大豆皮中過(guò)氧化物酶的提取

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)楚天學(xué)院本科畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）PAGE5目錄摘要 2關(guān)鍵詞 2Abstract 3Keywords 3前言 41材料與方法 51.1試驗(yàn)材料 51.1.1主要儀器及耗材 51.1.2主要試劑 51.1.3原材料 51.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容 51.2.1過(guò)氧化物酶的提取工藝流程 51.2.2酶活測(cè)定 51.2.3放置時(shí)間對(duì)酶活影響 61.2.4單因素試驗(yàn) 61.2.5正交試驗(yàn) 72結(jié)果與分析 72.1酶活測(cè)定 72.2放置時(shí)間對(duì)酶活影響 92.3 單因素試驗(yàn) 92.3.1液料比對(duì)酶活的影響 92.3.2提取時(shí)間對(duì)酶活的影響 102.3.3提取液濃度對(duì)酶活的影響 112.3.4提取溫度對(duì)酶活的影響 112.3.5提取次數(shù)對(duì)酶活的影響 123討論 143.1 關(guān)于酶活測(cè)定方法的思考 143.2 關(guān)于酶液稀釋方法的思考 143.3 關(guān)于單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化的思考 143.4 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 153.5 本實(shí)驗(yàn)的存在的問題及改進(jìn) 15參考文獻(xiàn) 15致謝 16大豆皮中過(guò)氧化物酶的提取字?jǐn)?shù)不足1萬(wàn)，還應(yīng)擴(kuò)展前言，實(shí)驗(yàn)方法部分要詳盡，讓沒做過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的也知道怎么做。結(jié)果與分析部分應(yīng)盡可能結(jié)合文獻(xiàn)，印證自己的觀點(diǎn)。字?jǐn)?shù)不足1萬(wàn)，還應(yīng)擴(kuò)展前言，實(shí)驗(yàn)方法部分要詳盡，讓沒做過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的也知道怎么做。結(jié)果與分析部分應(yīng)盡可能結(jié)合文獻(xiàn)，印證自己的觀點(diǎn)。摘要過(guò)氧化物酶[Peroxidase,POD，ECl.11.1.7(x)]是一類以血紅素為輔基的酶，在生物中廣泛存在，具有多種不同的生物功能，主要催化H2O2和有機(jī)過(guò)氧化物對(duì)多種有機(jī)物和無(wú)機(jī)物的氧化作用。它在蛋白質(zhì)、多肽、激素、病毒、寄生蟲、生物降解及神經(jīng)系統(tǒng)等方面都有應(yīng)用，具有特異性強(qiáng)，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。描述性的話放在前言中，摘要只寫論文中的核心內(nèi)容，就算有描述的話也應(yīng)盡量簡(jiǎn)潔。本課題以大豆皮為原料，對(duì)大豆皮中提取過(guò)氧化物酶的工藝進(jìn)行研究。通過(guò)單因素試驗(yàn)考察不同液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、提取液體積等對(duì)酶活的影響，并選取單因素試驗(yàn)中影響最明顯的3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果顯示，液料比、提取時(shí)間、提取溫度這三個(gè)因素對(duì)提取效果明顯。然后對(duì)此三因素進(jìn)行正交試驗(yàn)結(jié)果顯示：液料比20ml/g，提取時(shí)間5h，提取溫度40℃下，提取效果很好。雖然正交驗(yàn)證試驗(yàn)不是最好的一組，但考慮到誤差存在，可視為最適組合。描述性的話放在前言中，摘要只寫論文中的核心內(nèi)容，就算有描述的話也應(yīng)盡量簡(jiǎn)潔。