實(shí)用高效液相色譜法的建立糾錯(cuò)版第7章-離子樣品：反相-離子對(duì)和離子交換HPLC

第7章離子樣品：反相，離子對(duì)和離子交換HPLC7-1引言圖1-3中的討論將常規(guī)樣品分為2類：中性樣品和離子樣品。離子樣品是任何含有一種或一種以上離子的或可解離的有機(jī)化合物的混合物。中性樣品的別離已在第6章討論；本章討論離子樣品的反相，離子對(duì)和離子交換HPLC的別離。一些離子樣品也包含在圖1-3中特殊樣品范疇中：生物樣品〔見第11章〕、手性樣品〔見第12章〕和無機(jī)離子。無機(jī)離子的別離在本書中不作討論。離子樣品的HPLC別離往往更復(fù)雜且難于理解。而且，往往有一些中性化合物碰不到的問題。另一方面，離子樣品的譜峰間距比中性樣品更易于控制，這一點(diǎn)使最終別離成功的可能性大為增加。7-2酸性和堿性樣品為方便本章的討論，我們定義“離子溶質(zhì)〞為在通常pH范圍內(nèi)〔大多數(shù)硅膠基質(zhì)色譜柱：2<pH<8，以及pH穩(wěn)定柱：1<pH<14〕，含有一個(gè)或一個(gè)以上酸性或堿性官能團(tuán)的有機(jī)分子。強(qiáng)酸或強(qiáng)酸堿是在所研究pH范圍內(nèi)完全解離的化合物[如鏈烷磺酸〔pH>2、四烷基銨鹽〔pH<13〕或大多數(shù)pH<8的烷基胺〕。在HPLC別離條件下離子電荷隨pH發(fā)生變化的化合物簡(jiǎn)單地稱作酸或堿。如流動(dòng)相pH被限制在較窄范圍內(nèi)，某特定酸〔如醋酸〕的保存行為可能與強(qiáng)酸〔pH>7，完全解離〕，酸〔3<pH<7，解離度隨pH變化〕或中性化合物〔pH<3，不解離〕的類似。同理，堿的分類方式也類似。7-2-1酸堿平衡與反相保存在反相色譜〔RPC〕中，疏水化合物樣品的保存值較大〔見6-2-1節(jié)〕。當(dāng)某種酸〔HA〕和堿〔B〕發(fā)生解離〔即從不帶電形式轉(zhuǎn)化〕，其疏水性將會(huì)大大減弱〔親水性增強(qiáng)〕。因此，在RPC中的保存值k可能下降10~20倍。HA＜＝＞A-＋H+〔7-1〕B＋H+＜＝＞BH+〔7-2〕疏水親水〔RPC中保存較強(qiáng)〕〔RPC中保存較弱〕當(dāng)pH增加，酸失去質(zhì)子〔發(fā)生解離〕；而當(dāng)pH降低時(shí)，堿獲得質(zhì)子〔也發(fā)生解離〕；因此隨pH增加，酸的RPC保存值減小，而堿的那么增大。該保存值行為的說明見圖7-1所示5種不同化合物的RPC保存值隨流動(dòng)相pH值變化的關(guān)系圖。在3<pH<9的范圍內(nèi)，化合物1與2呈酸性，化合物4與5呈堿性，3為中性。圖7-2a進(jìn)一步闡述了這種酸堿行為，一種堿性化合物〔理想的〕保存與pH的關(guān)系。當(dāng)pH值在一足夠大的范圍內(nèi)發(fā)生變化，樣品的解離和保存值如圖呈特有的S形曲線〔亦見圖7-1中的化合物4〕。在該保存值-pH曲線的中點(diǎn)〔見圖7-2a中虛線〕，pH值等于該化合物〔就堿來說為BH+〕的pKa值。文獻(xiàn)中的不同酸或堿的pKa值通常指在水緩沖劑中的測(cè)得值。如果HPLC流動(dòng)相中含有有機(jī)溶劑，其pKa值可隨%B有所變化〔見7-2-3節(jié)〕。當(dāng)一種化合物的pKa=pH時(shí)，其有一半解離〔即流動(dòng)相中B與BH+的濃度相等〕。幾乎所有與pH相關(guān)的保存值變化均發(fā)生于pKa值±1.5單位的pH值范圍內(nèi)〔見圖7-2a的B區(qū)域〕。超出該范圍〔圖7-2a中為pH<2.5或pH>5.5〕，該化合物或者完全解離或者完全未解離，其保存值隨pH變化不大〔即保存行為與中性化合物相似〕。該情況見圖7-1所示，當(dāng)pH>6時(shí)的化合物1，與pH<7時(shí)的化合物2的情況。如化合物含有多個(gè)酸和╱或堿基，其RPC保存值與流動(dòng)相pH的關(guān)系那么更為復(fù)雜。當(dāng)這些基團(tuán)相同時(shí)〔酸性或堿性〕，其保存值與pH的關(guān)系根本相似，如圖7-3a中所示的一系列含有一、二、五與七個(gè)可解離的酸性基團(tuán)〔-COOH〕的化合物[〔蝶?；途邸彻劝彼醈。而當(dāng)一個(gè)分子中同時(shí)存在一個(gè)酸性和一個(gè)性堿基團(tuán)時(shí)，〔兩性〕保存行為更復(fù)雜，見圖7-3b所示的幾種氨基酸的RPC別離。中間pH值處保存值最小，因?yàn)?<pH<8時(shí)，羧基與氨基都發(fā)生解離；這時(shí)分子解離程度最大，親水性最強(qiáng)〔盡管靜電荷為零〕。圖7-1流動(dòng)相pH對(duì)反相保存的影響與樣品類型〔酸、堿、中性〕的關(guān)系色譜柱：30×0.4cmμBondapakC18，流動(dòng)相：0.025M磷酸鹽、40%甲醇；化合物：1水楊酸；2苯巴比妥3非那西丁4尼古丁5甲基苯丙胺。7-2-2緩沖液的選擇當(dāng)別離酸性或堿性樣品時(shí)，參加緩沖劑控制流動(dòng)相的pH是非?？扇〉??！灿胮H計(jì)〕很難精確測(cè)定含有有機(jī)溶劑的流動(dòng)相的pH，因?yàn)殡姌O響應(yīng)易發(fā)生漂移。因而，如使用pH計(jì)，最好先調(diào)節(jié)緩沖劑的pH，再參加有機(jī)溶劑。這就使最終流動(dòng)相的實(shí)際pH值難以確定〔因?yàn)閰⒓佑袡C(jī)溶劑會(huì)改變pH〕，但該問題比流動(dòng)相pH重現(xiàn)性不好要大得多〔即當(dāng)參加有機(jī)溶劑后，再測(cè)pH值〕。選擇具體緩沖劑時(shí)，應(yīng)切記的幾種考慮因素：緩沖容量UV吸收度其它性質(zhì)：溶解度、穩(wěn)定性、與樣品和╱色譜柱的相互作用、揮發(fā)性、對(duì)HPLC系統(tǒng)的腐蝕等。7-2-2-1緩沖容量緩沖容量由pH、緩沖劑pKa及其濃度決定。與樣品化合物的情況類似，緩沖劑發(fā)生解離的pH范圍為pKa±1.5。只有在此pH范圍內(nèi)緩沖劑才能有效地控制pH值。因此，為了保險(xiǎn)起見，為某具體別離所選擇的緩沖劑應(yīng)控制的范圍pH≈pKa±1.07-2b下的討論〕。假定進(jìn)樣體積較小和╱或樣品對(duì)流動(dòng)相pH的影響不很大，10~50mM濃度的緩沖劑對(duì)RPC別離一般足夠。較高的緩沖劑濃度〔>50mM〕可以提供較大的緩沖容量，但在高%B的流動(dòng)相中可能不溶。高濃度的緩沖劑也可能對(duì)不銹鋼材質(zhì)的HPLC系統(tǒng)操作不利。25mM的緩沖劑濃度通常是較好的折中方案。表7-1中總結(jié)了HPLC中幾種常用緩沖劑的可用pH范圍數(shù)據(jù)。圖7-2保存值和緩沖容量與pKa和pH的關(guān)系〔a〕對(duì)于pKa=4.0堿性化合物，保存值對(duì)pH的理想的依賴關(guān)系，〔b〕當(dāng)流動(dòng)相緩沖容量減小時(shí)峰形變差的情況。3，5-二甲基苯胺作為溶質(zhì)〔pKa=3.8〕；25×0.46cm氰基柱，25%MeOH-緩沖溶液〔25mM磷酸鉀〕，1ml/min，350C；用具有臨界緩沖容量的流動(dòng)相，難以保證那些在流動(dòng)相pH值下局部解離的化合物的別離重現(xiàn)性。這種情況下，每次運(yùn)行的保存值都可能發(fā)生變化，產(chǎn)生畸峰。如圖7-2b所示，用25mM磷酸鹽緩沖劑在pH值介于3與4時(shí)，3，5-二甲基苯胺〔DMA〕的RPC別離。緩沖劑的pKa值為2.1，所以當(dāng)流動(dòng)相pH>3.1時(shí)，其緩沖容量將顯著降低。在這些實(shí)驗(yàn)條件〔25%MeOH-緩沖劑〕下，溶質(zhì)〔DMA〕的pKa為3.8〔即2.8<pH<4.8，將局部解離〕。從圖7-2b中可以看出，隨pH值增加到3以上〔降低緩沖容量〕，溶質(zhì)的峰形逐漸變差，而且，當(dāng)pH>3.5時(shí)〔緩沖容量非常小，見7-2-2-4節(jié)的進(jìn)一步討論〕，峰變形已相當(dāng)嚴(yán)重。7-2-2-2緩沖液的紫外吸收理想狀態(tài)下，緩沖劑應(yīng)在或者低于220nm處透光性良好，以便于在低UV波長(zhǎng)處檢測(cè)。表7-1中的所有緩沖劑〔除枸櫞酸鹽外〕，都滿足該標(biāo)準(zhǔn)。有時(shí)，有必要在200nm或以下進(jìn)行UV檢測(cè)。表7-1中的幾種緩沖劑〔磷酸鹽、碳酸鹽、銨鹽〕能在非常低的UV波長(zhǎng)檢測(cè)。然而緩沖劑由于含有雜質(zhì)，在低UV波長(zhǎng)的吸收度可大大提高。表7-1中的UV截止波長(zhǎng)所指是純?cè)噭┑摹?-2-2-3緩沖液的其它性質(zhì)圖7-3一個(gè)以上的酸或堿基取代的樣品分子的保存值對(duì)pH值的依賴關(guān)系〔a〕樣品：蝶?；?低聚-υ-L-谷氨酸[-〔=FA，葉酸〕、三五、七個(gè)羥基]與pH值的關(guān)系；PartisilODS-2色譜柱；流動(dòng)相：6%乙腈-緩沖劑〔0.1M磷酸鹽；450C〔b〕樣品：氨基酸：苯丙氨酸，亮氨酸，頡氨酸，丙氨酸〕；XAD-4柱填料；40mM磷酸鹽緩沖液。表7-1HPLC中常用緩沖劑緩沖劑pKa緩沖范圍aUV截止波長(zhǎng)b三氟乙酸>>21.5~2.5210nm〔0.1%〕磷酸╱磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀2.17.212.3<3.16.2~8.211.3~13.3<200nm〔0.1%〕<200nm〔10mM〕檸檬酸╱檸檬酸三鉀3.14.75.42.1~6.4230nm〔10mM〕甲酸╱甲酸鉀3.82.8~4.8210nm〔10mM〕乙酸╱乙酸鉀4.83.8~5.8210nm〔10mM〕碳酸氫鉀╱碳酸鉀6.410.35.4~7.4c9.3~11.3<200nm〔10mM〕215nm〔10mM〕雙-Tris丙烷eHCl╱雙-Tris丙烷6.89.05.8~7.88.0~10.0215nm〔10mM〕225nm〔10mM〕TrisdHCl╱Tris8.37.3~9.3205nm〔10mM〕氯化銨╱氨9.28.2~10.2200nm〔10mM〕1-甲基哌啶HCl╱1-甲基哌啶10.19.1~11.1215nm〔10mM〕三乙胺HCl╱三乙胺11.010.0~12.0<200nm〔10mM〕a緩沖劑所允許的pH范圍〔保守的估計(jì)〕b吸光度<0.5A；c需要參加酸〔如醋酸或磷酸〕dTris：三〔羥甲基〕氨基甲烷；eBis：1，3-二[三〔羧甲基〕氨基甲烷]丙烷。