹽的作用：1.抑制微生物的生長(zhǎng)，避免腐敗變質(zhì)2.析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過(guò)程中

不易酥爛3.調(diào)味作用，給腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。

?配制鹵湯：鹵湯直接關(guān)系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒

的含量一般控制在12%左右。

?酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐2.與有機(jī)酸結(jié)合形成酯，賦予腐乳風(fēng)味3.酒精含量的高低與腐

乳后期發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短有很大關(guān)系，酒精含量越高，對(duì)蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延

長(zhǎng)；酒精含量過(guò)低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。

?香辛料的作用：L調(diào)味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進(jìn)發(fā)酵過(guò)程

?防止雜菌污染：①用來(lái)腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時(shí)，操作要迅速小

心。整齊地?cái)[放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時(shí)，最好將瓶口通過(guò)酒精燈的火

焰，防止瓶口被污染。

疑睢解答

（1）利用所學(xué)的生物學(xué)知識(shí)，解釋豆腐長(zhǎng)白毛是怎么一回事？

豆腐生長(zhǎng)的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴(yán)格地說(shuō)是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。

（2）我們平常吃的豆腐，哪種適合用來(lái)做腐乳？

含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

（3）吃腐乳時(shí)，你會(huì)發(fā)現(xiàn)腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它

對(duì)人體有害嗎？它的作用是什么？

“皮”是前期發(fā)酵時(shí)在豆腐表面上生長(zhǎng)的菌絲（匍匐菌絲），對(duì)人體無(wú)害。它能形成腐乳的“體”，

使腐乳成形。

鐳題三和。泡菜

?制作泡菜所用微生物是乳酸菌,其代謝類(lèi)型是異養(yǎng)厭氧型。在無(wú)氧條件下，降糖分解為乳酸。分

酶、

裂方式是二分裂。反應(yīng)式為：C6H12062c3H6。3+能量

常見(jiàn)的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產(chǎn)酸奶。

?亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產(chǎn)中用作食品添加劑。

?膳食中的亞硝酸鹽一般不會(huì)危害人體健康,國(guó)家規(guī)定肉制品中不超過(guò)30mg/kg,醬腌菜中不超過(guò)

20mg/kg,嬰兒奶粉中不超過(guò)2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外，但在適宜pH、溫度和一

定微生物作用下形成致癌物質(zhì)亞硝胺。

?一般在腌制10天后亞硝酸鹽含量開(kāi)始降低，故在10天之后食用最好

專(zhuān)題二能住物的傅春⑨應(yīng)用

礴趣一微住物的安老金脩?zhàn)B

一、修舞壅

?培養(yǎng)基按照物理性質(zhì)可分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。在液體培養(yǎng)基中加入凝固

劑瓊脂（是從紅藻中提取的一種多糖，在配制培養(yǎng)基中用作凝固劑）后，制成瓊脂固體培養(yǎng)基。微

生物在固體培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)，可以形成肉眼可見(jiàn)的菌落。根據(jù)菌落的特征可以判斷是哪一種菌。液

體培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)或生活生產(chǎn)，主要用于大規(guī)模培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基應(yīng)用于微生物的分離和鑒定，

半固體培養(yǎng)基則常用于觀察微生物的運(yùn)動(dòng)及菌種保藏等。

?按照成分培養(yǎng)基可分為人工合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基是用成分已知的化學(xué)物質(zhì)配制

而成，其中成分的種類(lèi)比例明確，常用于微生物的分離鑒定。天然培養(yǎng)基是用化學(xué)成分不明的天然

物質(zhì)配制而成，常用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。

?按照培養(yǎng)基的用途，可將培養(yǎng)基分為選擇培養(yǎng)基和鑒定培養(yǎng)基。選擇培養(yǎng)基是指在培養(yǎng)基中加入

某種化學(xué)物質(zhì)，以抑制不需要的微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)所需要的微生物的生長(zhǎng)。鑒別培養(yǎng)基是根據(jù)微生

物的特點(diǎn)，在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品配制而成的，用以鑒別不同類(lèi)別的微生物。

?培養(yǎng)基的化學(xué)成分包括水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源、生長(zhǎng)因子等。

.碳源：能為微生物的代謝提供碳元素的物質(zhì)。如CO”NaHCOs等無(wú)機(jī)碳源；糖類(lèi)、石油、花生粉餅

等有機(jī)碳源。異養(yǎng)微生物只能利用有機(jī)碳源。單質(zhì)碳不能作為碳源。

.氮源：能為微生物的代謝提供氮元素的物質(zhì)。如此、N【h、N0:、NII；（無(wú)機(jī)氮源）蛋白質(zhì)、氨基酸、

尿素、牛肉膏、蛋白陳（有機(jī)氮源）等。只有固氮微生物才能利用用。

?培養(yǎng)基還要滿(mǎn)足微生物生長(zhǎng)對(duì)pH、特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。例如，培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要在