關(guān)鍵詞大豆皮，過(guò)氧化物酶，提取Table1-1PBSpreparationxyPHxyPH6.58.010.012.315.018.522.526.531.537.543.549.093.592.090.087.785.081.577.573.568.562.556.551.05.75.85.96.06.16.26.36.46.56.66.76.855.061.067.072.077.081.084.087.089.591.593.094.745.039.033.028.023.019.016.013.010.58.57.05.36.97.07.17.27.37.47.57.67.77.87.98.0其余不同濃度磷酸緩沖液（PBS）皆可由0.2mol/LPBS稀釋至需要濃度。1.2.2.3測(cè)定方法：首先先將提取的酶液稀釋到合適的倍數(shù)，之后取兩支干凈的試管，加入反應(yīng)混合液（PH7.00.02mol/LPBS緩沖液，愈創(chuàng)木酚，過(guò)氧化氫），配方(見表1-2)：表1-2反應(yīng)物混合表Table1-2Thereactionmixture編號(hào)磷酸緩沖液(ml)2％過(guò)氧化氫(ml)4%愈創(chuàng)木酚溶液(ml)蒸餾水/酶液(ml)OD470nmCK2.91.01.00.1調(diào)零測(cè)定管2.91.01.00.1？加入反應(yīng)液后，先將試管置于15℃水浴鍋中預(yù)熱10min，用移液槍吸取酶液，加入到試管中計(jì)時(shí)，前45s在水浴鍋中預(yù)熱，之后將試管中液體轉(zhuǎn)移至比色皿中，立即放置于分光光度計(jì)中，記錄1min的吸光值，此后每半分鐘幾次一次吸光值，直到吸光值的變化減弱時(shí)即可結(jié)束實(shí)驗(yàn)。以吸光值(A)為縱坐標(biāo)，以時(shí)間（t）為橫坐標(biāo)，即可得到酶促反應(yīng)的速度曲線，根據(jù)公式可算得酶活。再根據(jù)換算可算出比活。以lg大豆皮提取的總酶活為指標(biāo)，根據(jù)換算可算出比活。，0.1為酶液的添加量。1.2.3放置時(shí)間對(duì)酶活影響取同一酶液，測(cè)定放置不同時(shí)間（放置的溫度條件？1h～6h）后的酶活，作出放置時(shí)間對(duì)酶活影響的曲線，確定單因素試驗(yàn)中的提取方案。放置的溫度條件？1.2.4單因素試驗(yàn)以lg大豆皮提取的總酶活為指標(biāo)，選定液料比、提取溫度、提取時(shí)間、提取液濃度、提取次數(shù)為考察因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。1.2.4.1液料比對(duì)酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入濃度為0.02mol/LPH7.0緩沖液，常溫下提取4h，平行一組，液料比分別為：10mL/g、15mL/g、20mL/g、25mL/g、30mL/g，提取完畢后轉(zhuǎn)移至離心管中離心10min后測(cè)定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.2提取時(shí)間對(duì)酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入濃度為0.04mol/LPH7.0的PBS緩沖液10mL，常溫下提取，平行一組，提取時(shí)間分別為3h、4h、5h、6h，7h，提取完畢后轉(zhuǎn)移至離心管中離心10min后測(cè)定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.3提取液濃度對(duì)酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入不同濃度濃度的PBS緩沖液10mL，常溫下，提取時(shí)間為5h，平行一組，緩沖液濃度：0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L，提取完畢后轉(zhuǎn)移至離心管中離心后10min測(cè)定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.4提取溫度對(duì)酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL三角瓶中，加入濃度為0.02mol/LPH7.0緩沖液10mL，封上封口膜，作好水位線，提取5h，平行一組，提取溫度為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，提取完畢后，加蒸餾水至水位線，再轉(zhuǎn)移至離心管中離心10min后測(cè)定其酶活，作圖研究曲線。