枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化

枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化LIUWenlong;WANGXingji;WANGKefen;WANGShuai【摘要】選用玉米粉、豆餅粉、KH2PO4及Na2HPO4為基礎(chǔ)配方，通過單因素實驗對枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化.確定了優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基為：20g-L-1甘油,30g-L-1豆餅粉,2mmol-L-1氯化鈣,0.3g-L-1KH2PO4,4g-L-1Na2HPO4;優(yōu)化的發(fā)酵條件為:溫度30°C,接種量5%.調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)基pH值7.0控制發(fā)酵，發(fā)酵周期40h,最終的酶活達(dá)到7344U-mL-1.進(jìn)行甘油補料流加實驗，培養(yǎng)溫度30C,發(fā)酵過程控制pH值7.0,調(diào)整轉(zhuǎn)速和風(fēng)量控制溶氧30%~35%,接入5%種子，經(jīng)過40h發(fā)酵,最終酶活達(dá)到10654U-mL-1,較未補料提高了45%.【期刊名稱】《化學(xué)與生物工程》【年(卷)，期】2019(036)001【總頁數(shù)】6頁(P47-52)【關(guān)鍵詞】枯草芽孢桿菌;中性蛋白酶;液體發(fā)酵;酶活性【作者】LIUWenlong;WANGXingji;WANGKefen;WANGShuai【作者單位】;;;【正文語種】中文蛋白酶是一類在生理及商業(yè)上都有非常重要地位的水解酶類，能催化肽鍵水解成氨基酸或短肽，其銷售量約占酶制劑市場的一半以上［1］。按蛋白酶作用的最適pH值可分為酸性、中性和堿性蛋白酶。中性蛋白酶是最早被應(yīng)用的蛋白酶之一，能在中性pH值范圍內(nèi)將大分子蛋白質(zhì)水解成相對分子量在5000以下的多肽［2］，普遍存在于細(xì)菌和真菌中，在pH值7~8時活性最大［3］。目前，中性蛋白酶高產(chǎn)菌株主要通過自然界篩選、人工誘變和分子生物學(xué)改造獲得［4-8］。近年來，國外研究側(cè)重于基因結(jié)構(gòu)特性研究、定點突變改變蛋白酶的特性、穩(wěn)定性的提高、與醫(yī)學(xué)相關(guān)的蛋白酶的分離鑒定、蛋白酶的應(yīng)用等［9-12］。市場銷售的中性蛋白酶的主要生產(chǎn)菌種包括細(xì)菌類的枯草芽孢桿菌、耐熱解蛋白芽孢桿菌，真菌類的寄生曲霉菌、灰色鏈霉菌、棲土曲霉菌、米曲霉菌等［13］,其中枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶是市場銷售最廣泛的中性蛋白酶。枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶具有發(fā)酵周期短、安全性好、酶活高等特點?？莶菅挎邨U菌產(chǎn)中性蛋白酶的酶分子中的2~3個酪氨酸和1個組氨酸殘基同鋅原子一起表現(xiàn)酶的活性，同時1個色氨酸和幾個鈣原子在維持酶的構(gòu)象上有重要作用。中性蛋白酶被廣泛用于食品和烹飪行業(yè)［14］、絲綢、飼料工業(yè)［15］。工業(yè)化生產(chǎn)的中性蛋白酶主要由微生物經(jīng)液體深層發(fā)酵和固體發(fā)酵制得，其中液體深層發(fā)酵因操作條件可控而應(yīng)用較廣泛。在液體發(fā)酵過程中蛋白酶直接由細(xì)胞產(chǎn)生分泌到培養(yǎng)液中，屬于胞外酶。因發(fā)酵液中含有多種物質(zhì)，為得到高酶活的中性蛋白酶及降低生產(chǎn)成本，不僅需要提高發(fā)酵水平，而且還要對發(fā)酵液進(jìn)行提取分離［16］。產(chǎn)蛋白酶菌株的培養(yǎng)基主要成分包括碳源、氮源、金屬離子等［17-18］。細(xì)菌產(chǎn)中性蛋白酶按其催化機制屬于金屬蛋白酶，因此無機鹽的濃度對產(chǎn)酶會有很大影響［19］。結(jié)合目前行業(yè)的發(fā)展?fàn)顩r，作者采用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)中性蛋白酶，對其發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高該菌株的發(fā)酵水平，降低生產(chǎn)成本，為后續(xù)試驗及擴大化生產(chǎn)提供幫助。1實驗1.1菌種與培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌：實驗室篩選保藏菌種。斜面培養(yǎng)基?L-1):牛肉膏5，胰蛋白腺10，氯化鈉10，瓊脂18,pH值7.5。種子培養(yǎng)基(g-L-1):酵母粉5，蛋白腺5，氯化鈉10，pH值7.5。發(fā)酵培養(yǎng)基(g-L-1):玉米粉30，豆餅粉30,KH2PO40.3,Na2HPO44,pH值自然。固體平板培養(yǎng)基?L-1):脫脂奶粉14,酵母粉1.5，瓊脂18。