培養(yǎng)基中添加維生素，培養(yǎng)霉菌時(shí)須將培養(yǎng)基的pH調(diào)至酸性，培養(yǎng)細(xì)菌是需要將pH調(diào)至中性或微

堿性，培養(yǎng)厭氧型微生物是則需要提供無(wú)氧的條件。注意：牛肉膏蛋白陳既是氮源又是碳源。

二、無(wú)菌技術(shù)

1、獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵，要注意以下幾個(gè)方面：

①對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手，進(jìn)行清潔和消毒。

②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌。

③為避免周?chē)h(huán)境中微生物的污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰附近進(jìn)行。

④實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)避免己經(jīng)滅菌處理的材料用具與周?chē)奈锲废嘟佑|。

?無(wú)菌技術(shù)除了用來(lái)防止實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)物被其他外來(lái)微生物污染外，還有什么目的？

答：無(wú)菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。

2、消毒與滅菌的區(qū)別

消毒指使用較為溫和的物理或化學(xué)方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分對(duì)人體有害的微生物（不

包括芽抱和抱子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（對(duì)于一些不耐高溫的液體）還有化學(xué)

藥劑（如酒精、氯氣、石炭酸等）消毒、紫外線消毒。

滅菌則是指使用強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外所有的微生物，包括芽抱和抱子。滅菌方法有灼

燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。

?滅菌方法：

①接種環(huán)、接種針、試管門(mén)等使用灼燒滅菌法；

②玻璃器皿、金屬用具等使用干熱滅菌法，所用器械是干熱滅菌箱；

③培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋。

④表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。

注意：一般培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌，培養(yǎng)皿是干熱滅菌。

三、制作牛肉膏蛋白陳固體培養(yǎng)基

1、方法步驟：計(jì)算、稱(chēng)量、溶化、滅菌、倒平板。（如果調(diào)pH,在滅菌之前）

2、倒平板操作的步驟：

①將滅過(guò)菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁的桌面上，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿錐形瓶，將瓶口迅速通過(guò)火焰。

③用左手的拇指和食指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于瓶口的縫隙，右手將錐形瓶中的培養(yǎng)基（約10?

20mL）倒入培養(yǎng)皿，左手立即蓋上培養(yǎng)皿的皿蓋。

④等待平板冷卻凝固，大約需5?lOmin。然后，將平板倒過(guò)來(lái)放置，使培養(yǎng)皿蓋在下、皿底在

上。

3、?倒平板操作的討論

(1)培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時(shí)，才能用來(lái)倒平板。你用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基

的溫度？

提示：可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶,感覺(jué)錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時(shí)，就可以進(jìn)

行倒平板了。

(2)為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

答：通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

(3)平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

答：平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既

可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

(4)在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)

培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微

生物。

四、純化大腸桿菌

1、微生物接種的方法最常用的是平板劃線法和稀釋涂布平板法。

2、平板劃線法是通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作。將聚集的菌種逐步稀釋分散到

培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體，這

就是菌落。

稀釋涂布平板法是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀建，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培

養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。分為系列稀釋操作和涂布平板操作兩步。

3、用平板劃線法和稀釋涂布平板法接種的目的是：使聚集在一起的微生物分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能

在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落，以便于純化菌種。

4、平板劃線法操作步驟：注意：只需蘸取一次菌液。

①將接種環(huán)放在火焰上灼燒,直到接種環(huán)燒紅。②在火焰旁冷卻接種環(huán),并打開(kāi)棉塞。

③將試管口通過(guò)火焰。④將已冷卻的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液。

⑤將試管通過(guò)火焰，并塞上棉塞。⑥左手將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速

伸入平板內(nèi)，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)皿。⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，

從第一區(qū)域劃線的末端開(kāi)始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不

要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)相連。⑧將平板倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

?平板劃線操作的討論

(1).為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍

然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前

灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種

直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便

得到菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操

作者。

(2)在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

答：以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

(3).在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？

答：劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)

菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。

5、涂布平板操作的步驟：

①將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。②取少量菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。

③將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻8?10s。④用涂布器將菌液均勻地

涂布在培養(yǎng)基表面。

?涂布平板操作的討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，

第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？

提示：應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要

接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周?chē)?；等等?/p>

6、菌種的保存

(1)對(duì)于頻繁使用的菌種，可以采用臨時(shí)保藏的方法。

①臨時(shí)保藏方法

將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后，將試管放入￡￡

的冰箱中保藏。以后每3?6個(gè)月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。

②缺點(diǎn)：這種方法保存的時(shí)間不長(zhǎng)，菌種容易被污染或產(chǎn)生變異。

(2)對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，裝入1mL甘油后滅菌。將1mL培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移到甘油瓶中，與甘油充分混