1.2.4.5提取次數(shù)對(duì)酶活的影響準(zhǔn)確稱取粉碎后大豆皮0.5g于50mL離心管中，加入濃度為0.04mol/LPH7.0的PBS緩沖液10mL，常溫下提取5h，平行一組，采取不同的提取次數(shù)，如1、2、3、4、5等。提取完畢后離心10min測(cè)定其酶活，作圖研究曲線。1.2.5正交試驗(yàn)1.2.5.1正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)對(duì)本試驗(yàn)進(jìn)行分析，影響提取效果的因素很多，例如液料比、提取溫度、提取液濃度、提取時(shí)間、提取時(shí)間等。從中選取單因素試驗(yàn)中影響最明顯的3個(gè)因素，分別記為A、B、C，進(jìn)行三因素正交試驗(yàn)，每個(gè)因素均取三個(gè)水平。利用正交表L9(33)安排試驗(yàn)。為了減少誤差干擾，9組試驗(yàn)全部平行一組。其它條件為單因素最佳條件。1.2.5.2正交試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證本試驗(yàn)為3因素3水平的試驗(yàn)，按試驗(yàn)要求，須進(jìn)行33=27種組合的試驗(yàn)。而按L9(33)正交表按排試驗(yàn)，只需作9次試驗(yàn)。為了保證正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，從9個(gè)正交試驗(yàn)組合中，選取提取效果最好的試驗(yàn)（記為試驗(yàn)A）與正交試驗(yàn)所得出的理論最優(yōu)水平組合（記為試驗(yàn)B），然后將兩者的優(yōu)劣進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果是否可靠。2結(jié)果與分析2.1酶活測(cè)定酶液稀釋合適的倍數(shù)（25倍），加入反應(yīng)液中，置于吸光光度計(jì)中，記錄數(shù)據(jù)。表2-1吸光度隨時(shí)間的變化Table2-1Thechangeinabsorbancewithtime011.522.533.544.5500.070.1230.1820.2440.3070.3630.4150.4640.5085.566.577.588.599.5100.5490.5820.6140.6430.6660.6890.7070.7220.7330.743表中數(shù)值是什么值？應(yīng)有文字說(shuō)明。圖2-1-1酶促反應(yīng)的速度曲線表中數(shù)值是什么值？應(yīng)有文字說(shuō)明。Fig2-1-1Velocitycurveofenzymaticreaction圖不要邊框，坐標(biāo)單位要標(biāo)明圖不要邊框，坐標(biāo)單位要標(biāo)明圖2-1-1＊每分鐘下酶液顏色的變化Fig.2-1-1＊Eachminuteofenzymesolutioncolorchange根據(jù)酶催化反應(yīng)速度曲線，能夠真正代表酶活性大小的是線性期的酶促反應(yīng)速度，即酶促反應(yīng)初速度。酶活性測(cè)定時(shí)首先要確定線性期，在此期測(cè)定反應(yīng)速度才能準(zhǔn)確代表酶活性。酶剛開始參加反應(yīng)時(shí)，速度比較慢，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，速度加快，一般在底物濃度足夠的條件下，酶在催化反應(yīng)中會(huì)達(dá)到最大反應(yīng)速度，保持一定時(shí)間后，速度又會(huì)慢慢變小，其原因主要為底物減少和酶在反應(yīng)過(guò)程中自身失活，最大反應(yīng)速度持續(xù)時(shí)間的多少與酶本身的特性有關(guān)。由此可見，線性期應(yīng)選擇1.5min—3min，以此區(qū)域內(nèi)的點(diǎn)，作出直線，進(jìn)而求得斜率，就可以得到酶活及比活。圖2-1-2線性期的反應(yīng)曲線Fig2-1-2Thelinearphaseresponsecurve由圖可知，此圖線的R2為0.9998；當(dāng)R2>0.99時(shí)，則可以認(rèn)為這些點(diǎn)位于一條直線上。斜率為0.1228，進(jìn)而可以計(jì)算出酶活和比活。