聚合物載藥納米膠束體外釋放度測試方法

2016-05-16第一版聚合物載藥納米膠束體外釋放度測試方法------透析法/離心法檢測聚合物載藥膠束體外釋放Methodofdrugreleaseinvitrofordrug-loadedpolymermicelle Dialysis/CentrifugationforDrug-ReleasemeasurementofPolymerMicellesinvitro前言本技術規(guī)范按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。為積極響應國務院《深化標準化工作改革方案》中大力培育發(fā)展團體標準、擴大標準有效供給的號召，同時也為了盡快將科技成果向標準轉化、推動技術進步，為建設新型標準體系貢獻力量，特制定本技術規(guī)范，以更好發(fā)揮標準化在服務支撐經濟社會發(fā)展中的基礎性、戰(zhàn)略性作用?，F(xiàn)廣泛征求相關單位和個人寶貴意見。本技術規(guī)范由中國科學院提出，由國家納米科學中心起草，旨在為聚合物載藥納米膠束體外釋放度測試方法提供技術指導。本技術規(guī)范主要起草人：梁興杰、吳雁、葛廣路、張東慧、李憲磊聚合物載藥納米膠束體外釋放度測試方法------透析法/離心法檢測聚合物載藥膠束體外釋放1范圍本標準規(guī)定了采用透析法和離心法測定高分子納米膠束體外釋放度的相關術語和定義、原理、儀器和試劑、方法及步驟、結果表示以及檢測報告。本標準適用于應用透析法或離心法對聚合物載藥納米膠束中藥物的體外釋放度進行測試和分析。2規(guī)范性引用文件下列文件為本文件所引用，對本文件的應用必不可缺。凡是注明日期的引用文件，則僅注明日期的版本適用于本文件。凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括最新的修改單）適用于本文件。《中華人民共和國藥典》2015版GBT50902-2013醫(yī)藥工程基本術語標準3術語和定義《中華人民共和國藥典》2015版、GBT50902-2013中界定的以及下列術語和定義適用于本文件。3.1釋放度drugrelease釋放度指藥物從緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑及透皮貼劑等在規(guī)定條件下釋放的速率和程度［1］。3.2體外藥物釋放度試驗experimentofdrugreleaseinvitro體外藥物釋放度試驗是在模擬體內消化道和血液等條件下（如溫度、介質的pH值、攪拌速率等），對制劑進行藥物釋放速率試驗，最后制訂出合理的體外藥物釋放度，以監(jiān)測產品的生產過程與對產品進行質量控制［1］。透析法dialysismethod透析法是利用小分子藥物在溶液中可通過半透膜，而大分子的聚合物載藥納米膠束不能通過半透膜的性質，達到分離的方法。3.4離心法centrifugationmethod利用物質的密度等方面的差異和旋轉所產生的離心力使顆粒或者溶質沉淀發(fā)生沉降而將其分離、濃縮、提純和鑒定的一種方法［2。］3.5蛋白質類藥物proteindrug蛋白質類藥物是指來源于動、植物和生物應用技術研究開發(fā)的具有一定生物活性，用于防治和診斷人類、動物和植物疾病的蛋白質產品。4釋放度測試方法—透析法4.1適用范圍負載常規(guī)親水或疏水藥物（如阿霉素、紫杉醇等非蛋白質類藥物）聚合物載藥納米膠束的體外釋放度測試一般采用透析法。4.2基本原理透析法是目前進行聚合物載藥納米膠束體外釋放度測定的常用方法。通常聚合物載藥納米膠束溶液裝在透析膜中，具有較高的藥物濃度或者滲透壓，透析膜外的釋放介質具有較低的藥物濃度或者滲透壓，透析膜的兩側存在滲透壓差，小分子藥物在膜兩側滲透壓差的驅動下，通過透析膜的孔徑進入到釋放介質中，從而使兩側的滲透壓差減小。從化學動力學的角度分析，該過程是一個自動且不可逆的過程。雖然大分子的聚合物納米膠束在膜兩側的滲透壓也存在差異，但是透析膜的孔徑（或是截留分子量）不允許納米膠束透過，因此只有從聚合物載藥納米膠束中釋放出來的小分子藥物才能通過透析膜進入到釋放介質中。4.3儀器及試劑4.3.1.恒溫振蕩培養(yǎng)箱包含有箱體、振蕩系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、控制系統(tǒng)（轉速和溫度）、照明系統(tǒng)、計時系統(tǒng)。4.3.2透析膜透析膜不能對藥物及納米膠束有吸附，同時不能影響藥物及納米膠束的活性［1］。