1.2培養(yǎng)方法將種子接于斜面上，30°C下培養(yǎng)48h；挑取斜面活化菌體到25mL種子培養(yǎng)基中，30C、220r-min-1培養(yǎng)10h,以3%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL/250mL的種子培養(yǎng)基中，30C下發(fā)酵培養(yǎng)；以5%的接種量接到含18L發(fā)酵培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐中，30C下培養(yǎng)。1.3中性蛋白酶酶活的測定按照GB/T23527-2009[20]采用福林酚法測定。酶活力單位定義：1mL液體酶在40C、pH值7.5的條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生項g酪氨酸，即為1個酶活力單位，以U-mL-1表示。1.4菌體生物量的測定取發(fā)酵液1mL，采用梯度稀釋的方法，在固體平板上30C下培養(yǎng)，進(jìn)行3組平行實驗，菌落計數(shù)。2結(jié)果與討論2.1發(fā)酵培養(yǎng)基主要成分的優(yōu)化培養(yǎng)基對微生物生長發(fā)育、物質(zhì)代謝、發(fā)酵產(chǎn)物的積累都有很大的影響。另外，在發(fā)酵工業(yè)中，培養(yǎng)基需求量很大，配制培養(yǎng)基應(yīng)盡量利用廉價易得的原料，以降低成本。本實驗對枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分及配比進(jìn)行優(yōu)化。2.1.1碳源對產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基中的玉米粉分別用葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉、乳糖、甘油、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉替換，其它成分不變，于30OC、220r-min-1培養(yǎng)，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖1所示。圖1碳源對中性蛋白酶酶活的影響Fig.1Effectofsolecarbonsourceonneutralproteaseactivity由圖1可知，碳源對酶活的影響較大，其中以甘油為碳源時，酶活最高，為3214U-mL-1，其次為玉米粉、蔗糖、馬鈴薯淀粉、乳糖、葡萄糖、紅薯淀粉、玉米淀粉。以葡萄糖為碳源時，酶活較低，因為葡萄糖作為快速利用碳源，在培養(yǎng)基中含量過多會對產(chǎn)酶有抑制作用。以甘油、蔗糖為碳源時，酶活相對較高，表明微生物利用這兩種碳源較好，反饋抑制較小。玉米粉也可促進(jìn)菌體產(chǎn)酶，原因是玉米粉含有多種微生物需要的營養(yǎng)成分，能促進(jìn)中性蛋白酶的生成。因此，選擇甘油為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源。2.1.2甘油濃度對產(chǎn)酶的影響以甘油為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源，將甘油濃度按梯度設(shè)為10g?L-1、20g?L-1、30g?L-1、40g?L-1、50g?L-1,其它成分不變，進(jìn)行發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，以相對酶活來表示酶活大小，最大酶活設(shè)為100%，結(jié)果如圖2所示。圖2甘油濃度對中性蛋白酶酶活的影響Fig.2Effectofglycerinconcentrationonneutralproteaseactivity由圖2可知，甘油濃度為20g-L-1時，酶活達(dá)到最高，較濃度為30g-L-1高了5%，甘油濃度過低或過高都會對產(chǎn)酶有很大影響。微生物代謝需要足夠的碳源，其濃度較低導(dǎo)致微生物利用不充分，影響生長代謝，進(jìn)而影響產(chǎn)酶；濃度過高則提高了微生物外部環(huán)境的滲透壓，細(xì)胞脫水，導(dǎo)致細(xì)胞受損或死亡，形成代謝阻遏，抑制產(chǎn)酶。因此，選擇優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源甘油濃度為20g-L-1o2.1.3氮源對產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基中的豆餅粉分別用硝酸鈉、大豆蛋白腺、硫酸銨、蛋白腺、胰蛋白腺、酵母粉、玉米漿替換，其它成分保持不變，于30OC、220r-min-1培養(yǎng)，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖3所示。圖3氮源對中性蛋白酶酶活的影響Fig.3Effectofsolenitrogensourceonneutralproteaseactivity由圖3可知，無機氮源與有機氮源對酶活影響區(qū)別很大，無機氮源硝酸鈉、硫酸銨對酶活影響較小，酶活處于較低水平；有機氮源對酶活影響較大，影響大小依次為：豆餅粉〉酵母粉〉大豆蛋白腺〉蛋白腺〉胰蛋白腺〉玉米漿。豆餅粉作為氮源時，酶活達(dá)到最高，為3127U-mL-1。