酶活=0.1228*25/0.01=307U比活=（307*10）/（0.5*0.1）=61400U/g2.2放置時(shí)間對(duì)酶活影響選取某次實(shí)驗(yàn)剩余酶液，稀釋合適的倍數(shù)（20倍），測(cè)定同一酶液在常溫下放置不同時(shí)間段下的酶活。表2-2放置時(shí)間對(duì)比活影響Table2-2Theplacetimeeffectonenzymeactivity建議增加相對(duì)活力，更直觀的表現(xiàn)出來(lái)時(shí)間（h）建議增加相對(duì)活力，更直觀的表現(xiàn)出來(lái)01246比活（U/g）4496042800400003520031040圖2-2放置時(shí)間對(duì)比活影響Fig2-2Theplacetimeeffectonenzymeactivity由圖可知。比活隨時(shí)間的變化大致成線性關(guān)系，且每小時(shí)下降2300左右各單位。因此，后續(xù)的提取工作，均需要錯(cuò)開時(shí)間段進(jìn)行提取，時(shí)間間隔為半小時(shí)。應(yīng)分析酶比活下降的原因，提取完成后酶活測(cè)定時(shí)間應(yīng)如何確定？應(yīng)分析酶比活下降的原因，提取完成后酶活測(cè)定時(shí)間應(yīng)如何確定？單因素試驗(yàn)2.3.1液料比對(duì)酶活的影響表2-3-1液料比對(duì)酶活的影響Table2-3-1Liquidratioofenzymeactivity液料比(mL/g)1015202530比活（U/g）5468459475652405476038115圖2-3-1液料比對(duì)酶活的影響Fig2-3-1Liquidratioofenzymeactivity所有的圖的標(biāo)題及英文對(duì)照都要放到圖下方所有的圖的標(biāo)題及英文對(duì)照都要放到圖下方由圖可知，隨著液料比的增大，提取酶的活力是增大的，當(dāng)液料比達(dá)到20mL/g時(shí)，酶的活力達(dá)到最大，隨著液料比的繼續(xù)增加，酶的活力反而有所下降。因此，采用液料比為20mL/g較適宜。2.3.2提取時(shí)間對(duì)酶活的影響表2-3-2提取時(shí)間對(duì)酶活的影響Table2-3-2Effectofextractiontimeonenzymeactivity時(shí)間（h）34567比活（U/g）5025056850580005380046950圖2-3-2提取時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig2-3-2Effectofextractiontimeonenzymeactivity由圖可知，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，酶的活力升高，5h時(shí)達(dá)到最大，5h后酶活反而下降。其原因可能是酶溶解的量隨著時(shí)間的增加而增加，5h時(shí)溶解量達(dá)到最大，隨著時(shí)間的繼續(xù)增加酶可能會(huì)失活或者分解，此時(shí)溶出量小于失活或分解的量，所以酶的活力下降。因此，采用提取時(shí)間5h較為適宜。2.3.3提取液濃度對(duì)酶活的影響表2-3-3提取液濃度對(duì)酶活的影響Table2-3-3Effectofextractconcentrationonenzymeactivity提取液濃度(mol/L)0.010.020.030.040.05比活(U/g)5560056850591006365057175圖2-3-3提取液濃度對(duì)酶活的影響Fig2-3-3Effectofextractconcentrationonenzymeactivity由圖可知，隨著提取液濃度的升高酶活力增加，在0.04mol/L時(shí)達(dá)到最大，隨著濃度的繼續(xù)升高，酶活力下降。因此，采用提取液濃度為0.04mol/L比較為適宜。2.3.4提取溫度對(duì)酶活的影響表2-3-4提取溫度對(duì)酶活的影響Table2-3-4Effectofextractiontemperatureonenzymeactivity溫度（℃）2030405060比活（U/g）6315076860642605505048150圖2-3-4提取溫度對(duì)酶活的影響Fig2-3-4Effectofextractiontemperatureonenzymeactivity由圖可知，隨著溫度的升高酶的活力不斷增加看不出來(lái)。當(dāng)提取溫度達(dá)到30℃以后，酶活力驟降。其原因可能是隨著溫度升高酶的溶解性升高，但是超過(guò)30℃以后，高溫使得酶失活，所以酶的活力驟降。