緩沖劑的溶解度、揮發(fā)性和穩(wěn)定性〔可能與設(shè)備、樣品和╱或色譜柱發(fā)生作用〕對(duì)某些別離也很重要。無機(jī)緩沖劑，如磷酸鹽，在含有高濃度有機(jī)物的溶液中的溶解度不大。甲醇-水流動(dòng)相比乙腈-水或THF-水溶液的溶解度大，因此甲醇可能是有機(jī)溶劑的首選。無機(jī)緩沖劑通常比擬穩(wěn)定，不過揮發(fā)性緩沖劑可能難以維持恒定的pH〔尤其充氮?dú)鈺r(shí)〕。例如，碳酸鹽緩沖劑放置后，由于長(zhǎng)時(shí)間CO2會(huì)逸出，流動(dòng)相pH可能增大。pH<2.5時(shí)，三氟醋酸〔TFA〕高度解離，幾乎不揮發(fā)〔該緩沖劑經(jīng)常用于肽和蛋白質(zhì)的別離；見11-2-1節(jié)〕。一些緩沖劑放置即降解，儲(chǔ)存或長(zhǎng)期使用后，其UV吸收也會(huì)增加〔如：TFA、三乙胺〕。有報(bào)道，枸櫞酸緩沖劑對(duì)不銹鋼材質(zhì)有腐蝕作用，但也有報(bào)道稱每天結(jié)束工作時(shí)清洗系統(tǒng)、除去枸櫞酸鹽，HPLC系統(tǒng)即可用該緩沖劑。枸櫞酸鹽緩沖劑的主要缺點(diǎn)是UV吸收較高，使其UV檢測(cè)限于230nm以上。一些緩沖劑能通過形成離子對(duì)，與樣品發(fā)生作用〔如三氟醋酸緩沖劑與陽離子樣品；三乙胺與陰離子樣品等〕。雖然，這種離子對(duì)作用并非總不好，但當(dāng)別離條件偶然改變時(shí)，會(huì)使色譜圖解析變得復(fù)雜〔見7-3節(jié)〕。揮發(fā)性緩沖劑對(duì)2種情況有作用。如需回收純化的樣品組分〔制備HPLC，見第13章〕，通過蒸發(fā)或冷凍枯燥能方便地除去緩沖劑。碳酸銨、甲酸銨、醋酸銨和三氟醋酸等緩沖劑可作這類應(yīng)用。某些檢測(cè)器[如蒸發(fā)光散射〔見3-3-1節(jié)〕或質(zhì)譜〔見3-3-4節(jié)〕]可能需要揮發(fā)性緩沖劑。7-2-2-4適宜的緩沖液反相HPLC別離一般采用C8或C18鍵合相硅膠-基質(zhì)色譜柱，pH范圍超出2~8時(shí)，這種色譜柱不穩(wěn)定。因此，緩沖劑應(yīng)能將pH控制在2~8之間。如緩沖劑可在210nm或以下波長(zhǎng)檢測(cè)，那么很理想。表7-1說明，磷酸鹽緩沖劑可控制的pH范圍在2.1~3.1或6.2~8.2。醋酸鹽的緩沖范圍是3.8<pH<5.8，與磷酸鹽結(jié)合使用時(shí)，那么能較好地控制整個(gè)2<pH<8范圍內(nèi)的pH〔注意：用磷酸鹽緩沖劑的pH6.2~8.2和11.3~13.3的緩沖范圍時(shí)，硅膠基質(zhì)柱不穩(wěn)定；見5-2-3-4節(jié)和5-4-3-6節(jié)〕。枸櫞酸鹽的優(yōu)點(diǎn)是能用單一緩沖劑控制寬范圍的pH：2.1<pH<6.4。該緩沖液有另一優(yōu)點(diǎn)，如將枸櫞酸〔A，pH2.5〕和枸櫞酸三鈉〔B，pH6.5〕2緩沖劑等濃度混合，在該pH范圍內(nèi)，pH值隨%B的變化幾乎呈線性〔詳見附錄ⅠⅤ〕。在方法建立過程中，利用該特點(diǎn)簡(jiǎn)單地混合pH2.5和pH6.5的緩沖劑，即可方便、快速地得到預(yù)期的pH改變。一旦確定了最正確pH后，即可用醋酸鹽或〔尤其是磷酸鹽取代枸櫞酸鹽，以利于理想的低波長(zhǎng)檢測(cè)。然后應(yīng)注意，改變緩沖劑可能導(dǎo)致選擇性的變化。附錄ⅠⅤ提供了配制理想pH的緩沖劑的詳細(xì)信息。7-2-3pKa與化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系優(yōu)化流動(dòng)相pH值時(shí)，了解各樣品組分的近似pKa值是非常重要的。利用該信息可以將流動(dòng)相的pH值規(guī)定于一適用的范圍中〔例如，pKa±1.5時(shí)，譜峰間距的變化受pH的影響；或者，如果要盡量減小pH對(duì)保存值的影響，使方法穩(wěn)定，那么可用超出此范圍的〔pH〕。假設(shè)不知樣品組分的pKa值，可以通過樣品的分子結(jié)構(gòu)估計(jì)出。表7-1總結(jié)了一些典型樣品分子中常見的酸或堿取代基在水中的pKa值。表7-2酸性與堿性官能團(tuán)的pKa值官能團(tuán)酸性pKa堿性pKa脂肪a芳香b脂肪a芳香b磺酸-SO3H11氨基酸-C(NH2)-COOH2-49-2羧基-COOH4-54-5巰基-SH10-116-7嘌呤2-49酚-OH10-12吡嗪1亞砜-SO1-2噻唑1-3胺,-NH2,-NR2,吡啶8-115咪唑7哌嗪10a指脂肪取代基(如乙酸)b指芳香取代基(如苯甲酸)由于幾種原因，應(yīng)小心使用表7-2的數(shù)據(jù)。首先，取代基〔如-COOH〕的pKa值可能受相鄰取代基的電負(fù)性影響而變化很大。例如，醋酸的pKa為4.8，而三氟醋酸的pKa卻為0.7。其次，如在流動(dòng)相中參加有機(jī)溶劑，pH與pKa值還會(huì)進(jìn)一步發(fā)生變化。當(dāng)按照以上推薦調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH〔參加有機(jī)物以前〕，一項(xiàng)研究數(shù)據(jù)顯示酸性樣品〔苯甲酸衍生物〕在水中和水-甲醇混合液中所測(cè)得pKa值差異很小。同時(shí)也說明堿性樣品〔苯胺衍生物〕中甲醇濃度每增加10%時(shí)，其表現(xiàn)；pKa降低約0.3個(gè)單位。其它研究也說明吡啶衍生物中甲醇、乙腈或THF濃度每增加10%，其pKa降低0.1~0.3個(gè)單位。如圖7-2a所示，有可能通過別離效果隨pH的變化來推斷化合物的酸或堿性以及近似的pKa值〔即，保存值在極端pH時(shí)，顯示的極大值和極小值的中間pH=pKa〕。例如，圖7-1中化合物4〔一種堿〕的pKa值大約為7。同樣，化合物1是一種酸，其pKa<4。據(jù)報(bào)道有計(jì)算機(jī)軟件可通過3次改變pH的RPC實(shí)驗(yàn)，估計(jì)其pKa值〔作為方法建立的一局部，見10-2-1-1節(jié)〕。另有研究通過改變pH和離子對(duì)試劑濃度的等度HPLC實(shí)驗(yàn)，可以將所有的樣品組分按酸性、堿性、中性、強(qiáng)酸性或強(qiáng)堿性分類。該程序已被擴(kuò)大用于梯度洗脫。7-2-3-1適宜的流動(dòng)相pH樣品分子中最常見的酸或堿取代基為胺[-NH2、-N〔CH3〕2等]、堿性雜環(huán)和羧酸〔-COOH〕基團(tuán)。芳香胺、吡啶與芳香及脂肪羧酸在水溶液中的pKa范圍為4~5，而脂肪胺的pKa為8~11。RPC色譜柱一般使用的pH范圍為2~8，這將很大程度排除對(duì)脂肪胺解離和保存的控制。因此，與pH有關(guān)的保存值變化最可能發(fā)生于pH3~6的范圍內(nèi)，這不包括烷基胺化合物。HPLC方法建立中選擇最正確起始pH受多種因素的影響。優(yōu)化峰間距和別離時(shí)，希望樣品保存值隨pH發(fā)生變化。這時(shí)，選擇pH在≈pKa±1范圍內(nèi)改變。其它情況下，對(duì)于pH的微小變化，我們可能需要保持不變的別離效果；這就要求pH<〔pKa－2〕或>〔pKa＋2〕。無論處理樣品〔在別離前可估計(jì)pKa值〕還是未知樣品〔pKa由實(shí)驗(yàn)近似得出〕，開始RPC方法建立時(shí)最好選用pH微小改變不影響別離的流動(dòng)相〔pH<3見7-3-1節(jié)〕。7-2-4對(duì)于離子樣品適宜的HPLC別離模式對(duì)于常規(guī)離子樣品，我們可以選擇反相、離子對(duì)、離子交換色譜法這3種HPLC別離模式。RPC具有簡(jiǎn)單、應(yīng)用范圍廣和較好的柱性能等特點(diǎn)，通常是首選的別離模式。假設(shè)RPC別離不夠理想，可以考慮在流動(dòng)相中參加離子對(duì)試劑。通過對(duì)離子對(duì)試劑濃度的控制來拓寬RPC的范圍；因此，在離子對(duì)試劑濃度由0變至最大值時(shí)，會(huì)有RPC-IPC保存值的連續(xù)變化。所以起初的RPC實(shí)驗(yàn)有助于后面IPC別離〔假設(shè)需要的話〕條件的優(yōu)化選擇。對(duì)于特殊的別離目的，可以考慮從離子對(duì)或離子交換色譜開始，見7-4與7-5節(jié)中的討論。7-3離子樣品反相別離的優(yōu)化7-3-1初始實(shí)驗(yàn)離子樣品反相別離的方法建立與中性樣品有些相似〔6-4節(jié)〕。初始別離實(shí)驗(yàn)條件的選擇，可參照表1-3中的推薦值。離子樣品與中性樣品初始實(shí)驗(yàn)的主要差異為需用〔1〕經(jīng)pH緩沖的流動(dòng)相；〔2〕硅羥基效應(yīng)最小的反相柱〔即：堿性RPC柱，見5-2-1節(jié)〕。也可用非硅膠基質(zhì)柱〔例如聚苯乙烯、石墨化碳等，見5-2-1節(jié)〕。不過，最正確結(jié)果往往是用表5-4中的低酸性硅膠基質(zhì)色譜柱獲得。硅羥基效應(yīng)〔見7-3-3-2節(jié)〕可導(dǎo)致堿性樣品的峰形變差，柱效降低。對(duì)于這些樣品，用低pH的流動(dòng)相通?？梢缘玫捷^高的柱效〔見7-3-3-2節(jié)〕。而且低pH方法一般抗干擾性較好，因?yàn)榇缶植繕悠返谋４嬷挡灰资躳H微小改變的影響。