因此，選擇豆餅粉為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源。2.1.4豆餅粉濃度對產(chǎn)酶的影響選取豆餅粉為發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源，將豆餅粉濃度按梯度設(shè)為10g?L-1、20g?L-1、30g?L-1、40g?L-1、50g?L-1,其它成分不變，進(jìn)行發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，以相對酶活來表示酶活大小，最大酶活設(shè)為100%，結(jié)果如圖4所示。圖4豆餅粉濃度對中性蛋白酶酶活的影響Fig.4Effectofsoybeancakepowderconcentrationonneutralproteaseactivity由圖4可知，豆餅粉濃度為30g-L-1時，酶活最高，表明此濃度利于產(chǎn)酶。因此，選擇優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豆餅粉濃度為30g-L-1o2.1.5無機鹽對產(chǎn)酶的影響在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基碳源、氮源的基礎(chǔ)上添加無機鹽進(jìn)行發(fā)酵實驗，分別添加1mmol-L-1的硫酸鋅、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈣、氯化鈉、硫酸亞鐵于優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖5所示。圖5無機鹽對中性蛋白酶酶活的影響Fig.5Effectofinorganicsaltonneutralproteaseactivity由圖5可知，對酶活影響最大的是氯化鈣，其次是硫酸鎂，其它無機鹽(金屬離子)對產(chǎn)酶都有不同程度的抑制作用。可能是因為，豆餅粉中已含有微生物生長代謝所需要的少量無機鹽離子，鹽離子過多會抑制菌體代謝。采用不同濃度的氯化鈣及硫酸鎂進(jìn)行發(fā)酵實驗，考察其對酶活的影響，用相對酶活表示不同濃度鹽離子(Ca2+、Mg2+)對酶活的作用大小，對照為未添加這2種離子的發(fā)酵培養(yǎng)基，結(jié)果如圖6所示。圖6不同濃度Ca2+和Mg2+對中性蛋白酶酶活的影響Fig.6EffectofdifferentconcentrationsofCa2+andMg2+onneutralproteaseactivity由圖6可知，2mmol-L-1的Ca2+和Mg2+對酶活的影響較大，均高于對照組，表明添加一定量的Ca2+或Mg2+對產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用，Ca2+的促進(jìn)作用更顯著些。因此，確定在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2mmol-L-1Ca2+o2.1.6磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響磷元素是菌體生長繁殖所需的重要元素，并且發(fā)酵培養(yǎng)基中的磷酸鹽對pH值起到緩沖作用，避免pH值短時間內(nèi)迅速改變。為考察優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中添加磷酸鹽對產(chǎn)酶的影響，進(jìn)行兩組實驗，一組含有0.3g-L-1KH2PO4、4g-L-1Na2HPO4,另一組不含磷酸鹽，測定酶活及菌體生物量，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，菌體生物量與酶活的變化趨勢基本相同，菌體生物量的增加影響酶活的升高。表明添加磷酸鹽可以促進(jìn)菌體的生長，有效提高酶活。因此，確定在優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基中添加KH2PO4和Na2HPO4。2.2培養(yǎng)條件的優(yōu)化2.2.1培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響培養(yǎng)溫度在發(fā)酵過程中起著非常關(guān)鍵的作用，影響著微生物的整個代謝過程，分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為28°C、30°C、32°C、35°C、37°C進(jìn)行發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖8所示。圖7磷酸鹽對中性蛋白酶酶活的影響Fig.7Effectofphosphateonneutralproteaseactivity圖8培養(yǎng)溫度對中性蛋白酶酶活的影響Fig.8Effectofculturetemperatureonneutralproteaseactivity由圖8可知，培養(yǎng)溫度為30°C時，酶活最高；低于30°C時酶活較低，高于30C時酶活呈梯度下降。這是因為，當(dāng)培養(yǎng)溫度過低時，菌體代謝較慢，產(chǎn)酶量也較少；當(dāng)培養(yǎng)溫度過高時，菌體代謝所需酶的活性降低，導(dǎo)致發(fā)酵減緩，從而影響酶活。