因此，采用30℃為提取適宜溫度?？床怀鰜?lái)2.3.5提取次數(shù)對(duì)酶活的影響表2-3-5提取次數(shù)對(duì)酶活的影響Table2-3-5Effectofextractingtimesonenzymeactivity提取次數(shù)12345比活（U/g）447202968058722784956圖2-3-5提取次數(shù)對(duì)酶活的影響Fig2-3-5Effectofextractingtimesonenzymeactivity由圖可知，提取第2次后，還有3萬(wàn)左右的比活，到第3次卻只有6千比活，因此最適提取次數(shù)應(yīng)取2次；但是提取次數(shù)增加勢(shì)必會(huì)延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，增加實(shí)驗(yàn)量，在本實(shí)驗(yàn)中不適用，故提取次數(shù)仍用1次。正交試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果分析：本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯窟^(guò)氧化物酶的最適提取條件，以提高酶的提取率，是以酶活作為檢測(cè)指標(biāo)的。根據(jù)單因素結(jié)果可知，液料比、提取溫度、提取時(shí)間對(duì)提取效果影響較大，因此選用這3個(gè)因素進(jìn)行3因素3水平的正交試驗(yàn)，其他因素皆選用最適條件：提取液濃度（0.04mol/L）、提取次數(shù)（1次）。正交試驗(yàn)完畢后，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析，確定最優(yōu)組合。表2-4正交試驗(yàn)極差分析表Table2-4試驗(yàn)號(hào)溫度A(℃)液料比B（mL/g）提取時(shí)間C(h)比活123456789K1K2K3k1k2k3極差R主次順序優(yōu)水平優(yōu)組合1（20）1（20）1（20）2（30）2（30）2（30）3（40）3（40）3（40）1（15）2（20）3（25）1（15）2（20）3（25）1（15）2（20）3（25）1（4）2（5）3（6）2（5）3（6）1（4）3（6）1（4）2（5）49680535005100075276562805406369498640806350015418018561919707851393.361872.865692.714299.319445417386016856364818.057953.356187.58630.516782319227617677855940.864092.058926.08151.2A>B>CA3B1C2A3B1C2驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果：從9個(gè)正交試驗(yàn)組合中，選取提取效果最好的4號(hào)試驗(yàn)（試驗(yàn)A）的發(fā)酵條件與正交試驗(yàn)所得出的理論最優(yōu)水平組合（試驗(yàn)B）進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)比兩者的優(yōu)劣，驗(yàn)證正交試驗(yàn)結(jié)果是否可靠。驗(yàn)證試驗(yàn)：A3B1C240倍011.522.533.5400.0820.1360.1970.2570.3170.370.42比活72600A3B1C240倍011.522.533.5400.0820.1430.2080.2720.3320.3960.451比活75600相對(duì)誤差0.039比活（平均）74100通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)B略小于實(shí)驗(yàn)A,考慮到正交試驗(yàn)有一定的遺漏性以及誤差的存在（實(shí)驗(yàn)誤差小于10%，皆可認(rèn)為是合理的，數(shù)據(jù)直接取平均值），可以認(rèn)為正交試驗(yàn)結(jié)果基本是可靠。因此最適組合應(yīng)為：提取溫度40℃，液料比15mL/g數(shù)值和單位建應(yīng)空格，“℃”和“%”數(shù)值和單位建應(yīng)空格，“℃”和“%”除外3討論關(guān)于酶活測(cè)定方法的思考酶活的測(cè)定方法有很多，首行縮進(jìn)常見的有比色法，還原糖法，免疫學(xué)法，比濁法等。