勻后，放在一20C的冷凍箱中保存。

疑睢翩答

(1)生物的營(yíng)養(yǎng)

人及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類(lèi)。

植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類(lèi)。

微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)五類(lèi)。

(2)確定培養(yǎng)基制作是否合格的方法

將未接種的相同培養(yǎng)基在相同環(huán)境中培養(yǎng)1?2天，無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，

否則需要重新制備。

課題二土壤中分解屎素的偈筠的分離與針政

尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，尿素并不能直接被農(nóng)作物吸收。只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解

成氨之后，才能被植物利用。土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)樗麄兡芎铣煞?/p>

尿素最初是從人的尿液中發(fā)現(xiàn)的

1.篩選菌株

(1)實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選應(yīng)用的原理

人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物

生長(zhǎng).

(2)選擇性培養(yǎng)基

在微生物學(xué)中，將允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基,

稱(chēng)作選擇培養(yǎng)基。

(3)配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù)

根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入

有機(jī)物可以選擇培養(yǎng)自養(yǎng)微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素，可以選擇培養(yǎng)能固氮的微生物；加入高

濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃色葡萄球菌等。

2.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

(1)測(cè)定微生物數(shù)量的常用方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)(血球計(jì)數(shù)板)：

(2)稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目的原理

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通

過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活細(xì)菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，每一個(gè)稀釋

度下一般設(shè)置3?5個(gè)平板,選擇菌落數(shù)在30?300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),并取平均值。統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往

往比活菌的實(shí)際數(shù)目低,因此，統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是活菌數(shù)來(lái)表示。

采用此方法的注意事項(xiàng)：1.一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)2.統(tǒng)計(jì)的是活菌數(shù)量3.

統(tǒng)計(jì)數(shù)量比實(shí)際數(shù)量可能偏小。(考慮到菌落混雜的情況)

3.實(shí)驗(yàn)操作

(1)土壤取樣：同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物，數(shù)量最大，種類(lèi)最多。在富含有機(jī)質(zhì)的土

壤表層，有更多的微生物生長(zhǎng)。從富含有機(jī)物、潮濕、pH七7的土壤中取樣。鏟去表層土，在距地

表約3?8cm的土壤層取樣。

(2)樣品的稀釋?zhuān)簶悠返南♂尦潭葘⒅苯佑绊懫桨迳仙L(zhǎng)的菌落數(shù)目。在實(shí)際操作中，通常選用一

定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30~300之間，適于計(jì)數(shù)的平板。

測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用IO"IO，1()6

測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用10310，1()5

測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用IO?1(/1。

(3)微生物的培養(yǎng)與觀察

不同種類(lèi)的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌30~37℃:T2天

放線菌25~28℃5~7天霉菌25~28℃3~4天

(5)菌落計(jì)數(shù)

每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目,選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)

間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。一般來(lái)說(shuō)，在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、唯獨(dú)及培養(yǎng)時(shí)間)，

同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征(形狀、大小、隆起程度、顏色)

（6）分解尿素的細(xì)菌鑒定

細(xì)菌合成的胭酶將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中添加

酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果指示劑變紅，初步鑒定該細(xì)菌能夠分解尿素。

4.疑難解答

（1）如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？

統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)3個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值

每克樣品中的菌落數(shù)=（C/V）*M其中，C代。某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代衣

涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積（ml）,M代表稀釋倍數(shù)

例題：分離土壤中分解尿素的細(xì)菌，對(duì)培養(yǎng)基的要求是（①③⑤⑧）

①加尿素②不加尿素③加瓊脂④不加瓊脂⑤加葡萄糖⑥不加葡萄糖⑦加硝酸鹽⑧不加硝酸鹽

諉麴三分解纖攤素的微生物的分離

1.纖維素，一種由葡萄糖首尾相連而成的大分子化合物，是地球上含量最豐富的多糖類(lèi)物質(zhì)。

2.纖維素與纖維素酶

（1）棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物，木材.、作物秸稈等也富含纖維素。

（2）纖維素醒是一種復(fù)合酶,-一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即3酶、Cx酶和葡萄糖昔酶，前兩種

酶使纖維素分解成纖維：糖，葡萄糖昔酶將纖維：糖分解成葡萄糖。纖維素最終被水解成葡萄糖，

為微生物的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。

3.纖維素分解菌的篩選

（1）篩選方法：剛果紅染色法。能夠通過(guò)顏色反應(yīng)直接對(duì)微生物進(jìn)行篩選。

（2）剛果紅染色法篩選纖維素分解菌的原理

剛果紅是一種染料，它可以與像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物,但并不和水解后的纖

維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當(dāng)我們?cè)诤欣w維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基