因此，選擇培養(yǎng)溫度為30C。2.2.2接種量對產(chǎn)酶的影響接種量也會影響菌體代謝。分別設(shè)定接種量為2%、3%、5%、7%、9%進(jìn)行發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵上清中性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖9所示。圖9接種量對中性蛋白酶酶活的影響Fig.9Effectofinoculumonneutralproteaseactivity由圖9可知，接種量為5%時，酶活最高。接種量小，菌體生長緩慢，酶活較低；接種量較大，前期菌體生長迅速，營養(yǎng)物質(zhì)迅速消耗，并產(chǎn)生大量代謝廢物及有毒物質(zhì)，抑制中后期菌體生長，導(dǎo)致酶活降低。因此，選擇接種量為5%。2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化2.3.1發(fā)酵罐產(chǎn)酶pH值的優(yōu)化采用30L發(fā)酵罐對優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行驗證實驗，裝液量18「轉(zhuǎn)速300r-min-1,通氣量為2vvm，固定罐壓。pH值對菌體發(fā)酵培養(yǎng)及產(chǎn)酶有至關(guān)重要的影響，通過補加磷酸控制發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值，根據(jù)菌體特性和產(chǎn)酶條件，分別設(shè)置pH值為7.0、7.5及pH值自然進(jìn)行發(fā)酵實驗，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活，結(jié)果如圖10所示。圖10發(fā)酵培養(yǎng)基pH值對中性蛋白酶酶活的影響Fig.10EffectofpHvalueoffermentationmediumonneutralproteaseactivity由圖10可知，發(fā)酵過程中控制pH值時，前24h中性蛋白酶酶活隨著發(fā)酵時間的延長不斷上升，而后呈下降趨勢；控制pH值為7.0時，酶活在24h達(dá)到最高，為7344U-mL-1;pH值7.5的酶活變化趨勢與pH值7.0相同。發(fā)酵過程中不控制pH值時，酶活持續(xù)處在較低水平，發(fā)酵21h酶活達(dá)到最高，而后酶活降低并趨于平穩(wěn)。因此，在后續(xù)補料過程中控制pH值為7.0。2.3.2發(fā)酵罐補料產(chǎn)酶的優(yōu)化碳源在菌體發(fā)酵過程中起著至關(guān)重要的作用，因此在發(fā)酵罐培養(yǎng)過程中不斷流加碳源促進(jìn)菌體生長。發(fā)酵過程控制pH值為7.0，在發(fā)酵15h時流加甘油進(jìn)行補料實驗，發(fā)酵過程通過調(diào)整轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧30%~35%，測定發(fā)酵液上清中性蛋白酶酶活及菌體生物量，結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，在10-27h菌體處于對數(shù)增長期，菌體生物量急速增加，酶活在此期間也快速升高；27h時菌體生物量達(dá)到最多，后緩慢減少；酶活在30h時達(dá)到最高，為10654U-mL-1，較未補加甘油提高了45%，表明流加甘油對菌體產(chǎn)酶有非常大的促進(jìn)作用。圖11補料對產(chǎn)酶的影響Fig.11Effectoffed-batchonproductionofneutralprotease2.4討論本研究采用單因素實驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，但是未能細(xì)化培養(yǎng)基的組成，也未研究表面活性劑等因素對酶活的影響，這樣會對結(jié)果有一定影響；在補料過程中僅補加單—碳源，營養(yǎng)成分較單一，可能對產(chǎn)酶量的提高相對較低，后續(xù)可以考慮配合其它營養(yǎng)進(jìn)行補料實驗，提高產(chǎn)酶量?？莶菅挎邨U菌在代謝過程中會分泌多種酶，產(chǎn)生酶系的種類與產(chǎn)酶量有很大的關(guān)系，因此在應(yīng)用于生產(chǎn)的同時要明確酶之間的相互影響，確定最佳的發(fā)酵條件，保證質(zhì)量。在此基礎(chǔ)上可對產(chǎn)酶菌株進(jìn)行誘變處理，進(jìn)一步提高酶活。3結(jié)論以枯草芽孢桿菌為出發(fā)菌株，用低成本的農(nóng)副產(chǎn)品及無機鹽為主要原料進(jìn)行了液體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的優(yōu)化實驗。選用玉米粉、豆餅粉為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源，確定了枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基:20g-L-1甘油，30g-L-1豆餅粉，2mmol-L-1氯化鈣，0.3g?L-1KH2PO4,4g?L-1Na2HPO4。