最后，當(dāng)首次開始HPLC方法建立時(shí)，并不知道獲得適宜的別離是否需要改變pH；所以初始實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相pH<3最好。下一步實(shí)驗(yàn)是通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相強(qiáng)度〔%B〕，以使樣品具有適宜的保存值范圍0.5<k<20。離子樣品不大可能被強(qiáng)保存，故很可能獲得較寬的k值范圍。因此，方法建立的最正確方案是初始運(yùn)行用梯度洗脫。梯度選用寬范圍〔例如5→100%B〕，必須注意防止高%B時(shí)析出緩沖鹽。這需使用低緩沖鹽濃度〔如5~10mM〕或較易溶的緩沖劑〔如0.1%三氟醋酸〕。初始梯度洗脫完成后，可估計(jì)最正確等度保存的%B〔0.5<k<20，見8-2-2節(jié)〕。用初始梯度也可提供關(guān)于樣品k值范圍的信息〔如：可以采用等度別離嗎？〕。假設(shè)最初選擇的pH值在等度別離時(shí)不行，可改變pH或參加離子對(duì)試劑，以降低樣品的保存值范圍，并再進(jìn)行等度別離〔見下文討論〕。另外，假設(shè)k值范圍太寬，樣品可用梯度洗脫進(jìn)行別離〔見第8章〕。中選擇的流動(dòng)相強(qiáng)度〔%B〕得到適宜保存值后，可能還需調(diào)整峰間距，即盡量擴(kuò)大樣品的別離度或降低保存值范圍，以便進(jìn)行等度別離。最后，能改變柱條件以最好地兼顧別離度、運(yùn)行時(shí)間和柱壓〔見2-3-2節(jié)〕。7-3-2選擇性的控制與中性樣品的方法建立相比，離子樣品反相別離中的峰間距控制可選擇其它的別離條件。如樣品的酸性或堿性〔pKa值〕，能更好地預(yù)測(cè)選擇性的變化。改變pH往往是改變別離選擇性的最有效方式。其它可有效地改變峰間距的條件是%B、溶劑類型〔甲醇、乙腈、THF〕、溫度、柱類型〔C8與C18、氰基、苯基〕與緩沖劑濃度。注意用高溫度的緩沖劑流動(dòng)相對(duì)柱壽命會(huì)有不利影響，尤其pH<3或pH>7。7-3-2-1pH如圖7-1中所示，pH變化可導(dǎo)致離子化合物的k值發(fā)生10倍或更大的變化。因此，在改變pH的同時(shí)有必要對(duì)%B進(jìn)行調(diào)整。另一方面，如果樣品中含有中性化合物且又最后流出，改變pH對(duì)總運(yùn)行時(shí)間就不會(huì)有太大影響。這種情況下，改變pH而不必調(diào)整%B?；诔跏继荻鹊倪\(yùn)行結(jié)果〔甲醇-緩沖劑，pH2.5〕和表8-2，進(jìn)行圖7-4a中的等度別離。保存值范圍足夠〔2<k<10〕，但峰6╱7未分開。這時(shí)，如需研究pH的影響，最好進(jìn)行另外1或2次pH改變1個(gè)單位的實(shí)驗(yàn)。圖7-4b和c表示pH分別為3.5和4.5時(shí)的別離結(jié)果。pH3.5的保存值范圍仍可以〔0.8<k<6〕，但峰5╱6未分開。且峰8╱9重疊在一起。因?yàn)殛P(guān)鍵峰對(duì)由6╱7〔pH2.5〕變成了5╱6〔pH3.5〕，那么有可能在中間pH獲得更好別離。pH4.5別離時(shí)〔見圖7-4c〕，樣品保存值〔0.4<k<1.8〕和別離度均缺乏。如需進(jìn)一步研究該pH的別離，首先必須降低圖7-4中所用的〔35%B〕甲醇濃度。檢查圖7-4b~c的3次別離情況，下一實(shí)驗(yàn)pH的邏輯選擇應(yīng)介于2.5~3.5之間〔如pH3.0〕。其別離見圖7-4d所示，所有譜峰都獲得了較好的別離〔關(guān)鍵峰對(duì)3╱4的Rs=1.8〕。通過移動(dòng)峰4使其與峰3與5等距時(shí)，還能獲得少許改善。增加pH至3.1，可獲得這種效果〔未畫出，但參見圖7-4a和b〕，其Rs=1.9〔關(guān)鍵峰對(duì)3╱4和4╱5〕。圖7-4說明在別離1組酸-堿官能團(tuán)相似的化合物時(shí)〔本例中為苯甲酸類混合物〕，通過改變pH有可能很好地控制譜峰間距。當(dāng)樣品中同時(shí)含有酸、堿和╱或中性混合物時(shí)，峰間距甚至能期望得到更顯著的改變，如圖7-1中數(shù)據(jù)所示。然而優(yōu)化pH以控制峰間距和別離時(shí)，必須權(quán)衡方法的普適性[即當(dāng)制備新的流動(dòng)相時(shí)，流動(dòng)相微小的不可防止的pH變化對(duì)于保存值和別離效果的影響〔見7-3-3-1節(jié)〕]。圖7-4取代苯甲酸的別離與pH值的關(guān)系樣品：1：2-硝基；2：鄰苯二甲酸；3：雜質(zhì)；4：2-氟；5：3-氰基；6：2-氯；7：3-硝基；8：3-氟；9：2-6二甲基；條件：25cmZorbaxC8柱；35%甲醇-緩沖劑〔25mM醋酸鈉〕350C；1.0ml/min。即使像圖7-4中所示的簡(jiǎn)單pH-依賴型別離，也很難在不同的色譜柱之間對(duì)峰跟蹤識(shí)別。當(dāng)pH改變時(shí)，有些酸性或堿性樣品的吸光度會(huì)發(fā)生改變，故在不同pH值時(shí)運(yùn)行的化合物無法保持其峰大小不變。由于這些及其它原因，有時(shí)有必要進(jìn)行數(shù)次pH微小改變是實(shí)驗(yàn)〔如0.2~0.5單位〕。為了合理地優(yōu)化pH，也可能需要在所有運(yùn)行中注入標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行峰確認(rèn)，見10-7節(jié)中峰跟蹤識(shí)別的討論。7-3-2-2溶劑強(qiáng)度〔%B〕當(dāng)改變pH以改變峰間距時(shí)，可能有必要同時(shí)改變%B以維持良好的k范圍。這種調(diào)整會(huì)引起選擇性的其它變化。因此希望峰間距如中性樣品那樣隨%B而改變〔見6-3-1節(jié)〕。圖7-5中所示為取代苯胺類混合物在pH3.5、以甲醇-緩沖劑為流動(dòng)相的別離。甲醇濃度由20%變?yōu)?0%，后4個(gè)峰的別離順序從5<6<7<8變?yōu)?<5≈8<7。與中性樣品相比，由于離子樣品反相別離中樣品與固定相之間存在其它的相互作用，當(dāng)改變%B時(shí)引起的選擇性改變對(duì)離子樣品往往較大，因此，也應(yīng)永遠(yuǎn)記住溶劑強(qiáng)度的重要性，也是優(yōu)化選擇性的一個(gè)因素。圖7-5取代苯胺的別離與甲醇百分比〔%B〕的關(guān)系樣品：1：4-甲氧基；2：N-乙基；3：3-甲基；4：3-5-二甲基；5：4-氯；6：3-氰基，7：3-氯；8：2-氯；條件：25cmZorbaxSB-C8柱；流動(dòng)相：甲醇-緩沖劑〔25mM枸櫞酸鈉pH3.5〕。350C；1.0ml/min，〔a〕20%甲醇〔b〕40%甲醇。上段的討論可能說明同時(shí)改變pH與%B往往是有利的，它們可獨(dú)立地對(duì)α進(jìn)行優(yōu)化。這對(duì)酸性樣品〔苯甲酸衍生物〕似乎是正確的，但對(duì)于堿性樣品〔苯胺衍生物那么不盡然。當(dāng)為0.5<k<20調(diào)節(jié)了%B，為α和別離度選擇了最正確pH后，進(jìn)一步調(diào)節(jié)%B卻無法再改善樣品〔苯胺〕的別離度。相反，為改善選擇性，如pH不變而優(yōu)化%B，進(jìn)一步改變pH也不會(huì)改善別離效果。這一有趣的結(jié)果似乎說明酸性樣品的pH和pKa隨%B變化不大，而堿性樣品的pH與pKa卻確實(shí)隨%B而變化。因此，由于堿性樣品的pH和╱或pKa隨%B發(fā)生變化，有些情況下為改善選擇性而改變%B與改變pH的效果相當(dāng)。即改變pH或pKa均可，它們對(duì)選擇性的改變類似，但這2種條件的結(jié)合使用卻并不能再進(jìn)一步改善別離效果。7-3-2-3溶劑類型一般認(rèn)為溶劑類型〔乙腈、甲醇、THF〕對(duì)于離子樣品選擇性的影響方式與對(duì)中性樣品的極為類似。因此，改變?nèi)軇╊愋蛯?duì)優(yōu)化別離是一有效途徑。對(duì)別離某些離子樣品〔需用大%B的強(qiáng)疏水性樣品〕，甲醇可能優(yōu)于乙腈，與含乙腈或THF的流動(dòng)相比擬，大多數(shù)緩沖劑在甲醇-水混合液中溶解得更好。7-3-2-4柱溫如6-3-4節(jié)中所述，溫度對(duì)RPC別離中性樣品的峰間距影響一般很小。而對(duì)離子樣品那么不同，因?yàn)檫@類別離中包含多種不同的保存過程，而每一種對(duì)溫度的改變都有不同的響應(yīng)〔如：樣品化合物解離度的變化；同一化合物解離和未解離分子的疏水保存；包括解離種類的硅羥基效應(yīng)；pH和pKa隨溫度的變化等〕?？梢灶A(yù)料選擇性隨溫度改變的最大點(diǎn)將出現(xiàn)在使有關(guān)化合物局部解離時(shí)的pH值〔即pH的中間值〕。該效果見圖7-6中所示的圖7-4中苯甲酸樣品的別離與溫度的關(guān)系。pH3.2時(shí)，等于該樣品的平均pKa值〔所以，所有化合物均局部解離〕，在中間的溫度〔400C，圖7-6b〕可獲得最正確別離效果。注意，底pH或高pH與較高溫度的結(jié)合使用都會(huì)導(dǎo)致大多數(shù)RPC柱鍵合相的迅速流失〔見5-4-3-6節(jié)〕。圖7-6取代苯甲酸的別離與溫度的關(guān)系樣品與條件同圖7-4，但pH為3.2?！瞐〕300C〔b〕400C〔c〕500C7-3-2-5緩沖濃度緩沖劑濃度對(duì)離子樣品RPC保存值的影響一般較小。然而，由于堿性樣品與其硅羥基顯著解離的硅膠基質(zhì)色譜柱的結(jié)合，那么會(huì)有所不同。對(duì)于酸性〔A型〕RPC柱的任何pH，pH>6時(shí)的任何硅膠基質(zhì)柱，硅羥基解離均可發(fā)生〔見式7-3a〕，這些解離的硅羥基能通過離子交換過程，很強(qiáng)地保存質(zhì)子化堿或其它陽離子〔見7-3-3-2節(jié)與式7-3〕。于是增加緩沖劑的濃度，會(huì)選擇性地降低所有樣品陽離子的保存值，因增加了緩沖劑陽離子的競(jìng)爭(zhēng)力。