中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅一纖維素的復(fù)合物就無(wú)法形成，

培養(yǎng)基中會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。這樣，我們就可以通過(guò)是否產(chǎn)生透明圈來(lái)篩選纖

維素分解菌。注意：能產(chǎn)生透明圈不一定就是纖維素分解菌，需要進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。

4.分離分解纖維素的微生物的實(shí)驗(yàn)流程

土壤取樣f選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來(lái)確定)一梯度稀釋一將

樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上一挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

(1)土壤采集選擇富含纖維素的環(huán)境。

(2)選擇培養(yǎng)(此步是否需要，應(yīng)根據(jù)樣品中目的菌株數(shù)量的多少來(lái)確定)：

①目的：增加纖維素分解菌的濃度，確保能夠從樣品中分離所需的微生物

②方法：利用富含纖維素的選擇培養(yǎng)基。將土樣加入到含有選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定

在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)l-2d,直到培養(yǎng)液變渾濁?？芍貜?fù)選擇培養(yǎng)。擴(kuò)大培養(yǎng)用液體培

養(yǎng)基。(液體培養(yǎng)基)

(3)稀釋涂布：吸取適量的培養(yǎng)液，稀釋涂布到鑒別培養(yǎng)基上(纖維素作為唯一碳源，剛果紅加入

方法有兩種)，倒置培養(yǎng)。

(4)挑選菌落：挑選產(chǎn)生透明圈的菌落。

(5)剛果紅染色的兩種方法

一種是先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)，另一種是在倒平板時(shí)就加入剛果紅。

5.課題延伸

能產(chǎn)生透明圈不一定就是纖維素分解菌。對(duì)分解纖維素的微生物進(jìn)行了初步的篩選后，只是分

離純化的第一步，為確定得到的是纖維素分解菌，還需要進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的實(shí)驗(yàn)，纖維素酶的

發(fā)酵方法有液體發(fā)酵和固體發(fā)酵兩種。纖維素酶的測(cè)定方法，一般是對(duì)纖維素酶分解濾紙等纖維素

后所產(chǎn)生的葡萄糖進(jìn)行定量的測(cè)定。

疑難解答

(1)為什么要在富含纖維素的環(huán)境中尋找纖維素分解菌？

由于生物與環(huán)境的相互依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中，纖維素分解菌的含量相對(duì)提高，因

此從這種土樣中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。

(2)將濾紙埋在土壤中有什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋進(jìn)土壤多深？

將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對(duì)聚集，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)

境。一般應(yīng)將紙埋于深約10cm左右腐殖土壤中。

(3)兩種剛果紅染色法的比較

先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng),缺點(diǎn)是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會(huì)使菌落之間

發(fā)生混雜;其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的透明圈基本上是纖維素分解菌的作用。

在倒平板時(shí)就加入剛果紅；優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便,不存在菌落混雜問(wèn)題，缺點(diǎn)是由于纖維素和瓊脂、

土豆汁中都含有淀粉類(lèi)物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。但這種只產(chǎn)生淀粉

酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的

透明圈相區(qū)分。另一缺點(diǎn)是：有些微生物具有降解色素的能力，它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)降解剛

果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區(qū)分。

（4）為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？

在選擇培養(yǎng)的條件下，可以使那些能夠適應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適

應(yīng)這種營(yíng)養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。

補(bǔ)充：如何根據(jù)需要設(shè)置對(duì)照？

（1）判斷培養(yǎng)基是夠有雜菌污染：需要將未接種的相同培養(yǎng)基在相同條件下同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）判斷培養(yǎng)基是夠起到了篩選作用：需要同時(shí)設(shè)立牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基（全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基、LB培

養(yǎng)基）進(jìn)行同樣接種后培養(yǎng)，觀察兩種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目是否有顯著差異。

專(zhuān)題三錯(cuò)揚(yáng)的國(guó)①.修森技術(shù)

誣胭一茹花的￡￡卬修森

一、植物組織培養(yǎng)的基本過(guò)程

細(xì)胞分化：在生物個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生理功能上出現(xiàn)穩(wěn)定性差異的過(guò)程。

離體的植物組織或細(xì)胞，在培養(yǎng)了一段時(shí)間以后，會(huì)通過(guò)細(xì)胞分裂，形成愈傷組織，愈傷組織的細(xì)

胞排列疏松而無(wú)規(guī)則，是一種高度液泡化的呈無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞。由高度分化的植物組織或細(xì)

胞產(chǎn)生愈傷組織的過(guò)程，稱(chēng)為植物細(xì)胞的脫分化，或者叫做去分化。脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進(jìn)

行培養(yǎng)，又可以重新分化成根或芽等器官，這個(gè)過(guò)程叫做再分化。再分化形成的試管苗，移栽到地

里，可以發(fā)育成完整的植物體。

二、植物細(xì)胞工程

1.

