高效液相色譜法課件

返回章目錄高效液相色譜法High

Performance

Liquid

Chromatography分析化學(xué)教研室高效液相色譜儀分析流程仿真系統(tǒng)1高效液相色譜法概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀6小結(jié)習(xí)題及解答2返回章目錄一、概述高效液相色譜法：以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，在氣相色譜的

理論和實(shí)驗(yàn)方法基礎(chǔ)上建立的一種分離分析方法。簡(jiǎn)稱：HPLC；HRLC；SPLC；UPLC超高效液相色譜（Ultra

Performance

Liquid

Chromatography）與經(jīng)典LC相比——高效高效填料：3～5μm高壓泵輸液高靈敏度的檢測(cè)器:在線檢測(cè)3返回章目錄一、概述分析對(duì)象流動(dòng)相差別GC能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，占有機(jī)物的20%惰性氣體HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，占有機(jī)物的80%液體，種類較多，選擇余地廣HPLC與GC區(qū)別4返回章目錄一、概述HPLC儀器示意圖5返回章目錄一、概述Agilent

11006返回章目錄一、概述HPLC儀器圖SHIMADZUWATERSAGILENT7返回章目錄一、概述application8返回章目錄高效液相色譜法概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀69返回章目錄二、基本原理范氏方程（Van

Deemter

equation)：重要GC：填充柱開口毛細(xì)管柱H

=

A

+

B/u

+CuH

=

B/u

+

CuHPLC：H

=

A

+

Cu原因：T↓；η↑；u↑→忽略B/u10返回章目錄二、基本原理GC

和

HPLC

的

H-u

圖(1)

B/u

(2)

Cu

(3)

A

(4)

HPLC的uopt(5)

GC的uopt11返回章目錄二、基本原理HPLC：范氏方程（van

Deemterequation)H

=

A

+

CuA

=

2λdpC=

Cm+Csm影響因素：λ↓選球形固定相，高壓、勻漿裝柱法dp↓選粒徑小的化學(xué)鍵合相C↓選粘度小、低流速的流動(dòng)相12返回章目錄高效液相色譜法概述1基本原理23各類高效液相色譜法固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀613返回章目錄三、各類高效液相色譜法液固吸附色譜法（LSC）1液液分配色譜法（LLC）2化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）314返回章目錄三、各類高效液相色譜法液固吸附色譜法分離機(jī)理:組分分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附劑表面活性中心固定相:硅膠流動(dòng)相:底劑（烷烴）+ 極性調(diào)節(jié)劑出柱順序：強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱例如：TLC15返回章目錄三、各類高效液相色譜法液液分配色譜法分離機(jī)制：利用組分在兩相中分配系數(shù)的差異分類:概念及保留行為（重要）正相色譜

NPLC固定液極性>流動(dòng)相極性極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱反相色譜

RPLC固定液極性<流動(dòng)相極性極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱16返回章目錄三、各類高效液相色譜法化學(xué)鍵合相色譜法(bonded

phase

chromatography，BPC)概念：固定液的官能團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合在載體表面反相鍵合相離子抑制正相鍵合相17返回章目錄離子對(duì)三、各類高效液相色譜法反相鍵合相色譜法(RBPC)分離機(jī)制：疏溶劑理論等固定相：非極性的鍵合相如:十八烷基硅烷鍵合相（ODS；C18柱)流動(dòng)相：極性大的流動(dòng)相如:甲醇-水或乙腈-水流動(dòng)相極性與k的關(guān)系:極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑極性大的組分先出柱應(yīng)用：非極性--中等極性組分(80%)18返回章目錄三、各類高效液相色譜法正相鍵合相色譜法(NBPC)分離機(jī)制：定向作用力、誘導(dǎo)作用力、或氫鍵作用力的差別固定相：極性大的氰基或氨基鍵合相流動(dòng)相：極性小的底劑（烷烴）+極性調(diào)節(jié)劑流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓結(jié)構(gòu)相近組分，極性大的組分后出柱19返回章目錄三、各類高效液相色譜法離子對(duì)色譜法(IPC,PIC)分離機(jī)制：在流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使形成不帶電的中性離子對(duì)，以改善分離機(jī)理：流動(dòng)相B+H+固定相BH++RSO-3+Na+RSO3Na[BH+.RSO-3]中性離子對(duì)[BH+.RSO-3]↗增加了在非極性固定相中溶解度。20返回章目錄三、各類高效液相色譜法常用離子對(duì)試劑：分析對(duì)象離子對(duì)試劑例如堿烷基磺酸鈉C5、C6、C7、C8磺酸鈉,SDS酸四丁基季銨鹽四丁基胺磷酸鹽（TBA）21返回章目錄三、各類高效液相色譜法離子抑制色譜法(ISC)分離機(jī)制：通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制組分離解，