這種影響用于以ZorboxC8柱別離PTH-氨基酸樣品的例如已有報(bào)道〔圖1-5b〕。不過，一般不推薦改變緩沖濃度作為改善選擇性的手段，因?yàn)楣枇u基解離的柱間重現(xiàn)性一般不好，導(dǎo)致樣品保存值和別離飄忽不定。7-3-2-6胺改性劑在流動(dòng)相中參加胺改性劑會(huì)影響堿性樣品的別離，一般使峰形有較大改善〔見7-3-3-2節(jié)〕。由于胺對(duì)解離的硅羥基有掩蔽作用，隨胺改性劑濃度的增加，堿性化合物的保存值往往會(huì)降低。這將有利于改變選擇性。有研究描述了同時(shí)優(yōu)化%B、pH、甲胺濃度，別離含有13種代謝物的藥物，胺改性劑影響選擇性的應(yīng)用也取決于解離的硅羥基〔見7-3-2-5節(jié)〕，而且同類型的色譜柱之間也會(huì)有所不同。因此，改變胺濃度并非控制選擇性的首選。再者，如在流動(dòng)相中參加胺改性劑，其濃度那么應(yīng)足夠大，以盡可能大地抑制硅羥基效應(yīng)。7-3-2-7柱型由6-3-3節(jié)的例如可知，改變色譜柱類型〔C8、氰基、苯基〕可使中性樣品的譜峰間距發(fā)生變化。用不同類型的色譜柱會(huì)使離子樣品發(fā)生相似的選擇性改變。在離子樣品的方法建立中，改變峰間距有許多其它參數(shù)，而且極為方便，所以一般改變柱型只用于那些優(yōu)化了其它條件后譜峰間距仍不能滿意的樣品。堿性樣品的別離曾采用“原〞硅膠色譜柱和有機(jī)-緩沖劑流動(dòng)相進(jìn)行。其保存似乎是通過離子交換過程實(shí)現(xiàn)，其中包括質(zhì)子化堿和解離的硅羥基〔見式7-3〕。只有在鍵合相柱的常規(guī)RPC不能成功時(shí)，才推薦使用硅膠色譜柱。7-3-3特殊問題離子樣品的RPC方法存在諸多問題，這些問題對(duì)中性樣品不是問題或?qū)τ陔x子樣品那么相當(dāng)突出。7-3-3-1pH敏感度當(dāng)流動(dòng)相pH接近于一種或多種樣品組分的pKa值時(shí)，pH值的微小變化〔小至0.1單位〕會(huì)對(duì)譜峰間距和樣品別離度產(chǎn)生較大影響。這種pH敏感度由不能精確調(diào)節(jié)緩沖劑pH值的準(zhǔn)確度僅達(dá)±0.05~0.1單位。因此，在離子樣品的方法建立過程中，pH對(duì)最終方法的影響大小應(yīng)是主要問題?？梢圆捎脦追N方式將pH的敏感度問題降至最小。首先，測(cè)定方法的pH敏感度。假設(shè)流動(dòng)相pH必須控制在較窄范圍內(nèi)〔±0.1單位或更小〕，可通過準(zhǔn)確量取緩沖劑組成〔重量或體積〕，以精密控制pH值，而不是用pH計(jì)將緩沖劑滴定至理想的pH。其次，如果這種方法不能保證精密調(diào)節(jié)pH，采用比目標(biāo)pH值高或低0.2單位的流動(dòng)相進(jìn)行別離，并將這些色譜圖附于方法步驟中。這樣，當(dāng)由于pH不對(duì)，樣品別離缺乏時(shí)，使用者能利用這些別離調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH，見圖1-5d的例如。最后，對(duì)于pH敏感方法的最好方法是設(shè)計(jì)或重做該方法，普適性更好。有利于最大別離度的那些條件〔尤其是pH值〕往往不利于方法的抗干擾性。對(duì)于抗干擾好的方法，別離條件的微小變化有時(shí)帶來的別離度損失很小。見10-6節(jié)中的討論。7-3-3-2硅羥基效應(yīng)離子樣品，尤其堿性樣品，能與硅膠基質(zhì)色譜柱的硅羥基發(fā)生反響〔見5-2-1-1節(jié)〕。能導(dǎo)致保存值增加，譜峰拖尾，和柱間重現(xiàn)性差。選擇適宜的實(shí)驗(yàn)條件以盡可能減小這些硅羥基效應(yīng)，一般是較理想的。通常，最主要的硅羥基-樣品間的相互作用是由離子交換引起的。樣品中的質(zhì)子化堿〔BH+〕與鈉、鉀或其它陽離子發(fā)生交換反響，它們連在柱填料中的解離的硅羥基上：例如：BH+＋SiO-K+<=>K+＋SiO-BH+〔7-3〕據(jù)式7-3，由于色譜柱保存堿性樣品化合物的容量可能非常有限〔如<1μg〕，正常的進(jìn)樣量〔>1μg〕就會(huì)使柱超載，產(chǎn)生拖尾譜峰〔見2-4節(jié)〕。為解決這一問題，應(yīng)選擇適宜的實(shí)驗(yàn)條件，以盡量減小式7-3的離子交換過程所引起的樣品保存。選用適于堿性樣品的色譜柱可降低硅羥基效應(yīng)〔見表5-4〕。用于這類柱填料的硅膠，制作時(shí)通常盡量減小極酸性的硅羥基數(shù)目，因硅羥基有利于式7-3中的保存過程。所有硅膠基質(zhì)的色譜柱都含有易受影響的硅羥基，但用低pH〔2.0<pH<3.5〕的流動(dòng)相可降低解離硅羥基的濃度，減少其對(duì)樣品保存值的影響：H+＋SiO-K+<=>K+＋SiO-H+〔7-3a〕高pH低pH用高濃度的緩沖劑〔>10mM〕，選用被硅羥基牢固保存的緩沖劑陽離子〔Na+<K+<NH4+<三乙胺+<二甲基辛胺+〕，可阻止解離的硅羥基對(duì)樣品的保存，因此能進(jìn)一步降低硅羥基的影響，濃度25mM的磷酸鉀對(duì)于大多數(shù)堿性樣品一般足夠。鉀鹽緩沖劑在有機(jī)-水流動(dòng)相中比鈉鹽緩沖劑的溶解度大，這說明配制緩沖劑的流動(dòng)相會(huì)更方便。如用鉀緩沖劑時(shí)，堿性樣品仍拖尾，以三乙胺〔TEA〕或己胺代替鉀緩沖劑可能會(huì)解決問題。據(jù)報(bào)道二甲辛胺〔DMOA〕更有效，但它作為流動(dòng)相改性劑會(huì)帶來其它問題。用TEA、己胺尤其是DMOA時(shí)，改變流動(dòng)相后柱平衡會(huì)較緩慢，因此應(yīng)先試用其它方法后，再使用這些胺改性劑。少于1μg的進(jìn)樣量〔對(duì)有問題的堿性化合物而言〕會(huì)進(jìn)一步減少峰拖尾，而在某種情況下，增加進(jìn)樣量也有該效果。在極端情況下，有必要試用另一不同柱，由于某化合物的拖尾情況可能在不同的堿性RPC柱上會(huì)有所不同。另外，如別離對(duì)塔板數(shù)的要求不高，用聚合物〔非硅膠〕RPC柱那么可以消除硅羥基的問題〔聚合物柱一般比硅膠基質(zhì)柱的柱效低〕。有人建議別離堿性樣品時(shí)用較高pH〔如>7〕。弱堿〔如苯胺、吡啶〕在較高pH值下可能不解離，所以能消除式7-3的保存及其有關(guān)問題。一些色譜柱在高pH也顯示拖尾較小，可能由于硅羥基已充分解離，以至柱容量不再受限制。對(duì)于高pH別離，也有報(bào)道乙腈比甲醇或THF的拖尾更大。硅膠基質(zhì)柱在pH6以上時(shí)欠穩(wěn)定，而在pH大于8時(shí)往往無法使用。然而溶膠-凝膠載體制成的致密鍵合的烷基、端基封尾色譜柱在有機(jī)緩沖劑及溫度≤400C條件下，可以日常應(yīng)用的pH至少高達(dá)11〔亦見5-2-3-4和5-4-3-5節(jié)〕。最近報(bào)道了抑制硅羥基與堿性化合物相互作用的另一種方法。用中等酸度的色譜柱〔SpHerisorbC8〕，在流動(dòng)相參加0.02~0.05%乙腈可使幾種苯胺衍生物的峰形有很大改善。這種方法對(duì)〔與硅羥基的作用更強(qiáng)的〕脂肪胺是否也有效尚待進(jìn)一步研究。也有人提出以“動(dòng)力學(xué)改性〞硅膠改善堿性樣品的RPC別離。采用原硅膠作柱填料，在流動(dòng)相中參加0~220mM的四級(jí)長(zhǎng)鏈烷基三甲胺離子。很明顯，這種添加劑以類似于C18填料的烷基涂層覆蓋于填料的外表上，以封閉硅羥基。重現(xiàn)性和峰形都聲稱超過了堿性RPC柱。RPC別離酸性化合物時(shí)偶爾會(huì)有拖尾或峰過度展寬現(xiàn)象,已經(jīng)證明,在流動(dòng)相中加醋酸或醋酸鹽有利于解決這類問題。7-3-3-3溫度選擇性如圖7-6所示，對(duì)于離子樣品的別離，溫度的微小改變會(huì)對(duì)樣品別離度產(chǎn)生明顯影響。因此，柱恒溫對(duì)別離離子樣品比別離中性樣品更重要。假設(shè)色譜柱在室溫下使用，應(yīng)研究溫度變化對(duì)別離的影響。應(yīng)注意預(yù)防不加控制的室溫波動(dòng)可能帶來的問題。7-3-4總結(jié)反相別離離子樣品的方法建立方式與非離子樣品的近似〔見6-4節(jié)〕，但也有一些差異。見圖7-7的總結(jié)。如在一系列研究中的任何一步得到了可接受的別離，下一步工作那么可省略，或照第8步繼續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)〔改變柱條件〕。第1步以25mM磷酸鉀緩沖劑〔pH2.5〕，15×0.46cm低酸性C8與C18柱，流速2.0ml/min與表1-3中的其它條件，進(jìn)行60min的初始梯度，5→100%MeOH?；蛘?，用60%MeOH〔其它條件相同〕進(jìn)行初始等度別離。因?yàn)殡x子樣品往往保存較弱，起始%B值可以較低〔60%B〕，而中性樣品一般用80~100%B，〔見6-2-2-1節(jié)〕。第2步由初始梯度譜圖決定是否可用等度洗脫〔見圖8-6及有關(guān)討論〕。如等度洗脫可行，估計(jì)等度別離的最正確%B〔見表8-2〕；假設(shè)等度洗脫不行，照第2a步繼續(xù)進(jìn)行。另外，由初始等度別離，估計(jì)末峰〔k≈10的%B值，%B減少10%〔如由60%→50%B〕，k值會(huì)增加3倍〔“3倍規(guī)那么〞，見6-2-1-1節(jié)〕。第2a步假設(shè)基于初始梯度的運(yùn)行結(jié)果，等度洗脫不適宜，或等度運(yùn)行結(jié)果超出樣品的保存值范圍〔0.5<k<20〕，不能滿意，那么有3種選擇：同時(shí)調(diào)整pH和%B，以得到適宜的保存值范圍〔0.5<k<20〕建立梯度洗脫方法〔見第8章〕采用離子對(duì)HPLC，以得到適宜的保存值范圍〔見7-4-3-1節(jié)〕。改變pH或使用離子對(duì)能否改善保存范圍，能通過色譜圖中的第1峰和最末峰的pKa值〔假設(shè)知道的話〕推斷出。