無(wú)菌、適宜溫度

細(xì)胞分裂素〉

離

體生長(zhǎng)素

意-

植

移

組

脫分化傷

再分化

物

栽

紈

組

體

織

或細(xì)胞分裂素

細(xì)

以生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素

胞

V生長(zhǎng)素

一__________)-------------------------->

-----YX

不需要光需要光

2.具有某種生物全套遺傳信息的任何一個(gè)活細(xì)胞,都具有發(fā)育成完整個(gè)體的能力,即每個(gè)生物細(xì)胞

都具有全能性。但在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中并不表現(xiàn)出來(lái)，這是因?yàn)樵谔囟ǖ臅r(shí)間和空間條件下,

通過(guò)基因的選擇性表達(dá),構(gòu)成不同組織和器官。

3.植物組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用有：實(shí)現(xiàn)優(yōu)良品種的快速繁殖;培育脫毒作物;制作人工種子;培育作

物新品種以及細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)等。

4.細(xì)胞分化是一種持久性的變化，它有什么生理意義？

使多細(xì)胞生物體中細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能趨向?qū)ｉT(mén)化，有利于提高各種生理功能的效率。

5.比較根尖分生組織和愈傷組織的異同

組織類(lèi)型細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞形態(tài)細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞排列細(xì)胞去向

根尖分化成多種

受精卵正方形無(wú)液泡緊密

分生組織細(xì)胞組織

愈傷組織高度分化細(xì)胞無(wú)定形高度液泡化疏松再分化成新個(gè)體

哪電啪身地枷臚如

得鬣a-分裂進(jìn)行細(xì)胞增殖

也河科：小1可附稹物組織，堵喬的雄劾程度表利儂天。但物付科的儂拌且段天祭到試驗(yàn)的成敗。植

物的種類(lèi)、材料的年齡和保存時(shí)間的長(zhǎng)短等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。菊花組織培養(yǎng)一般選擇未開(kāi)花植物

的莖上部新萌生的側(cè)枝作材料。-一般來(lái)說(shuō)，容易進(jìn)行無(wú)性繁殖的植物容易進(jìn)行組織培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)

旺盛嫩枝進(jìn)行組培的是嫩枝生理狀態(tài)好，容易誘導(dǎo)脫分化和再分化。

7.營(yíng)養(yǎng)：離體的植物組織和細(xì)胞，對(duì)營(yíng)養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對(duì)特殊，需要配制適宜的培養(yǎng)基。

常用的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，其中含有的大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg,微量元素是Fe、Mn、B、

Zn、Cu、Mo、I、Co,有機(jī)物有甘氨酸、煙酸、肌醇、維生素、蔗糖等。

激素：植物激素中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是啟動(dòng)細(xì)胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長(zhǎng)素

存在的情況下，細(xì)胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強(qiáng)趨勢(shì)。在培養(yǎng)基中需要添加生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素等植物

激素，其濃度、使用的先后順序、用量的比例等都影響結(jié)果。

生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素比值與結(jié)果

使用順序?qū)嶒?yàn)結(jié)果

比值高時(shí)促根分化，抑芽形成

先生長(zhǎng)素，后細(xì)胞分裂素有利于分裂但不分化

比值低時(shí)促芽分化，抑根形成

先細(xì)胞分裂素，后生長(zhǎng)素細(xì)胞既分裂也分化

比值適中促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)

同時(shí)使用分化頻率提高

環(huán)境條件：PIk溫度、光等環(huán)境條件。

不同的植物對(duì)各種條件的要求往往不同。進(jìn)行菊花的組織培養(yǎng)，一般將pH控制在5.8左右,溫度控

制在18~22℃,并且每日用日光燈照射12h.

8.操作流程

配制MS固體培養(yǎng)基：配制各種母液：將各種成分按配方比例配制成的退縮液（培養(yǎng)基母液）。

?使用時(shí)根據(jù)母液的濃縮倍數(shù)，計(jì)算用量，并加蒸儲(chǔ)水稀釋。

.配制培養(yǎng)基：應(yīng)加入的物質(zhì)有瓊脂、蔗糖、大量元素、微量元素、有機(jī)物和植物激素的母液,并

用蒸儲(chǔ)水定容到1000毫升。

.在菊花組織培養(yǎng)中，可以不添加植物激素原因是菊花莖段組織培養(yǎng)比較容易。

?滅菌：采取的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌。

?MS培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的作用是什么？與肉湯培養(yǎng)基相比，MS培養(yǎng)基有哪些特點(diǎn)？