產生透析膜截留分子量應大于釋放藥物的分子量而小于納米膠束的分子量。4?3?3高效液相色譜儀（HPLC）高效液相色譜儀一般用于檢測有紫外吸收的物質。系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等組成?？勺詣訉⒋郎y物質與溶劑及其它雜質分離開來并進行藥物濃度的測定。4?3?4熒光光譜儀用于測定有熒光藥物的濃度，如阿霉素。4.3.5電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）用于金屬元素順鉑等藥物濃度的測定。磷酸鹽緩沖液在實驗中起到釋放介質的作用，用脫氣的新鮮純化水進行配置，為避免保存時產生污染，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。表面活性劑提高疏水藥物在緩沖介質中的溶解性和穩(wěn)定性，保證釋放出的藥物能夠順利通過透析膜進入緩沖介質中。注：常用的表面活性劑有吐溫80、吐溫20、疊氮化鈉、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯蓖麻油等。實驗條件釋放溫度：根據模擬環(huán)境和用藥方式而定。緩釋、控釋、遲釋制劑模擬胃部和血液等體液環(huán)境，溫度應控制在37°C±0.5°C。但貼劑應在32°C±0.5°C模擬表皮溫度［1］。釋放介質pH:根據模擬環(huán)境而定，模擬胃液環(huán)境pH建議設置為1.2?7.6。模擬血液等正常體液環(huán)境pH建議設置為7.4,模擬腫瘤細胞外微環(huán)境pH設置范圍為6.5?7.2,模擬腫瘤細胞內環(huán)境pH設置范圍為4?6,其中內涵體pH值為5?6,溶酶體的pH值為4?5】3］。釋放介質體積：釋放介質的體積應符合漏槽條件［3］。漏槽狀態(tài)即藥物所處釋放介質的濃度遠小于其飽和濃度。釋放轉速：70rpm~180rpm亮度：對于光敏感藥物需要避光測定。取樣時間：原則上至少取三個時間點，第一個點為開始0.5~2h的取樣時間點，用于考察藥物是否有突釋現(xiàn)象，中間取樣點為了確定載藥系統(tǒng)的釋藥特性，最后一個時間點考察藥物釋放是否完全。且釋放度全過程不低于給藥時間且釋放藥物要達到藥物總量的90%以上［1］。在實際操作中，建議根據藥物的釋藥特性進行多個時間點的選擇。所選時間點必須能夠反映藥物的突釋、緩釋以及完全釋放的程度。取樣時間點越密集，越能反映釋藥過程。實驗方法和步驟配制釋放介質磷酸鹽緩沖液通常用作釋放介質。一般用購買的標準液加脫氣的新鮮去離子水稀釋配制，為防止保存過程中產生污染，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。安裝透析裝置將適量的藥物完全溶解在2mL?5mL去離子水中，制備成載藥納米粒子水分散體系。將載藥納米粒子水分散體系置于透析管或封端的透析膜內，透析管或封端的透析膜浸于裝有30mL?40mL的釋放介質的50mL離心管中。對于疏水藥物需要在釋放介質中加入0.02%?4%（w/v）的表面活性劑，如吐溫20,吐溫80,疊氮化鈉（NaN）,十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯蓖麻油。3藥物釋放將透析裝置垂直置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱內。培養(yǎng)箱參數(shù)（溫度、轉速及亮度）根據模擬環(huán)境要求進行相應的設置。在指定時間取0.5mL?3mL釋放介質進行濃度的測定，并補充相同體積、溫度和pH的釋放介質，以保證釋放介質的總體積保持不變。4.5.4藥物濃度測定根據藥物性質，采用相應檢測儀器對釋放藥物進行濃度檢測，釋放出的藥物濃度應位于檢測儀器的檢測限之內。對于有紫外吸收的藥物可采用紫外光譜儀或高效液相色譜儀(HPLC)進行濃度的檢測。為提高實驗精度，建議采用高效液相色譜儀(HPLC)進行藥物濃度的測定。對于有熒光的藥物可用熒光光譜儀進行藥物的定量測定。金屬元素順鉑等藥物濃度的測定一般采用電感耦合等離子體質譜即ICP-MS進行測定。4.5.5計算藥物累積釋放率藥物累積釋放量計算公式如下?2—ICt1心6口— 1 Er：藥物累計釋放量；Ve：PBS的置換體積；V：釋放介質總體積；C:0i第i次置換取樣時釋放液的濃度；m:納米粒子所載藥物總質量；n置換drugPBS的次數(shù)。重復實驗三次，測量結果取平均值，且要求相關性PV0.05。根據以上公式計算出每個取樣點的累積釋放藥物量。