例如流動(dòng)相pH=2.5時(shí)，假設(shè)第1峰是吡啶衍生物，其k<0.5，而末峰為中性，且k>20，提高pH至6或7應(yīng)導(dǎo)致吡啶衍生物的解離降低并增加其保存值，而不影響末峰的保存值。然后，能再增加%B將所有峰的保存值調(diào)整進(jìn)0.5<k<20之間的范圍。見7-2-1和7-4-1節(jié)中的其它討論，及圖7-8的例如。第3步用由初始實(shí)驗(yàn)得出的%B值進(jìn)行等度別離〔假設(shè)以梯度洗脫進(jìn)一步進(jìn)行方法建立，其方法也類似，見第8章的討論〕。如必要，調(diào)整%B以使k范圍到達(dá)0.5~20。如需改善選擇性，可進(jìn)一步改變流動(dòng)相強(qiáng)度〔±5~10%B〕，以測(cè)定%B對(duì)譜峰間距和別離的影響。通過選擇能提供適宜的保存值和良好別離度的%B值，可得到滿意的別離。假設(shè)未得到可接受的保存值范圍，那么返回第2a步。第4~5步假設(shè)由于峰間距較差，在第3步未獲得足夠的別離，〔用圖6-4〕改為乙腈作溶劑，按需要調(diào)整%B以得到良好的保存值和別離效果。另外，如圖7-4中的例如改變pH，以測(cè)定別離的最正確pH。對(duì)大多數(shù)樣品來說，推薦的pH改變?nèi)鐖D7-4所示：2.5、3.5、4.5。如果樣品的pKa>5，實(shí)驗(yàn)pH那么應(yīng)為4、5、6。pH改變過程中，可能有必要改變%B以維持0.5<k<20。同時(shí)，應(yīng)仔細(xì)調(diào)節(jié)%B，以研究進(jìn)一步控制整體的譜峰間距。第5a步假設(shè)酸性樣品的pKa<2或堿性樣品的pKa>8，可能有必要使用離子對(duì)HPLC〔或用對(duì)pH穩(wěn)定的聚合物柱〕進(jìn)一步控制譜峰間距〔見7-4節(jié)〕。第6~7步通過改變柱類型、溫度或〔不常用的〕緩沖劑濃度，進(jìn)一步改變峰間距。第8步峰間距優(yōu)化完成后，考慮改變柱長(zhǎng)、流速或微粒粒度以進(jìn)一步改善別離效果。見2-3-3-1節(jié)中的有關(guān)討論。7-4離子對(duì)色譜離子對(duì)和反相HPLC共享有多種特征。這2種別離使用的色譜柱和流動(dòng)相大致相似，主要區(qū)別是離子對(duì)色譜〔IPC〕的流動(dòng)相中參加了離子對(duì)試劑。對(duì)于含有離子樣品的大多數(shù)別離，應(yīng)先試用7-3節(jié)的RPC別離，然后再考慮IPC。IPC別離在方法建立和使用方面都很復(fù)雜，并且易受其它實(shí)驗(yàn)問題的影響〔見7-4-5節(jié)〕。假設(shè)RPC方法建立〔見圖7-7〕由于峰間距較差，不能充分別離，此時(shí)應(yīng)考慮選擇IPC。因此，邏輯上，IPC是需進(jìn)一步改善的RPC別離的一種補(bǔ)充方法。某些樣品的首份色譜圖可能提示等度RPC不可代替梯度洗脫，如圖7-8所示。圖7-8a的初始梯度別離說明用該流動(dòng)相不可能得到滿意的等度別離〔見圖8-6中的討論〕，這一點(diǎn)被圖7-8b的30%B的等度別離所證實(shí)。圖7-8b中第1譜峰在k<0.5流出，最末譜峰的k>20。然而，分析早與晚流出的譜峰的酸-堿性質(zhì)那么可找出縮小保存值范圍，使等度別離滿意的方法。早流出峰X~X3為強(qiáng)堿性，因此在pH2~8范圍內(nèi)解離且保存較弱，改變pH不會(huì)影響它們的別離。晚流出峰MP和PP為中性〔而且疏水〕，故其保存值也不受pH影響。但是，用陰離子試劑的離子對(duì)會(huì)選擇性地提高這些早流出的陽離子譜峰的保存值，對(duì)晚流出的中性譜峰的影響相對(duì)較小，使樣品的等度別離滿意〔見圖7-8c；以及下面的討論〕。7-4-1保存機(jī)制樣品的IPC保存過程見圖7-9中所示。圖7-9a簡(jiǎn)單描述了C8或C18柱填料的外表，一個(gè)被負(fù)離子對(duì)試劑〔如己烷磺酸鹽〕的吸附分子覆蓋的矩形體。離子對(duì)試劑因其疏水的烷基被固定相所吸引，于是該試劑所帶的電荷〔C6-SO3-〕連結(jié)于固定相上。固定相上的該負(fù)電荷與試劑和╱或緩沖劑中的正電荷〔Na+〕保持平衡。這樣，以帶正電荷的樣品離子〔質(zhì)子化堿，BH+〕可與所示的Na+離子〔箭頭所指〕進(jìn)行交換，使樣品離子通過離子交換過程得以保存。圖7-9a中進(jìn)行的離子對(duì)HPLC與離子交換色譜非常相似，見7-5節(jié)中所述。圖7-7反相別離離子樣品的方法建立概略圖7-4-1-1pH和離子對(duì)圖7-9b和c進(jìn)一步詳述了酸性〔陰離子〕樣品RCOOH與帶正電的離子對(duì)試劑〔四丁基銨，TBA+〕在IPC中的保存過程。圖7-9b的流動(dòng)相中未加離子對(duì)試劑〔簡(jiǎn)單的RPC別離〕。在低pH時(shí)，與解離的酸RCOO-相比，未解離的RCOOH分子被牢固保存。所以這種情況下，保存值對(duì)pH作圖那么顯示圖7-2a的特征圖形〔注意：圖7-9b的酸性樣品與圖7-2a的堿性樣品圖形相反〕。圖7-9b的例如中，最大保存值出現(xiàn)在低pH，而最小保存值出現(xiàn)在高pH。在圖7-9c中，流動(dòng)相中加了足量的離子對(duì)試劑TBA+，完全覆蓋了固定相，于是使中性分子RCOOH的保存值降到了最小。但是固定相上產(chǎn)生的正電荷〔吸附的TBA+〕強(qiáng)烈吸附帶負(fù)電的RCOO-。在該離子對(duì)條件下，樣品保存值對(duì)pH作圖時(shí)，最大保存值會(huì)出現(xiàn)于高pH〔樣品完全解離〕，最小保存值出現(xiàn)于低pH〔無樣品發(fā)生解離〕。圖7-9c所示的IPC性質(zhì)引起的保存過程與圖7-9b中反相HPLC有很大不同。因此，一旦在反相HPLC使用的流動(dòng)相中參加一種適宜的離子對(duì)試劑，離子樣品的別離選擇性將會(huì)發(fā)生較大變化。圖7-8酸、堿、中性專有混合物的別離樣品：X，堿性藥物；X1~X3，堿性藥物降解物；HB，中性防腐劑MP與PP的酸性降解物；B，酸性防腐劑。條件：〔a〕15×0.46cmZorbaxSB-C8柱，20min梯度，5→100%甲醇-緩沖劑〔25mM醋酸鉀，pH3.5〕；1.0ml/min300C；〔b〕同〔a〕，但用30%B等度別離；〔c〕同〔a〕，但用等度離子對(duì)別離，40%甲醇-緩沖劑〔65mM辛烷磺酸鹽〕，1.5ml/min。7-4-1-2離子對(duì)試劑的濃度通過改變被固定相吸收的離子對(duì)試劑的多少，有可能將保存過程由反相連續(xù)地改變?yōu)殡x子交換色譜。這種變化通過改變流動(dòng)相中的試劑濃度而實(shí)現(xiàn)。首先考慮被C18柱吸收的磺酸鹽試劑P-，圖7-10a所示。對(duì)固定相中的試劑濃度〔P〕s與流動(dòng)相中的試劑濃度〔P〕m作圖，離子對(duì)試劑分別為C6-磺酸鹽和C8-磺酸鹽。當(dāng)流動(dòng)相中離子對(duì)試劑濃度增加時(shí)，柱吸附量也增加，但后來當(dāng)柱對(duì)離子對(duì)試劑到達(dá)飽和時(shí)，吸附量呈穩(wěn)定水平。由于C8-磺酸鹽疏水性較強(qiáng)，故保存也較牢固，在流動(dòng)相中離子對(duì)試劑濃度較低時(shí)，色譜柱即到達(dá)飽和。因此，強(qiáng)疏水的C8-試劑使色譜柱到達(dá)一定的吸附容量〔如50%飽和量〕時(shí)，其濃度低于疏水弱的C6-試劑。樣品保存主要由柱上離子對(duì)試劑的吸附量與所產(chǎn)生的電荷決定。因此，當(dāng)調(diào)節(jié)流動(dòng)相中的試劑濃度，以使色譜柱摩爾吸附量相同，該2種試劑〔C6與C8〕的別離效果將會(huì)相似〔亦見圖7-12c與有關(guān)討論〕。再考慮磺酸鹽離子對(duì)試劑濃度增加時(shí)，樣品保存值的改變〔見圖7-10b〕。對(duì)于親水的離子樣品化合物BH+，發(fā)生保存主要由圖7-10a或圖7-10b的離子交換過程決定。于是，當(dāng)[P]m增加，色譜柱上的電荷增加，化合物BH+的k值也增加。一旦柱對(duì)離子對(duì)試劑到達(dá)飽和〔最大柱荷載〕，樣品的保存趨于平衡。因?yàn)镮PC保存包括離子交換過程，進(jìn)一步增加離子對(duì)試劑濃度也增加反離子〔Na+〕的濃度，它們與樣品離子競(jìng)爭(zhēng)在柱上的保存。因此，隨著離子對(duì)試劑濃度的進(jìn)一步增加，保存值通過極大值后開始下降。在IPC方法建立中，試劑濃度通常由0改變至某一值，以使荷電相反的樣品離子保存最大。這種方法可提供較大范圍的別離選擇性，防止離子對(duì)試劑濃度過高，降低費(fèi)用，增加獲得良好別離的時(shí)機(jī)。圖7-9離子對(duì)色譜保存示意圖〔a〕IPC期間，〔質(zhì)子化堿，BH+〕的保存：Na+為流動(dòng)相的陽離子，離子對(duì)試劑為己烷磺酸鈉；〔b〕羧酸樣品RCOOH在C18固定相上的反相保存與pH的關(guān)系；〔c〕離子對(duì)試劑〔TBA+〕在固定相上的吸附及羧酸樣品〔RCOO-〕的保存值與pH值的關(guān)系。當(dāng)同時(shí)改變pH和離子對(duì)試劑濃度時(shí)，能很好地控制保存值范圍和峰間距，這是樣品通過反相和離子交換〔或離子對(duì)〕過程2者同時(shí)保存的結(jié)果。當(dāng)色譜柱吸收的離子對(duì)試劑量增大，離子交換保存機(jī)制為主，而反相保存機(jī)制為次要。該效果見圖7-11所示的膽酸混合物的別離[logk對(duì)pH的曲線圖；注意圖Y軸的開始單位分別為〔a〕-0.5、〔b〕-0.2]。圖7-11a說明不加離子對(duì)試劑時(shí)，樣品反相保存值與pH值的關(guān)系。所有組分的最大保存值發(fā)生于低pH，而高pH時(shí)的保存值最小。一旦在流動(dòng)相中參加了1mM四丁基銨離子〔TBA+〕，色譜柱對(duì)試劑有較小的吸收〔飽和量的5~10%〕。該吸收使高pH值時(shí)的樣品保存值增加了大約5倍。