本實(shí)驗(yàn)是用愈創(chuàng)木酚與過(guò)氧化物酶的顯色反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的，屬于比色法。比色法又根據(jù)對(duì)酶促反應(yīng)時(shí)間的選擇不同分為固定時(shí)間法和連續(xù)監(jiān)測(cè)法。這兩種方法又有各自的適用條件以及優(yōu)缺點(diǎn)。固定時(shí)間法，操作簡(jiǎn)單但是難以確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期。連續(xù)監(jiān)測(cè)法，能動(dòng)態(tài)觀測(cè)酶促反應(yīng)進(jìn)程，可以明顯地找到反應(yīng)的線性期，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，標(biāo)本和試劑用量少，可在較短時(shí)間內(nèi)完成測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)初期，采用的是固定時(shí)間法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)一個(gè)嚴(yán)重的問題——反應(yīng)液的顏色變化無(wú)法停止，反應(yīng)開始時(shí)，反應(yīng)液顏色逐漸加深，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，反應(yīng)液顏色又在逐漸褪去，最終變?yōu)闊o(wú)色。經(jīng)過(guò)反復(fù)思考以及詢問導(dǎo)師的幫助，出現(xiàn)此問題的原因可能是酶促反應(yīng)的產(chǎn)物不穩(wěn)定，極易分解轉(zhuǎn)而又生成反應(yīng)物，使得反應(yīng)液褪色。此外，固定時(shí)間法要確定反應(yīng)時(shí)間段酶促反應(yīng)是否處于線性期才可以使用，通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，才發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)曲線前期不處于線性期，因此也應(yīng)該將測(cè)定方法改為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。通過(guò)這個(gè)問題也可以看出，并不是所有酶促反應(yīng)都可以用固定時(shí)間法進(jìn)行測(cè)定，要在詳細(xì)了解反應(yīng)過(guò)程的前提下，選擇合適的測(cè)定方法。首行縮進(jìn)關(guān)于酶液稀釋方法的思考本實(shí)驗(yàn)初期采用蒸餾水一步稀釋法，即從原酶液一步稀釋到所需倍數(shù)。但是，測(cè)定酶活時(shí)，發(fā)現(xiàn)平行試驗(yàn)誤差能達(dá)到30%。后經(jīng)老師指導(dǎo)，平行試驗(yàn)誤差大的原因可能有兩點(diǎn)：一、蒸餾水的PH偏酸性，可能影響稀釋后的酶活。二、稀釋方法不當(dāng)，用來(lái)稀釋的原酶液不具有代表性。根據(jù)以上兩點(diǎn)，對(duì)稀釋方法進(jìn)行改進(jìn)。其一，酶液稀釋改用PH7.0PBS緩沖液；其二，采用兩步稀釋法，即將要所稀釋的倍數(shù)改用該倍數(shù)的因數(shù)，分兩次進(jìn)行稀釋，如需要稀釋20倍，則先稀釋5倍，再稀釋4倍。關(guān)于單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化的思考本課題是研究過(guò)氧化物酶的提取，影響提取效果的因素很多，如不同液料比、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)、提取液體積等。試驗(yàn)中對(duì)各因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。從單因素試驗(yàn)結(jié)果可以看出，液料比、提取時(shí)間、提取溫度這三個(gè)因素對(duì)酶活的影響最為顯著。相對(duì)而言，提取次數(shù)，提取液濃度對(duì)提取的效果影響不大。因此，最終液料比、提取時(shí)間、提取溫度為本試驗(yàn)的試驗(yàn)因素，分別記作A、B、C，進(jìn)行正交試驗(yàn)，各因素均取三個(gè)最優(yōu)水平。