增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸，弱堿的目的適用范圍：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸7.0≤pKa≤8.0

的弱堿抑制劑:弱酸（HAc）、弱堿（NH3·H2O）或緩沖液22返回章目錄HPLC概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀623返回章目錄四、固定相液-固色譜固定相載體：硅膠無定形全多孔硅膠球形全多孔硅膠YWG

YQG高分子多孔微球

YSG特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低24返回章目錄四、固定相化學(xué)鍵合相 特點(diǎn)：不易流失；熱穩(wěn)定性好；化學(xué)性能穩(wěn)定載樣量大；適于梯度洗脫分類：非極性鍵合相：ODS中等極性鍵合相：醚基鍵合相極性鍵合相：氨基、氯基鍵合相25返回章目錄四、固定相非極性鍵合相：ODS載體：全多孔YWG，YQG、堆積硅球表面覆蓋度：§參加反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例?！炱浯笮?，決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)作用。鍵合基團(tuán)鍵長(zhǎng)：鍵長(zhǎng)↑，載樣量↑，k↑26返回章目錄HPLC概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相45流動(dòng)相高效液相色譜儀627返回章目錄五、流動(dòng)相要求：與固定液不反應(yīng)；對(duì)樣品有良好溶解度粘度??；與檢測(cè)器匹配α

與固定相性質(zhì)和流動(dòng)相種類有關(guān)k

與流動(dòng)相配比有關(guān)28返回章目錄五、流動(dòng)相正相洗脫反相洗脫流動(dòng)相的極性小于固定相的洗脫流動(dòng)相的極性大于固定相的洗脫洗脫方式：等度洗脫(isocratic

elution)恒定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫梯度洗脫(gradient

elution)在一個(gè)分析周期內(nèi)不斷改變流動(dòng)相的比例29返回章目錄五、流動(dòng)相30返回章目錄HPLC概述1基本原理2各類高效液相色譜法3固定相4流動(dòng)相5高效液相色譜儀631返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵進(jìn)樣器色譜柱檢測(cè)器工作站高效液相色譜儀HPLC32返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站泵： 恒壓泵恒流泵:柱塞往復(fù)泵33返回章目錄六、高效液相色譜儀Agilent

二元泵示意圖34返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站35返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站色譜柱：由柱管(不銹鋼管)和固定相組成分析柱φ

2-4.6mmφ

1-1.5mmφ

20-50mmL

10-25cm

常量柱

L

10-20cm

常微量柱L

3-25cm制備柱36返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站檢測(cè)器:紫外檢測(cè)器熒光檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器其它檢測(cè)器37返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站38返回章目錄六、高效液相色譜儀T/min波長(zhǎng)(nm)色譜－光譜圖39返回章目錄六、高效液相色譜儀輸液泵→進(jìn)樣器→色譜柱→檢測(cè)器→工作站2489UVD2414RID2424ELSD2465ECDWATERSWATERS40返回章目錄六、高效液相色譜儀超高效液相色譜儀(waters)41返回章目錄小結(jié)熟悉掌握了解HPLC的特點(diǎn).HPLC的儀器結(jié)構(gòu)及各部件.HPLC中色譜條件的選擇.化學(xué)鍵合相色譜法.范氏方程在

HPLC的表達(dá)形式.分離度影響因素正相色譜和反相色譜.42返回章目錄習(xí)題及解答填空題：反相色譜中固定相的極性

小于

流動(dòng)相的極性.HPLC中范氏方程的表達(dá)式為:

H

=

A

+

Cu

HPLC流動(dòng)相的pH值應(yīng)控制為

2-8

43返回章目錄習(xí)題及解答A.極性減少

C.載樣量增大B.極性增大

D.載樣量減少選擇題：1. 鍵合相的鍵合基團(tuán)的碳鏈長(zhǎng)度增長(zhǎng)后

(

AC

)2. 提高色譜柱柱效的可行方法是

(B.降低固定相的粒度分布

D.勻漿裝柱F.選擇適宜流動(dòng)相A.選擇小粒度的固定相

C.選擇球形固定相E.增加柱長(zhǎng)

G.降低流速ABCD)44返回章目錄習(xí)題及解答計(jì)算題：1.

用15cm長(zhǎng)的ODS柱分離兩個(gè)組分，