大量元素和微量元素提供植物細(xì)胞所必需的無(wú)機(jī)鹽；蔗糖提供碳源，維持細(xì)胞滲透壓；甘氨酸、維

生素等物質(zhì)主要是為了滿(mǎn)足離體植物細(xì)胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營(yíng)養(yǎng)需求。

微生物培養(yǎng)基以有機(jī)營(yíng)養(yǎng)為主,MS培養(yǎng)基則需提供大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)。

外植體的消毒外植體：用于離體培養(yǎng)的植物器官或組織片段。選取菊花莖段時(shí)，要取生長(zhǎng)旺盛的嫩

枝。菊花莖段用流水沖洗后可加少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右。

用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中搖動(dòng)2~3次，持續(xù)6~7s,立即

將外植體取出，在無(wú)菌水中清洗。取出后仍用無(wú)菌吸水紙吸干外植體表面水分，放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%

的氯化汞溶液中r2min。取出后，在無(wú)菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

注意：對(duì)外植體進(jìn)行表面消毒時(shí);就要考慮藥劑的消毒效果，又要考慮植物的耐受能力。

接種：接種過(guò)程中插入外植體時(shí)形態(tài)學(xué)上端朝上，每個(gè)錐形瓶接種7?8個(gè)外植體。外植體接種與細(xì)

菌接種相似，操作步驟相同，而且都要求無(wú)菌操作。

培養(yǎng)：應(yīng)該放在無(wú)菌箱中進(jìn)行，并定期進(jìn)行消毒，保持適宜的溫度（18~22℃）和光照（12h）

移栽：栽前應(yīng)先打開(kāi)培養(yǎng)瓶的封口膜，讓其在培養(yǎng)間生長(zhǎng)幾日，然后用流水清洗根部培養(yǎng)基。然后

將幼苗移植到消過(guò)毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中生活一段時(shí)間，進(jìn)行壯苗。最后進(jìn)行露天栽培。

栽培

外植體在培養(yǎng)過(guò)程中可能會(huì)被污染，原因有外植體消毒不徹底；培養(yǎng)基滅菌不徹底；接種中被雜菌

污染；錐形瓶密封性差等。

專(zhuān)胭/DNA彳。曙面底技木

諜胭一DNA的相提敘與鑒定

一、原理

1.提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？

DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。

2.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點(diǎn)？要使DNA溶解,需要使用什么濃度？要使DNA析出,

又需要使用什么濃度？、

在0.14mol/L時(shí)溶解度最小;較高濃度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。I--------

3.在溶解細(xì)胞中的DNA時(shí)，人們通常選用2moi/LNaCl溶液：將DNA分子析出的方-----------

法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸儲(chǔ)水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機(jī)溶劑，但

DNA卻不能溶于酒精（特別是95%冷卻酒精），但細(xì)胞中蛋白質(zhì)可溶于酒精。

從理論上分析，預(yù)冷的乙醇溶液具有以下優(yōu)點(diǎn)。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降

低分子運(yùn)動(dòng)，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。

4.采用DNA不溶于酒精的原理，可以達(dá)到什么目的？

將DNA和蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。

5.提取DNA還可以利用DNA對(duì)蛋白酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時(shí)，應(yīng)選用怎樣的

酶和怎樣的溫度值？

蛋白酶，因?yàn)槊妇哂袑?zhuān)一性，蛋白酶只水解蛋白質(zhì)而不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生影響。溫度值為60?80℃,

因?yàn)樵摐囟戎档鞍踪|(zhì)變性沉淀，而DNA不會(huì)變性。

補(bǔ)充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術(shù)中DNA變

性溫度在95℃。

6.洗滌劑在提取DNA中有何作用？

洗滌劑將細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，從而瓦解細(xì)胞膜。

7.當(dāng)鑒定提取出的物質(zhì)是否是DNA時(shí)，需要使用什么指示劑進(jìn)行鑒定？

在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現(xiàn)藍(lán)色。二苯胺現(xiàn)配現(xiàn)用。

8.原理總結(jié)：通過(guò)利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA,可以從細(xì)胞中提取和提純DNA：再利用

酒精進(jìn)一步將DNA與蛋白質(zhì)分離開(kāi)來(lái)，達(dá)到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質(zhì)是否

是DNA。

二、實(shí)驗(yàn)材料的選取

不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時(shí)，應(yīng)本著DNA含量高、材料易得、便于提取的

原則。

木實(shí)膾用雞血細(xì)胞做實(shí)找材料仃兩個(gè)原因。?是因?yàn)殡u則織［虺核的］）\\含豆卜:宦，材料場(chǎng)得：

二是雞血細(xì)胞極易吸水脹破，而用動(dòng)物肝臟細(xì)胞作實(shí)驗(yàn)材料常常需要?jiǎng)驖{和離心，對(duì)設(shè)備要求較高,