通過(guò)單因素試驗(yàn)，從若干單因素中找對(duì)提取效果影響最明顯的三個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，縮小了試驗(yàn)范圍，提高了優(yōu)化效率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)就是安排多因素試驗(yàn)，用部分試驗(yàn)來(lái)代替全面試驗(yàn)，通過(guò)對(duì)部分試驗(yàn)結(jié)果的分析，了解全面試驗(yàn)的情況，尋求最優(yōu)水平組合的一種高效率試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。即在單因素測(cè)定出的最適初始條件下，分別將單因素的控制量在一定的范圍內(nèi)進(jìn)行重新設(shè)定組合。本試驗(yàn)為3因素3水平的試驗(yàn)，按試驗(yàn)要求，須進(jìn)行33=27種組合的試驗(yàn)。按L9(33)正交表按排試驗(yàn)，只需作9次試驗(yàn)，顯然大大減少了工作量，提供了效率，而且對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析（見表2-4），可以得到各因素的對(duì)本試驗(yàn)的影響大小，找到各因素的優(yōu)水平組合。試驗(yàn)中將優(yōu)水平組合與9組正交試驗(yàn)中的最優(yōu)組進(jìn)行比較，驗(yàn)證了優(yōu)水平組合的可靠性。實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)原料選?。涸蠎?yīng)選擇顆粒較大且飽滿無(wú)雜色的黃豆，以便降低因原料差異而對(duì)實(shí)驗(yàn)造成的誤差。此外，大豆皮粉碎后，應(yīng)放置低溫保藏，以減少環(huán)境對(duì)過(guò)氧化物酶的影響。浸取操作：稱量好的大豆皮粉轉(zhuǎn)移至三角瓶中，加入PBS緩沖液后，三角瓶?jī)?nèi)會(huì)留有氣泡，影響酶的提取。所以，加入緩沖液后，要輕輕搖晃三角瓶，待瓶中氣泡消除后，即可放置浸取。稀釋操作：酶液稀釋過(guò)程中，一定要用槍頭混合均勻，而且取液和混合要分別使用槍頭，不可混合使用，因?yàn)槊?xì)現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致用于混合的槍頭會(huì)存有少許液體，進(jìn)而產(chǎn)生誤差。本實(shí)驗(yàn)的存在的問題及改進(jìn)原料：本次實(shí)驗(yàn)的原料獲取皆為手工勞作，工作量大，產(chǎn)率低，以致于之后實(shí)驗(yàn)都才用0.5g原料提取，容易產(chǎn)生較大的誤差。因此，原料生產(chǎn)應(yīng)該盡量采用機(jī)械化生產(chǎn)，提高產(chǎn)率，提高酶液提取率，降低因原料之間的差異所造成的誤差。提?。禾崛『笏@得的酶液成分復(fù)雜，理應(yīng)進(jìn)行進(jìn)一步純化，但是考慮到初始原料少，純化過(guò)程中會(huì)有進(jìn)一步的損失，為了避免加大誤差，因此，只得采用粗提取。稀釋：本實(shí)驗(yàn)存在的最大問題就是稀釋倍數(shù)對(duì)酶活有著顯著的。通過(guò)對(duì)同一酶液在不同稀釋倍數(shù)下的酶活測(cè)定，發(fā)現(xiàn)酶活隨稀釋倍數(shù)的增加而降低，而且相差值盡然達(dá)到一萬(wàn)數(shù)量級(jí)。最開始是認(rèn)為放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致酶活降低，但是，通過(guò)2.2實(shí)驗(yàn)排除此干擾了。最后經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)仍不能排除此誤差，因此只能讓不同酶液所測(cè)出的吸光值變化盡量在每分鐘0.8～1.2內(nèi)（線性期階段）變化。測(cè)定：酶活測(cè)定過(guò)程中理應(yīng)控制環(huán)境溫度，但是由于學(xué)校不提供恒溫室，只能利用水浴鍋進(jìn)行控溫。但是水浴鍋控溫存在著明顯的不足，即從水浴鍋取出酶液后，溫度就會(huì)逐漸下降，會(huì)影響曲線的變化。但是考慮到水的比熱容較大，溫度降低不會(huì)太大，因此或許可以忽略此誤差。參考文獻(xiàn)按照引用格式插入正文中按照引用格式插入正文中