4.5.6繪制釋放曲線采用繪圖軟件繪制釋放曲線，縱坐標為藥物累積釋放百分率，橫坐標為取樣時間。5釋放度測試方法—離心法5.1適用范圍負載常規(guī)親疏水藥物和蛋白質類藥物聚合物載藥納米膠束的體外釋放度測試一般采用離心法。5.2基本原理離心法是利用不同物質間的密度、質量等的差異，用旋轉所產生的離心力使顆?；蛘呷苜|沉淀發(fā)生沉降而將其分離、濃縮、提純和鑒定的一種方法。負載蛋白質類藥物聚合物納米膠束在釋放介質中將藥物釋放到溶液中，聚合物納米膠束質量較大，而蛋白質類藥物質量較小，在旋轉所產生的離心力的作用下，質量較大的聚合物納米膠束沉降到溶液的底部，而相對質量較低的蛋白質類藥物以懸浮液的形式存在于溶液中，通過測量懸浮液中藥物的濃度和體積，便能得到藥物在此時間點的釋放情況。5.3儀器及試劑5.3.1恒溫振蕩培養(yǎng)箱包含有箱體、振蕩系統(tǒng)、加熱系統(tǒng)、控制系統(tǒng)（轉速和溫度）、照明系統(tǒng)、計時系統(tǒng)。5.3.2離心機包含離心系統(tǒng)和溫控系統(tǒng)。5?3?3高效液相色譜儀（HPLC）高效液相色譜儀一般用于檢測有紫外吸收的物質。系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等組成。可自動將待測物質與溶劑及其它雜質分離開來并進行藥物濃度的測定。5.3.4熒光光譜儀用于測定有熒光藥物的濃度，如阿霉素。BCA蛋白濃度測定試劑盒用于蛋白質類藥物濃度的測定。磷酸鹽緩沖液在實驗中起到釋放介質的作用，用脫氣的新鮮純化水進行配置，為避免保存時產生污染，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。表面活性劑提高疏水藥物在緩沖介質中的溶解性和穩(wěn)定性，保證釋放出的藥物能夠順利通過透析膜進入緩沖介質中。注：常用的表面活性劑有吐溫80、吐溫20、疊氮化鈉、十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯蓖麻油等。5.4實驗條件釋放溫度：根據模擬環(huán)境和用藥方式而定。緩釋、控釋、遲釋制劑模擬胃部和血液等體液環(huán)境，溫度應控制在37°C±0.5°C。但貼劑應在32°C±0.5°C模擬表皮溫度［1］。釋放介質pH:根據模擬環(huán)境而定，模擬胃液環(huán)境pH建議設置為1.2?7.6。模擬血液等正常體液環(huán)境pH建議設置為7.4,模擬腫瘤細胞外微環(huán)境pH設置范圍為6.5?7.2,模擬腫瘤細胞內環(huán)境pH設置范圍為4?6,其中內涵體pH值為5?6,溶酶體的pH值為4?5】3］。釋放介質體積：釋放介質的體積應符合漏槽條件［3］。漏槽狀態(tài)即藥物所處釋放介質的濃度遠小于其飽和濃度。釋放轉速：70rpm?180rpm離心轉速：8000rpm?14000rpm離心時間：5min?30min離心溫度：4°C或25C亮度：對于光敏感藥物需要避光測定。取樣時間：原則上至少取三個時間點，第一個點為開始0.5?2h的取樣時間點，用于考察藥物是否有突釋現(xiàn)象，中間取樣點為了確定載藥系統(tǒng)的釋藥特性，最后一個時間點考察藥物釋放是否完全。且釋放度全過程不低于給藥時間且釋放藥物要達到藥物總量的90%以上［1］。在實際操作中，建議根據藥物的釋藥特性進行多個時間點的選擇。所選時間點必須能夠反映藥物的突釋、緩釋以及完全釋放的程度。取樣時間點越密集，越能反映釋藥過程。5.5實驗方法和步驟配制釋放介質-磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖液通常用作釋放介質。一般用購買的標準液加脫氣的新鮮去離子水稀釋配制，為防止保存過程中產生污染，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。藥物釋放將適量的聚合物載藥納米膠束溶于5mL?30mL的釋放介質中。對于疏水藥物需要在釋放介質中加入0.02%?4%(w/v)的表面活性劑，如吐溫20，吐溫80,疊氮化鈉NaN,十二烷基硫酸鈉、聚氧乙烯蓖麻油。置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行3藥物釋放。培養(yǎng)箱參數(shù)(溫度、轉速及亮度)根據模擬環(huán)境要求進行相應的設置。在特定時間點取0?5mL?3mL樣品于離心管中，并補加相同體積、溫度和pH值的釋放介質，保證釋放介質的條件保持不變離心將離心管置于離心機上，離心機轉速設置為8000rpm?14000rpm，離心機時間設置為5min?30min，離心機溫度設置為4°C或25°C。