而在低pH值處，由于吸收的離子對(duì)試劑局部阻塞了固定相，保存值卻有所降低。通常，用濃度非常高的離子對(duì)試劑〔TBA+〕制造較大的離子對(duì)效應(yīng)〔見圖7-13c中的討論，對(duì)圖7-11以45%乙腈-緩沖劑為流動(dòng)相的例如，推薦濃度約為100mM〕。樣品的較大的k值發(fā)生于高pH值，并非低pH〔如圖7-9c〕。7-4-1-3離子對(duì)試劑的類型圖7-12以帶正電的堿〔Adr+〕、帶負(fù)電的酸〔NpS-〕和中性化合物〔BzOH〕的別離，進(jìn)一步說明了隨著離子對(duì)試劑濃度的改變，樣品保存值變化的情況。未加離子對(duì)的別離結(jié)果見圖7-12a。質(zhì)子化堿〔Adr+〕不保存〔k=0〕，其它2化合物〔BzOH和NpS-〕的保存足夠〔k≈5〕。圖7-12b因?yàn)樵诹鲃?dòng)相中加了14mM辛烷硫酸鹽作為離子對(duì)試劑〔柱吸收量為1.6μmol/m2〕，別離發(fā)生了變化。中性化合物BzOH的保存值略有變化，而另2種離子樣品在色譜圖上交換了位置。圖7-12b中Adr+保存值的大幅增加是由于色譜柱上負(fù)電荷〔吸附負(fù)電試劑的結(jié)果〕的吸引所致。而NpS-保存值的劇烈減小是由于受固定相上同種負(fù)電荷排斥作用的結(jié)果。圖7-10離子對(duì)試劑濃度對(duì)別離的影響〔a〕離子對(duì)試劑的吸附與不同疏水性試劑〔C6-、C8-磺酸鹽〕濃度的關(guān)系；〔b〕保存值與試劑濃度的關(guān)系；圖7-11流動(dòng)相pH和離子對(duì)試劑濃度對(duì)不同條件：C18色譜柱；45%乙腈-緩沖劑〔磷酸鹽〕；室溫?！瞐〕無離子對(duì)試劑〔b〕參加1mM四丁基銨〔TBA〕離子。圖7-12離子對(duì)試劑濃度和類型對(duì)離子樣品別離的影響樣品：Adr+腎上腺素，NpS-苯乙醇；BzOH為萘磺酸。條件：C18柱；20%甲醇-緩沖劑〔20mM磷酸鹽，pH6〕；250C?！瞐〕未加離子對(duì)試劑〔b〕14mM辛烷磺酸鹽[〔c〕中的1.6μmol/m2]；〔c〕溶質(zhì)保存值對(duì)色譜柱試劑吸附量〔μmol/m2〕的關(guān)系圖。圖7-12c所示說明受所加試劑影響的別離僅僅取決于色譜柱的有效載荷量。以該3種化合物的各自的保存數(shù)據(jù)對(duì)3種不同的離子對(duì)試劑：C8-、C10-、C12-硫酸鹽被色譜柱吸收的μmol量作圖。一定濃度種類不同的吸收試劑〔μmol╱每柱〕，使各化合物本身的保存時(shí)間大致相等〔即別離結(jié)果相同〕。這說明用不同的離子對(duì)試劑可獲得完全一致的別離結(jié)果。為了獲得與使用C10試劑同樣的別離效果，需要更大濃度的C8試劑流動(dòng)相，或更低濃度的C12試劑流動(dòng)相。有時(shí)，2種離子對(duì)試劑的疏水性差異很大，以至無適宜濃度的低疏水性試劑能提供與高疏水試劑相同的柱吸收量與色譜柱填料荷載。例如常用于肽和蛋白質(zhì)別離的三氟醋酸(TFA)和七氟丁酸(HFBA)〔見11-2節(jié)〕。TFA的吸收明顯少于HFBA，當(dāng)HFBA的流動(dòng)相濃度>10mM時(shí)，任何濃度的TFA都無法到達(dá)與HFBA類似的別離效果。7-4-2初始實(shí)驗(yàn)對(duì)于離子樣品，IPC的初始實(shí)驗(yàn)條件一般與反相別離相同〔見圖7-7〕。也就是說，開始時(shí)不用離子對(duì)試劑。當(dāng)已確定IPC適宜后，那么在流動(dòng)相中參加適宜的離子對(duì)試劑。其它條件保持不變，所以問題是：選用何種離子對(duì)試劑與用多大的濃度？目前應(yīng)用的大多數(shù)離子對(duì)試劑為烷基磺酸鹽或四烷基銨鹽，二者都可以在210nm波長(zhǎng)以上進(jìn)行UV檢測(cè)。烷基磺酸鹽和高氯酸鹽〔ClO4-〕有時(shí)用于別離堿性化合物，但通常這些IPC試劑并無特殊優(yōu)點(diǎn)?；撬猁}通常用于堿性樣品，以增加質(zhì)子化堿和其它陽離子的保存值。四烷基銨鹽用于酸性樣品，以增加解離的酸和其它陰離子的保存值。酸、堿和╱或中性混合物的試劑類型〔陰離子或陽離子〕的選擇將取決于初始色譜圖，如圖7-8中所示?；旌虾呻娤喾吹碾x子對(duì)試劑〔如磺酸鹽加季胺鹽化合物〕，其結(jié)果通常適得其反，因?yàn)?試劑會(huì)發(fā)生結(jié)合，因此易于抵消它們各自對(duì)樣品的保存效果。據(jù)報(bào)道可以十六烷基三甲胺〔CTMA〕和十二烷基磺酸鹽〔DS〕的聯(lián)合使用別離堿性樣品，其中CTMA的主要作用是降低固定相硅羥基的影響。該項(xiàng)研究也報(bào)道用該2種IPC試劑可進(jìn)一步控制保存值和選擇性。7-4-1-3節(jié)的討論說明如果改變離子對(duì)試劑濃度，以獲得相同的固定相荷載[如C6-與C10-磺酸鹽〔如圖7-12C〕或四乙基與四丁基銨鹽]，那么采用不同鏈長(zhǎng)的離子對(duì)試劑也能獲得相似的別離效果。特殊離子對(duì)試劑的選擇〔強(qiáng)疏水或弱疏水〕依賴于流動(dòng)相強(qiáng)度〔%B〕，圖7-13為一概括總結(jié)。圖7-13a為色譜柱的試劑吸收量與辛烷磺酸鹽的流動(dòng)相濃度的關(guān)系圖。不同的曲線〔0，10，25，40〕代表流動(dòng)相中不同百分比的甲醇濃度。如所預(yù)期，%B值越高，溶劑的吸收量〔保存量〕越小〔恰似樣品化合物的保存值〕。圖7-13離子對(duì)類型和濃度的選擇與樣品類型和流動(dòng)相強(qiáng)度〔%B〕的關(guān)系條件：流動(dòng)相為甲醇-緩沖劑，C18柱?！瞐〕C8-磺酸鹽吸收量與不同%B值的試劑濃度的關(guān)系；〔b〕為不同%B值〔堿性樣品〕推薦的烷基磺酸鹽類型和濃度；〔c〕對(duì)不同%B〔酸性樣品〕推薦的四烷基銨離子和濃度。選擇特殊的離子對(duì)試劑的目的是在適宜的試劑濃度下，能有顯著的柱試劑吸收量。這種方法通過改變?cè)噭舛?，可開掘較大范圍的離子對(duì)選擇性。圖7-13a的曲線〔在約300μmol╱g〕的色譜柱最大試劑吸收量時(shí)，趨于平衡，這可通過在0%甲醇時(shí)采用大約40mM的試劑濃度來實(shí)現(xiàn)。假設(shè)流動(dòng)相是40%的甲醇，需要的該試劑濃度那么高得多〔>>40mM〕，以獲得最大的色譜柱吸收量。因此，辛烷磺酸鹽對(duì)于含40%以上甲醇的流動(dòng)相不甚適宜。該情況下，應(yīng)用保存更強(qiáng)的離子對(duì)試劑〔如C10-或C12-磺酸鹽等〕可能更好。圖7-13b總結(jié)了較好的磺酸鹽試劑及其濃度,它們能為含不同甲醇濃度的流動(dòng)相提供有效的離子對(duì)(有效的試劑吸附量)。例如：假設(shè)流動(dòng)相為25%甲醇-水，最好選用C8-或C16-磺酸鹽，初始濃度分別為大約30或10mM。該初始濃度〔約能提供1╱3的最大色譜柱試劑吸附量〕可以在不同條件時(shí)上下調(diào)整，以改變?cè)噭┪搅亢碗x子對(duì)的范圍，進(jìn)而改變峰間距。假設(shè)以乙腈或THF代替甲醇，可用表7-3估計(jì)所推薦的試劑類型及濃度。例如，以25%乙腈作流動(dòng)相，相當(dāng)?shù)募状及俜直葹?0%。那么，圖7-13b顯示C10-或C12-磺酸鹽的初始濃度分別為25mM或5mM。圖7-13c提供的類似指南為應(yīng)用四烷基季胺試劑別離酸類的情況。表7-3用陰離子對(duì)試劑〔如烷基磺酸鹽〕a的HPLC中的溶劑強(qiáng)度關(guān)系〔百分比〕甲醇乙腈THF00010312084301384019145025216032307039〔40〕b80〔46〕〔51〕90〔53〕〔64〕100〔60〕〔78〕a例如，假設(shè)20%甲醇可獲得較好的保存值范圍〔0.5<k<20〕，那么8%乙腈或4%THF應(yīng)具有相近的運(yùn)行時(shí)間。b近似值7-4-3控制保存值范圍和選擇性：改變%B，pH和離子對(duì)試劑濃度7-4-3-1保存值范圍RPC方法建立期間，別離中性樣品時(shí)控制保存值范圍比擬容易。首先改變流動(dòng)相組成〔%B〕以獲得0.5<k<20。假設(shè)改變?nèi)軇╊愋?，可用圖6-4來估計(jì)相同保存范圍所需要的%B變化。因此不難尋找和保持能獲得良好保存范圍的%B值。別離離子樣品的情況略有不同。在通過改變pH、離子對(duì)試劑濃度等試圖改變選擇性時(shí)，可能會(huì)使保存值和保存值范圍發(fā)生過大的變化。使得IPC的方法建立略復(fù)雜于RPC。但另一方面，也可以對(duì)這種保存值的過度變化加以利用。例如，對(duì)于起初似乎需要梯度洗脫的離子樣品，用離子對(duì)條件都可以進(jìn)行等度別離，0.5<k<20。而且，在IPC中假設(shè)樣品譜峰的酸-堿性〔pKa值〕，就可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)不同條件對(duì)這些組分的相對(duì)保存值的影響。這一例如見圖7-8的別離。在圖7-8a的梯度別離和圖7-8b的等度別離中，4種化合物X~X2與HB的保存較弱，而MP與PP的保存很強(qiáng)。該種流動(dòng)相的等度洗脫不可能到達(dá)0.5<k<20。不過，化合物X~X2均為強(qiáng)堿〔pKa≈10，見表7-2〕，所以這些化合物在所有適宜的pH值下都帶正電荷，而化合物MP與PP為中性。這意味著參加磺酸鹽離子對(duì)試劑，將有選擇地增加譜峰X~X2的保存值，并適度地減少譜峰MP、PP的保存值〔如圖7-12c〕，因而縮小了保存值范圍，能進(jìn)行等度別離。參加離子對(duì)試劑的等度別離見圖7-8c所示，該樣品的保存值范圍得以改善：0.8<k<15。其它樣品也可以圖7-8例如的類似方式，通過改變pH或離子對(duì)調(diào)整其保存值和保存值范圍。應(yīng)記住磺酸鹽試劑可劇烈增加帶正電荷組分的保存值，并劇烈降低帶負(fù)電荷組分的保存值〔四烷基銨試劑那么相反〕。