操作繁瑣，歷時(shí)較長(zhǎng)。

雞血細(xì)胞破碎以后釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附，所以在提取過(guò)程中為了減少DNA的損失，

最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細(xì)胞液。

三、破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液

?若選用雞血和洋蔥作實(shí)驗(yàn)材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？

在雞血細(xì)胞液中加入一定量蒸鐲水并用玻棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗

滌劑和食鹽，攪拌研磨，過(guò)濾后收集濾液。

?為什么加入蒸播水能使雞血細(xì)胞破裂？

答：蒸儲(chǔ)水對(duì)于雞血細(xì)胞來(lái)說(shuō)是一種低滲液體，水分可以大量進(jìn)入血細(xì)胞內(nèi)，使血細(xì)胞脹裂，再加

上攪拌的機(jī)械作用，就加速了雞血細(xì)胞的破裂（細(xì)胞膜和核膜的破裂），從而釋放出DNA。

?在以上實(shí)驗(yàn)中，加入蒸偏水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過(guò)濾時(shí)應(yīng)當(dāng)選用（濾紙、尼龍布）。

血細(xì)胞在蒸鐲水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細(xì)胞膜；食鹽溶解D\A物質(zhì)；選用尼龍布進(jìn)行過(guò)濾。

?在處理植物組織時(shí)需要進(jìn)行研磨，其目的是什么？研磨不充分產(chǎn)生什么結(jié)果？

破碎細(xì)胞壁，使核物質(zhì)容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會(huì)使DNA的提取量減少，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,

導(dǎo)致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍(lán)色等。

具體做法。10mL雞血+20mL蒸儲(chǔ)水一同方向攪拌一3層尼龍布過(guò)濾一濾液

四、去除濾液中的雜質(zhì)

為什么反復(fù)地溶解與析出DNA,能夠去除雜質(zhì)？

用高鹽濃度的溶液溶解DNA,能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除

去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過(guò)反復(fù)溶解與析出DNA,就能夠除去與DNA溶解度不同的多

種雜質(zhì)。

最初求得的DNA濾液含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等雜質(zhì)，需要進(jìn)一步提純DNA。

方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，

不分解DNA；方案三的原理是蛋白質(zhì)和DNA的變性溫度不同。

方案二與方案三的原理有什么不同？

答：方案二是利用蛋白酶分解雜質(zhì)蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；方案三利用的是DNA和

蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。、\

\_\

五、析出與鑒定\|、

?在濾液中仍然含有一些雜質(zhì)，怎樣除去這些雜質(zhì)呢？得到的DNA呈何顏色？/|二一,

濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2?3分鐘，析出的白色絲狀物就

是DNA。DNA呈白色。

?怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？（注意對(duì)照）

具體做法。試管2支，編號(hào)甲乙一各加等量5mLNaCI溶液一甲中放入少量白色絲狀物，使之溶

解f各加4mL二苯胺，混合均勻一沸水浴5minf觀察顏色變化

六、實(shí)驗(yàn)操作

制備雞血細(xì)胞液.......加檸檬酸鈉,靜置或離心

破碎細(xì)胞，釋放DNA…加蒸儲(chǔ)水,同一方向快速通方向攪拌

I-過(guò)濾，除去細(xì)胞壁、細(xì)胞膜等。

溶解核內(nèi)DNA.......加入NaCl至2mol/L,同一方向緩慢攪拌

I

DNA析出............加蒸析水至0.14mol/L,過(guò)濾,在溶解到2moi/L溶液中

If除去細(xì)胞質(zhì)中的大部分物質(zhì)。

DNA初步純化.......與等體積95%冷卻酒精混合,析出白色絲狀物

I-除去核蛋白、RNA、多糖等。

DNA鑒定............二苯胺，沸水浴，呈現(xiàn)藍(lán)色

注意事項(xiàng)：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細(xì)胞懸液濃度；使用塑料燒杯;

使用尼龍布過(guò)濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢(細(xì)胞破裂快速攪拌)；玻棒不要碰到燒

杯壁；二苯胺試劑要現(xiàn)用現(xiàn)配等。

專(zhuān)巡五DNA彳。雷后屆技術(shù)

諜胭二多萊痛金式反應(yīng)抄網(wǎng)DNA仰殿

一、PCR概況

即多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR),是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，