通過調(diào)控發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值控制發(fā)酵，結(jié)果表明，pH值為7.0時酶活更高，發(fā)酵24h酶活達(dá)到7344U?mL-1。進(jìn)行流加甘油實驗，培養(yǎng)溫度30°C，控制pH值7.0，調(diào)整轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量控制溶氧30%~35%，接種量5%,經(jīng)過30h發(fā)酵，酶活達(dá)到10654U-mL-1，較未補料提高了45%。參考文獻(xiàn)：【相關(guān)文獻(xiàn)】RAVIKUMARG,GOMATHID,KALAISELVIM,etal.AproteasefromthemedicinalmushroomPleurotussajor-cajuproduction,purificationandpartialcharacterization[J].TropicalBiomedicine,2012,2(1):S411-S417.姜錫瑞，段剛，周紅偉.酶制劑應(yīng)用技術(shù)問答[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2008:45-70.由德林.酶工程原理[M].北京：科學(xué)出版社，2011:40-47.劉東旺.芽孢桿菌N19中性蛋白酶發(fā)酵條件及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.LIUDW.FermentationconditionsandcharacteristicsofneutralproteasefromBacillusN19[D].Baoding:HebeiAgriculturalUniversity,2008.趙叢，張敏，王建玲，等.N+離子注入誘變選育中性蛋白酶高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件的研究[J]工業(yè)微生物，2008,38(3):12-16.ZHAOC,ZHANGM,WANGJL,etal.BreedingofneutralproteaseproducingstrainandfermentationconditionsbyN+ionimplantationmutagenesis[J].IndustrialMicrobiology,2008，38(3):12-16.許波，黃遵錫，陳金全，等枯草芽孢桿菌AS1.398中性蛋白酶基因的克隆及其在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J].云南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2005，25(3):51-56.XUB，HUANGZX,CHENJQ,etal.CloningofBacillussubtilisAS1.398neutralproteinasegeneanditshighexpressioninPichiapastoris[J].JournalofYunnanNormalUniversity(NaturalSciencesEdition),2005,25(3):51-56.WANGLF,RODNEYJD.ExpressionofBacillussubtilisneutralproteasegene(nprE)inSaccharomycescerevisiae[J].JournalofGeneralMicrobiology,1993(139):343-347.張敏，趙叢，路福平，等.中性蛋白酶基因在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)條件的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007,33(10):31-34.ZHANGM,ZHAOC,LUFP,etal.ResearchonexpressionconditionofneutralproteaseintheE.coli[J].FoodandFermentationIndustries,2007,33(10):31-34.KATZME,MASOUMIA,BURROWSSR,etal.TheAspergillusnidulansxprFgeneencodesahexokinase-likeproteininvolvedintheregulationofextracellularproteases[J].Genetics,2000,156(4):1559-1571.MANSFELDJ,PETERMANNLE,DURRSCHMIDTP,etal.ThepropeptideisnotrequiredtoproducecatalyticallyactiveneutralproteasefromBacillusstearothermophilus[J].ProteinExpressionandPurification,2005,39:219-228.YATSUDAAP,BAKKERN,KRIJGSVELDJ,etal.Identificationofsecrete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