任何離子對(duì)試劑都可能降低中性樣品的保存值，但幅度不大。同樣，增加pH值會(huì)使酸的解離增加，使堿的解離降低。這樣，當(dāng)改變流動(dòng)相pH值和╱或離子對(duì)試劑的類型與濃度時(shí)，可以根據(jù)各化合物的pKa值預(yù)測(cè)出保存值的變化。前述的方法〔當(dāng)改變pH與IPC試劑濃度時(shí)，預(yù)測(cè)樣品保存值的變化〕需要知道色譜圖中每種組分的酸堿性質(zhì)〔pKa值〕，以及峰的軌跡，如10-7節(jié)中的討論。或者，當(dāng)開始不知道樣品的pKa值時(shí)，改變pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)〔如圖7-1或圖7-4〕，以估計(jì)每個(gè)譜峰的酸-堿行為。一旦通過這種方法賦予給每個(gè)峰近似的pKa值后，那么可按上述方法進(jìn)行保存值與保存值范圍的預(yù)測(cè)性調(diào)整〔通過改變pH或試劑濃度〕。7-4-3-2選擇性可采用圖7-14所示的另一種方法優(yōu)化pH和離子對(duì)試劑濃度。以低pH〔B〕、高pH〔C〕的緩沖劑以及稍加緩沖的中等pH的緩沖劑另加離子對(duì)試劑〔D〕與有機(jī)溶劑〔甲醇，A〕以系統(tǒng)方式混合，以使pH和離子對(duì)試劑濃度在較寬范圍內(nèi)進(jìn)行變化。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在概念上類似于先前討論的反相HPLC中的溶劑類型選擇性的優(yōu)化〔見圖6-15〕通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相1~3中的甲醇百分比，可使有關(guān)樣品的運(yùn)行時(shí)間大致相等。圖7-14離子對(duì)HPLC中快速優(yōu)化保存值范圍和選擇性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流動(dòng)相pH和離子對(duì)試劑濃度同時(shí)改變圖7-14中的首次實(shí)驗(yàn)〔低pH，1號(hào)〕，需調(diào)整%B〔甲醇〕，以提供良好的保存值范圍〔0.5<k<20〕，或使最末峰的保存值k=10~20。一旦到達(dá)了別離，用類似的方法實(shí)驗(yàn)第2次高pH，2號(hào)與第3次離子對(duì)，3號(hào)。有時(shí)，這3次實(shí)驗(yàn)僅需要很小的%B改變即可保持恒定的保存時(shí)間，但有時(shí)也可能有必要改變10~20%B。下一步是混合3種初始流動(dòng)相〔1~3〕，以配制流動(dòng)相4~7〔見圖6-15的類似討論〕。用相同摩爾濃度的枸櫞酸鹽緩沖劑作1號(hào)與2號(hào)緩沖劑，完成該方法很方便，由于1和2緩沖劑按其各自溶液的比例混合時(shí)，pH值呈線性變化。于是，流動(dòng)相4的pH值為1和2的中間值〔中選好接近于最正確的pH值后，可由磷酸鹽或醋酸鹽代替枸櫞酸鹽，以利于低UV波長(zhǎng)檢測(cè)〕。當(dāng)完成了所有7次運(yùn)行后，以圖7-14的格式列出所得色譜圖：見圖7-15的例如。所得流動(dòng)相的性質(zhì)總結(jié)如表7-4，實(shí)驗(yàn)條件的進(jìn)一步調(diào)整如圖6-16。該IPC實(shí)驗(yàn)方法見圖7-15混合5種化合物的例如所示，包括一種或多種酸、堿與中性物質(zhì)。表7-4運(yùn)行條件運(yùn)行pH離子對(duì)〔%〕a1低〔2.5〕12高〔7.5〕03中〔5.0〕1004中〔5.0〕05高〔7.5〕506低〔2.5〕507中〔5.0〕33A%離子對(duì)試劑〔見運(yùn)行3〕圖7-15圖7-14系統(tǒng)優(yōu)化圖示的應(yīng)用，一種鎮(zhèn)咳-抗感冒制劑的別離樣品為混合的5種化合物：1、去氧腎上腺素，2、愈創(chuàng)木酚甘油醚，3、偽麻黃堿，4、苯甲酸鈉，5、對(duì)羥苯甲酸甲酯〔尼泊金甲酯〕。條件：15×0.46cmZorbax柱，流動(dòng)相如下：溶劑1234567A：甲醇30273429303230B：pH2.5緩沖液70003503523C：pH7.5緩沖液07303636024D：200mM己烷磺酸鹽00660333322圖7-15的別離對(duì)快速找出pH與離子對(duì)試劑濃度的最正確結(jié)果很有效。首先應(yīng)考慮具有良好的保存值范圍的別離：0.5<k<20。實(shí)驗(yàn)1~5均有一極為接近于t0流出的譜峰〔k≈0〕，而實(shí)驗(yàn)6和7均說明其第一峰的k>1〔保存值可接受〕。在圖7-15的所有7次實(shí)驗(yàn)中，末峰的k值均約為5。由這些初始實(shí)驗(yàn)運(yùn)行〔見圖7-15〕可以斷定pH2.5~5，離子對(duì)試劑33~50%〔67~100mM己烷磺酸鹽〕可以有效地保持一個(gè)適宜的保存值范圍。然而，由于譜峰間距不好，實(shí)驗(yàn)6和7中的別離度〔見圖7-15〕很勉強(qiáng)。2次實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵峰對(duì)不同，所以采用中間的pH值有望改善別離。另外，實(shí)驗(yàn)4的別離度良好，說明可保持pH在5.0，混合流動(dòng)相4和7以改善離子對(duì)試劑濃度，對(duì)改善第一峰的保存值可能有利。2流動(dòng)相50╱50混合的別離結(jié)果見圖7-16〔實(shí)驗(yàn)4╱7〕所示。實(shí)驗(yàn)4╱7的保存值范圍可以接受〔1<k<7〕，而且別離度幾乎足夠〔Rs=1.3〕。實(shí)驗(yàn)7和4╱7的比擬說明，不同比例地混合這2種流動(dòng)相，能使峰3位于峰2和峰5的中間，得到極好的最終別離效果。圖7-16圖7-15中鎮(zhèn)咳-抗感冒制劑的方法建立的繼續(xù)實(shí)驗(yàn)4與7的重復(fù)色譜圖；混合實(shí)驗(yàn)4與7的的流動(dòng)相，制備新流動(dòng)相的色譜圖。據(jù)報(bào)道另有一種同時(shí)優(yōu)化pH和離子對(duì)試劑濃度的實(shí)驗(yàn)步驟。它更適于定量預(yù)測(cè)別離與這2種條件的關(guān)系。用4水平2因子解析設(shè)計(jì)，需改變pH和離子對(duì)試劑濃度的16次實(shí)驗(yàn)。類似的方案也有其它報(bào)道，需要的實(shí)驗(yàn)工作更多，應(yīng)用于對(duì)付那些極具挑戰(zhàn)力的樣品。7-4-4其它因素對(duì)選擇性變化的影響7-4-4-1溶劑強(qiáng)度〔%B〕如上文討論，一并改變pH和離子對(duì)試劑濃度，可很好地控制保存值范圍與峰間距?？刂票４嬷捣秶部赡苄枰瑫r(shí)改變%B，進(jìn)一步小量改變%B，〔仍保持0.5<k<20〕往往對(duì)IPC峰間距產(chǎn)生有用的改變，如圖7-17所示。該別離的關(guān)鍵峰對(duì)是X3╱對(duì)羥基苯甲酸丙酯〔最末2峰〕。甲醇百分含量的增加導(dǎo)致所有4種質(zhì)子化堿〔X~X3〕的相對(duì)保存下降，以及最末2峰別離度的有效增大。最終，以50%的甲醇濃度，峰X與對(duì)羥基苯甲酸丙酯峰發(fā)生重疊〔產(chǎn)生一新的關(guān)鍵峰對(duì)〕。45%甲醇的流動(dòng)相獲得該例如的最正確別離。圖7-17的結(jié)果可歸納如下。當(dāng)IPC別離離子和中性化合物時(shí)，%B的增加會(huì)減少離子對(duì)試劑在固定相上的吸附〔如圖7-13a〕。這會(huì)導(dǎo)致選擇性地減少與離子對(duì)試劑荷電相反的離子化合物的保存值。反過來又選擇性地減少了這些離子化合物的相對(duì)保存值，如圖7-17。7-4-4-2溫度當(dāng)2個(gè)或多個(gè)不同機(jī)制影響樣品保存時(shí)，可試用溫度改變選擇性。在離子對(duì)HPLC中，通常包括下面樹種平衡過程：樣品保存通過離子交換和╱或反相過程；緩沖劑和樣品的解離；離子對(duì)的吸附。因此，IPC中改變溫度確實(shí)會(huì)顯著地改變峰間距。必須注意：如使離子對(duì)HPLC的別離重現(xiàn)性好，對(duì)柱恒溫是非常重要的。7-4-4-3緩沖液濃度緩沖劑〔或鹽〕濃度的增加會(huì)降低那些形成離子對(duì)的樣品化合物的保存值。其原因是那些化合物在別離條件下發(fā)生離子交換〔見圖7-9a和圖7-10b〕。這樣，增加離子對(duì)HPLC中緩沖劑〔或鹽〕的濃度與離子對(duì)試劑的降低起著非常相似的作用。由緩沖劑濃度改變引起的選擇性影響可通過改變離子對(duì)試劑濃度來模擬。因此，很少以緩沖劑濃度作為離子對(duì)HPLC中控制溶劑選擇性的方法。圖7-17溶劑強(qiáng)度〔%B〕對(duì)離子對(duì)色譜中峰間距的影響樣品與條件同圖7-8c，但改變了甲醇濃度；本圖中重復(fù)圖7-8c的別離〔40%甲醇〕7-4-4-4溶劑的類型改變IPC中溶劑的類型〔甲醇、乙腈、四氫呋喃〕偶爾可用作改變選擇性的手段。有些情況下，改變?nèi)軇╊愋彤a(chǎn)生的峰間距變化不大。而另外情況下，通過改變?nèi)軇╊愋蛥s會(huì)使選擇性發(fā)生顯著且有用的改變。該效果見圖7-18中所示的離子對(duì)HPLC別離兒茶酚胺混合物，用的溶劑不同；〔a〕10%甲醇；〔b〕2.5%四氫呋喃；〔c〕6%乙腈。乙腈為適宜的溶劑。然而，峰間距的類似變化也可通過上述任何一種改變〔%B，pH等〕來實(shí)現(xiàn)。另一IPC中溶劑類型-對(duì)選擇性的影響例如見圖7-19所示，為圖7-8和圖7-17中所述的藥品制劑的別離。當(dāng)用乙腈作有機(jī)溶劑時(shí)，優(yōu)化%B與離子對(duì)試劑濃度得到了圖7-19a的別離結(jié)果。