離心得到的上清液用于下一步的濃度檢測。5.5.4藥物濃度測定根據藥物性質，采用相應檢測儀器對釋放藥物進行濃度檢測，釋放出的藥物濃度應位于檢測儀器的檢測限之內。對于有紫外吸收的藥物可采用紫外光譜儀或高效液相色譜儀（HPLC）進行濃度的檢測。為提高實驗精度，建議采用高效液相色譜儀（HPLC）進行藥物濃度的測定。對于有熒光的藥物可用熒光光譜儀進行藥物的定量測定。金屬元素順鉑等藥物濃度的測定一般采用電感耦合等離子體質譜即ICP-MS進行測定。對于沒有紫外吸收和熒光的蛋白質類藥物建議利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定。5.5.5計算藥物累積釋放率藥物累積釋放量計算公式如下mEr=■fJx100%mdrugEr：藥物累計釋放量；m:納米粒子釋放出的藥物質量；m:納米粒子free drug所載藥物總質量。重復實驗三次，測量結果取平均值，且要求相關性PV0.05。根據以上公式計算出每個取樣點的累積釋放藥物量。5.5.6繪制釋放曲線采用繪圖軟件繪制釋放曲線，縱坐標為藥物累積釋放百分率，橫坐標為取樣時間。6結果表示采取釋放曲線和語言描述相結合的方式。7檢測結果報告檢測報告應包括以下信息：檢測報告編號；送檢樣品名稱、送檢日期和送檢目的；送樣人姓名，單位，地址，及聯(lián)系方式；儀器型號、測試方法及條件(轉速、溫度、pH)；檢測結果和必要的說明(附原始數(shù)據和釋放曲線)；測試過程中出現(xiàn)的異常現(xiàn)象；本標準中未明確的操作步驟和注意事項，可能對測試結果產生的影響；檢測報告負責人簽名；檢測報告的日期；實驗室名稱及地址。8備注透析法和離心法測定聚合物載藥膠束釋放度實驗模擬的是體內腸道或者血液的環(huán)境，其溫度、pH以及攪拌速度都接近于體內腸道或者血液的環(huán)境，從而使體外釋放試驗的結果更接近于體內釋放的結果。但是由于體內環(huán)境和成分的復雜性，目前常用的釋放模型不能對體內環(huán)境和成分進行百分之百的模擬，因此不能機械地將體外釋放試驗的結果和藥物在體內的緩控釋情況等同看待。附錄A（資料性附錄）A.1透析法測定載紫杉醇（疏水藥物）聚合物納米膠束釋放度[4]實驗條件：釋放溫度：37°C 釋放轉速：100rpm亮度：無需避光釋放介質pH：7.4（模擬體液pH）、5.0（模擬腫瘤細胞內pH）實驗過程：配置pH值5.0和7.4的磷酸鹽緩沖液各40mL置于50m離心管中，向離心管中加入0.1%（w/v啲吐溫80。將上述離心管置于37C、100rpm的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中。待緩沖液溫度穩(wěn)定之后，將裝有2.0mL、1.0mg/mL聚合物載藥納米膠束的透析管（截留分子量3500Da）放入50mL離心管中。在設定時間點分別取3.0mL離心管中的釋放介質，同時補加相同體積、溫度和pH的緩沖液。每個試樣重復三次。待取樣完成后利用高效液相色譜儀（HPLC）進行濃度的測定。然后根據釋放度公式計算各個時間點的釋放度，且要求相關性P<0.05。最后用繪圖軟件繪制累積釋放曲線圖。-6Xld-6XldFig.1.pHdependentPTXreleasefromthePPBVmicellesatdifferentpHvaluesin

PBSBufferA.2離心法測定載牛血清白蛋白（BSA）聚合物納米膠束釋放度⑸實驗條件：釋放溫度：37°C 離心溫度：25°C亮度：無需避光釋放轉速：120rpm離心轉速：13000rpm離心時間：10min釋放介質pH：7.4（模擬體液pH）實驗過程：將一定量的負載牛血清白蛋白（BSA）的聚合物載藥納米膠束加入到裝有8mL、pH=7.4磷酸鹽緩沖液的離心管中。然后將該離心管置于120rpm、37C恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進行藥物的釋放。在特定時間點取出1mL樣品，同時補加1mL相同溫度和pH值的磷酸鹽緩沖液。將取出的樣品進行離心，離心機參數(shù)設置為25C13000rpm、10min,離心完成后取上清液進行濃度測定。每個試樣重復三次。待取樣完成后，利用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上清液的濃度，從而計算出該時間點的藥物累積釋放度，且要求相關性P<0.05。最后用繪圖軟件繪