它能以極少量的DNA為模板，在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了因?yàn)?/p>

樣品中DNA含量太低而難于對(duì)樣品進(jìn)行分析研究的問(wèn)題，被廣泛地應(yīng)用于遺傳疾病的診斷、刑偵破

案、古生物學(xué)、基因克隆和DNA序列測(cè)定等各方面。

二、體內(nèi)DNA復(fù)制回顧

1、①定義：以親代DNA為模板合成子代DNA的過(guò)程。

②場(chǎng)所：主要在細(xì)胞核中，隨著染色體的復(fù)制而完成。

③時(shí)期：主要是有絲分裂的間期和減數(shù)第一次分裂的間期。

④復(fù)制條件

細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制條件組分作用

模板DNA的兩條單鏈提供復(fù)制的模板

原料四種脫氧核昔酸合成DNA子鏈的原料

解旋酶打開(kāi)DNA雙螺旋

酶

DNA聚合酶催化合成DNA子鏈

能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能

引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3'端起點(diǎn)

注意：DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA,只能從3'端延伸DNA鏈。因此，DNA復(fù)

制需要引物。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3,

端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此DNA的合成方向總是從子鏈的5'端向3'端延伸。

VM方向

(U5-6DNAVM方向的”;念陽(yáng)

3'

慎頭住

(leadingstraind)

S'前導(dǎo)處

3'的從蹌后fit鏈

(laggingstrand)

注意：引物和模板鏈的3,端堿基互補(bǔ)配對(duì)。并不是在兩端隨意互補(bǔ)配對(duì)的。

2、DNA的復(fù)制過(guò)程:

a.解旋：利用細(xì)胞提供的能量，在解旋酶的作用下，DNA分子氫鍵斷裂，兩條螺旋的雙鏈解開(kāi)；

b.合成子鏈：以解開(kāi)的每一段母鏈為模版，在DNA聚合酶的作用下，利用細(xì)胞中游離的4種脫氧核

甘酸為原料，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，各自合成與母鏈互補(bǔ)的一段子鏈；

c.子鏈延伸：隨模版鏈解旋過(guò)程的進(jìn)行，新合成的子鏈也在不斷延伸.同時(shí)，每段新鏈與其對(duì)應(yīng)的

模版鏈盤(pán)繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)；

d.形成2個(gè)新的DNA分子：復(fù)制結(jié)束，1個(gè)DNA分子形成2個(gè)完全相同的DNA分子，新復(fù)制的2個(gè)

子代DNA分子，通過(guò)細(xì)胞分裂分配到2個(gè)子細(xì)胞中去；

3、體內(nèi)DNA復(fù)制特點(diǎn)

a.半保留復(fù)制b.邊解旋邊復(fù)制

c.半不連續(xù)

d.多起點(diǎn)復(fù)制（僅限真核生物）

e.新鏈的合成方向：子鏈5'端-3'端

f.雙向復(fù)制

［思考］DNA分子能準(zhǔn)確復(fù)制的原因有哪些？

DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)提供模板；堿基互補(bǔ)配對(duì)；DNA聚合酶的復(fù)查功能。

［思考］細(xì)胞內(nèi)哪些物質(zhì)是從頭合成的？

RNA合成、蛋白質(zhì)合成。

三、PCR的原理及條件

1、a.原理：利用DNA雙鏈復(fù)制的原理，將目的基因的核甘酸序列不斷地加以復(fù)制，使其數(shù)量呈指

數(shù)方式增加。

b.前提：要有一段已知目的基因的核甘酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物。

c.需要條件：①DNA模板②兩種引物③4種脫氧核甘酸④耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）⑤緩沖液和

溫度控制

2、a.為什么不需要解旋酶？

DNA復(fù)制過(guò)程中，雙鏈的解開(kāi)是進(jìn)行DNA復(fù)制的前提。在體外，可以通過(guò)控制溫度來(lái)實(shí)現(xiàn)這一過(guò)

程.在80—100C的溫度范圍內(nèi)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開(kāi)，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為變性.當(dāng)溫

度緩慢降低后，兩條彼此分離的DNA鏈又會(huì)重新結(jié)合成雙鏈。PCR利用了D\A的熱變性原理，

通過(guò)控制溫度來(lái)控制雙鏈的解聚與結(jié)合。

b.為什么需要耐熱的DNA聚合酶？

高溫解決了DNA雙鏈的打開(kāi)問(wèn)題，但是會(huì)導(dǎo)致DNA聚合酶失活。耐高溫的TaqDNA聚合酶的發(fā)現(xiàn)

和應(yīng)用，不僅解決了上述問(wèn)題，且大大增加了PCR的效率，使PCR技術(shù)趨于自動(dòng)化。

C.為什么需要兩種引物？

3'???????????????????????—S'

DNA雙畦模板"LLLLLLLLLLLLL1工LLLLLL□二，

|第一步

第一步：DNA變性3'-------------------------------------------------------5'

成為單群5'-------------------------------------------------------3'