譜圖中間有6譜峰〔X~X2〕緊挨在一起，勉強(qiáng)分開。當(dāng)以甲醇代替乙腈，再優(yōu)化%B與離子對(duì)試劑濃度后，堿性化合物X~X3的保存顯著增大，使別離得到很大改善，見圖7-19b。該例如中改變?nèi)軇╊愋褪挂唤M關(guān)鍵峰〔圖7-19b的峰2-6〕的保存值范圍得以擴(kuò)展，別離度大增。當(dāng)如圖7-18和如圖7-19改變有機(jī)溶劑類型時(shí)，用溶劑強(qiáng)度計(jì)算圖〔見圖6-4〕可方便地使溶劑強(qiáng)度和運(yùn)行時(shí)間保持恒定。然而，圖6-4對(duì)于IPC往往不可靠。因此，可能有必要照?qǐng)D6-4改變?nèi)軇╊愋秃?，再進(jìn)一步調(diào)節(jié)%B。當(dāng)采用磺酸鹽離子對(duì)試劑時(shí)，已證明表7-3中的關(guān)系圖比圖6-4更可靠〔但未包括圖7-19的濃度〕。7-4-4-5緩沖液或添加鹽的類型在IPC中通常不采用改變緩沖劑類型來改善選擇性。流動(dòng)相中一般也不再添加鹽。由于IPC局部地依賴離子交換過程，當(dāng)改變緩沖劑或參加鹽時(shí)，可期望得到類似于離子交換色譜的效果〔見7-4節(jié)〕。離子強(qiáng)度的降低會(huì)導(dǎo)致那些與離子對(duì)試劑發(fā)生作用的化合物的保存值增加。圖7-18離子對(duì)色譜中溶劑類型對(duì)峰間距的影響兒茶酚胺的別離；樣品：1、去甲腎上腺素；2、腎上腺素；3、辛胺；4、3，4-二羥基苯胺；5、多巴胺；6、異戊二烯醇；7、酪氨酸；條件：15×0.46cmC18柱；50mM磷酸鹽水溶液〔pH2.5〕；1ml/min；250C。〔a〕10%甲醇-緩沖液；〔b〕2.5%四氫呋喃；〔c〕6%乙腈。圖7-19離子對(duì)色譜中溶劑類型對(duì)峰間距的影響樣品同圖7-17，但有機(jī)溶劑不同。〔a〕15×0.46cmZorbaxSB-C8柱；30%乙腈-緩沖；緩沖為100mM乙酸鉀，pH3.5和27mM辛烷磺酸鹽；450C；2ml/min；〔b〕別離如圖7-17b〔45%甲醇-水〕。7-4-4-6胺改性劑在IPC中的流動(dòng)相中參加胺改性劑已被用于改變堿性樣品別離中的選擇性。這種情況下的離子對(duì)試劑為陰離子試劑〔如烷基磺酸鹽〕，胺改性劑與烷基磺酸鹽易于形成離子對(duì)，易抵消其效果。因此，參加胺改性劑或降低離子對(duì)試劑濃度可期望得到類似的選擇性。然而，有一例如的情形卻不同。即使用了胺改性劑對(duì)選擇性增加了其它控制。7-4-5特殊問題離子樣品在反相別離中的問題〔見7-1節(jié)〕在離子對(duì)HPLC中也可能發(fā)生：pH敏感性、硅羥基效應(yīng)〔不嚴(yán)重〕、溫度敏感性〔較嚴(yán)重〕及峰跟蹤識(shí)別。還能預(yù)期一些其它困難。7-4-5-1人工峰在IPC中，當(dāng)注入樣品溶劑〔進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)〕時(shí)，有時(shí)正、負(fù)峰都可觀察到。有些人工峰會(huì)干擾HPLC方法的建立或日常應(yīng)用。因此，在IPC方法建立開始之前和得到有希望的別離之后，均應(yīng)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。人工峰問題通常由流動(dòng)相與樣品溶劑組成的差異所引起，使用不純的緩沖劑、離子對(duì)試劑或其它流動(dòng)相添加劑都會(huì)放大這種影響。IPC中良好的通用規(guī)那么是：盡可能近似地匹配樣品溶劑和流動(dòng)相的組成〔包括試劑濃度〕，增大進(jìn)樣濃度、減小進(jìn)樣體積〔如<50μl〕。假設(shè)問題仍存在，應(yīng)試用不同批次的離子對(duì)試劑。7-4-5-2柱平衡緩慢在某些條件下，色譜柱吸收和釋放離子對(duì)試劑的過程可能很緩慢。因此，當(dāng)一種，或2種流動(dòng)相均含有離子對(duì)試劑時(shí)，改變流動(dòng)相后必須證實(shí)樣品保存值能夠重現(xiàn)，方可使用。當(dāng)離子對(duì)試劑疏水性較強(qiáng)〔例如癸烷磺酸鹽與己烷磺酸鹽〕和╱或使用季胺鹽試劑〔如四丁基銨〕時(shí)，柱平衡通常較慢。當(dāng)欲更換IPC流動(dòng)相時(shí)，最好先用清洗溶劑將柱中以前的離子對(duì)試劑除去，再用新流動(dòng)相平衡色譜柱。陰離子試劑〔如磺酸鹽〕用50~80%的甲醇-水作清洗溶劑，那么易于除去。季胺試劑需用50%甲醇-緩沖劑〔100~200mM〕〔如pH4~5，100mM磷酸鉀；參加磷酸鉀以降低試劑銨基與硅羥基發(fā)生作用〕進(jìn)行清洗。2種情況下，在用新流動(dòng)相檢查保存值重現(xiàn)性〔柱平衡〕之前，應(yīng)至少用20倍柱體積的清洗溶劑進(jìn)行清洗。色譜柱用含有離子對(duì)試劑的流動(dòng)相進(jìn)行初始平衡時(shí)，也可能比擬緩慢。開始時(shí)認(rèn)為圖7-17b的IPC方法用20~30倍柱體積的流動(dòng)相沖洗后，到達(dá)了平衡。然而，當(dāng)后來延續(xù)運(yùn)行一段時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)11小時(shí)后堿性化合物X~X3的保存值出現(xiàn)了非常緩慢的下降。為防止每一個(gè)系列實(shí)驗(yàn)前都進(jìn)行12小時(shí)的柱平衡，有必要在一個(gè)系列實(shí)驗(yàn)完成后，將色譜柱保存在流動(dòng)相中。這樣可在下次實(shí)驗(yàn)開始之前，極快地到達(dá)平衡。假設(shè)在這些條件下使用梯度洗脫，色譜柱與許多離子對(duì)試劑的緩慢平衡會(huì)帶來一系列問題。保存值重現(xiàn)性較差、基線不穩(wěn)及其它一些別離問題。因此，通常不推薦離子對(duì)HPLC用梯度模式。但有例外應(yīng)注意：用小分子的離子對(duì)試劑如三氟醋酸鹽〔TFA〕和三乙胺時(shí)，其柱平衡過程較快。TFA經(jīng)常用作肽和蛋白質(zhì)梯度別離的添加劑，一般沒問題。有報(bào)道，三乙胺在梯度洗脫中作離子對(duì)試劑情況不錯(cuò)。7-4-5-3峰形較差與反相別離一樣，IPC中硅羥基效應(yīng)也會(huì)使峰形變壞。因此，當(dāng)別離堿性化合物時(shí)，應(yīng)注意選擇色譜柱和流動(dòng)相〔見表5-4，7-3-3-2節(jié)〕。然而，用離子對(duì)試劑時(shí)，硅羥基效應(yīng)往往不甚明顯。原因是陰離子試劑給予柱填料額外的負(fù)電荷，這削弱了通過硅羥基的離子交換過程對(duì)樣品保存的重要性；同樣，由于離子對(duì)試劑與解離的硅羥基之間強(qiáng)烈的相互作用，陽離子試劑對(duì)掩蔽硅羥基非常有效。有研究說明提高柱溫操作可修正IPC中的峰前伸。相反，圖7-19a中樣品別離在低溫度最好。流動(dòng)相條件再稍作改變〔39%ACN和25mM醋酸鉀及27mM辛烷磺酸鹽〕，色譜圖中最末2峰變?yōu)閄3〔堿性〕和對(duì)羥基苯甲酸丙酯〔中性〕。圖7-20所示為用不同溫度對(duì)X3與對(duì)羥基苯甲酸丙酯的別離：說明280C是該別離的最正確溫度。造成這一奇怪峰形行為的原因尚不清楚，但它可能與在某些IPC實(shí)驗(yàn)條件下，流動(dòng)相中試劑膠束的形成有關(guān)。任何情況下，IPC中遇到峰形不好和╱或塔板數(shù)降低時(shí)，最好研究一下溫度變化對(duì)峰形的影響。一般降低或提高柱溫對(duì)峰形和塔板數(shù)會(huì)有所改善。圖7-20離子對(duì)色譜中溫度對(duì)峰形的影響別離如圖7-19a，但溫度和其它條件有別：15×0.46cmZorbaxSB-C8柱；39%乙腈-緩沖劑；緩沖劑為25mM乙酸鉀〔pH3.5〕，含27mM辛烷磺酸鹽；2ml/min；7-4-6總結(jié)初始實(shí)驗(yàn)應(yīng)先不加離子對(duì)試劑〔RPC條件〕。由于用IPC帶來的復(fù)雜性和潛在問題，只有為到達(dá)特殊目標(biāo)時(shí)才應(yīng)參加離子對(duì)試劑〔如更好地控制整體保存值范圍或峰間距〕。不管是否在流動(dòng)相中參加離子對(duì)試劑，開始時(shí)方法建立均以類似的方式進(jìn)行。第1步初始別離〔梯度洗脫較好〕同反相方法建立的第一步〔見7-3-4節(jié)與圖7-7〕。第2步用初始梯度譜圖決定是否可用等度洗脫〔見圖9-6〕。如等度洗脫可行，估計(jì)等度別離的最正確%B〔見圖9-7〕；假設(shè)等度洗脫不適宜，照第2a步繼續(xù)進(jìn)行。第2a步假設(shè)需用等度別離，但第1步中的條件不行，那么有2種選擇：改變pH和╱或參加離子對(duì)試劑。用IPC需選用適宜的試劑；見圖7-13和有關(guān)的討論。第3步調(diào)整%B以到達(dá)0.5<k<20；微調(diào)%B以改善選擇性和別離度。第4步改用乙腈為有機(jī)溶劑，調(diào)整%B以進(jìn)一步改善選擇性和別離度。第5和5a步改變pH或離子對(duì)試劑濃度以使峰間距最正確。假設(shè)各樣品峰的酸堿性，改變pH或試劑濃度通?？梢灶A(yù)測(cè)到峰間距的改變〔如圖7-8所示〕；另一種方法是通過圖7-14的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，開掘較大范圍的pH值和試劑濃度。第6~8步IPC方法建立中的其它步驟與RPC相同。見圖7-7和7-3-4節(jié)該規(guī)劃的討論。IPC中柱類型的改變〔第7步〕可能不如在RPC中有用，這是由于吸附在固定相上的離子對(duì)試劑將固定相與樣品分子“隔開〞的緣故〔見圖7-9和有關(guān)的討論〕。7-5離子交換色譜自1968年高效液相色譜儀商品化以來，離子交換色譜〔IEC〕就是一種重要的HPLC方法。然而在以后的10年中與其它HPLC方法相比，它的別離應(yīng)用漸漸減少。目前，只在某些