DB2102-T 0083-2023 小新月菱形藻藻種提純復(fù)壯技術(shù)規(guī)程

65.150CCS

B

51DB2102 2102/T

0083—2023小新月菱形藻藻種提純復(fù)壯技術(shù)規(guī)程Code

of

practice

purification

of

closterium 大連市市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB2102/T

—2023 本文件按照

1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由大連市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出。本文件由大連市海洋發(fā)展局歸口。本文件起草單位：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院本文件主要起草人：劉衛(wèi)東、劉忠穎、鮑相渤、李云峰、李玉龍。本文件發(fā)布實(shí)施后，任何單位和個(gè)人如有問(wèn)題和意見(jiàn)建議，均可通過(guò)來(lái)電、來(lái)函等方式進(jìn)行反饋，有關(guān)單位將及時(shí)答復(fù)并認(rèn)真處理，根據(jù)實(shí)際情況依法進(jìn)行評(píng)估及復(fù)審。歸

口

管

理

部

門(mén)

通訊

地

址

：

大

連

市海

洋

發(fā)展

局

（

大

連

市

西

崗

區(qū)

長(zhǎng)春

路

號(hào)

）

，

聯(lián)

系

電

話文件起草單位通訊地址：遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院（大連市沙河口區(qū)黑石礁5013384111868。DB2102/T

—20231范圍本文件規(guī)定了水產(chǎn)養(yǎng)殖用小新月菱形藻

藻種（以下簡(jiǎn)稱藻種）提純復(fù)壯的術(shù)語(yǔ)存、細(xì)胞提純復(fù)壯及擴(kuò)繁等內(nèi)容。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用小新月菱形藻等低溫硅藻的一級(jí)藻種提純復(fù)壯。2 規(guī)范性引用文件文件。GB

11607-1989漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)SC/T

2047-2006 水產(chǎn)養(yǎng)殖用海洋微藻保種操作技術(shù)規(guī)范DB21/T

2777-2017 海洋浮游微藻分離和篩選技術(shù)規(guī)程3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1藻種細(xì)胞提純復(fù)壯 purification

of

algae

cells恢復(fù)原藻種的典型性狀。3.2固體培養(yǎng)基 solid

保存培養(yǎng)的培養(yǎng)基。3.3藻種克隆 algae

由同一個(gè)藻種細(xì)胞分裂繁殖而形成的、具有相同遺傳物質(zhì)的細(xì)胞系。DB2102/T

—20234 水質(zhì)和設(shè)施設(shè)備條件4.1 水質(zhì)條件所用海水應(yīng)經(jīng)沉淀、過(guò)濾處理，水質(zhì)應(yīng)符合GB

11607-1989的規(guī)定。4.2 設(shè)施設(shè)備4.2.1 清洗設(shè)備水槽、試管刷和大瓶刷。4.2.2 消毒設(shè)備紫外燈、烘箱、高壓滅菌鍋、電陶爐、煤氣或液化氣灶具。4.2.3 操作觀察設(shè)備μ

l和1

移液器及配套槍頭，用于培養(yǎng)的一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑90

mm～

）和

～40

玻璃試管（配有帶砂芯乳膠塞），試管架、20

一次性無(wú)菌注射器及0.22μ

m孔徑無(wú)菌針筒式濾膜過(guò)濾器。4.2.4 培養(yǎng)保種設(shè)備光照培養(yǎng)架、低溫展示柜、恒溫光照培養(yǎng)箱。5 藻種培養(yǎng)液和固體培養(yǎng)基的配制5.1營(yíng)養(yǎng)液配制5.1.1 康威培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱

A

液）、康威培養(yǎng)基—微量元素溶液（以下簡(jiǎn)稱

B

液）和康威培養(yǎng)基—硅酸鈉溶液的成分參照

A，康威營(yíng)養(yǎng)液由

A

B

液組成，具體如下：a)配制

A

液時(shí)，將

DB21/T

2777-2017

表

A.1.1

中試劑加入純水中，加熱至試劑完全溶解；b)配制

B

液時(shí)，將

DB21/T

2777-2017

表

A.1.2

中試劑加入純水中，滴加

10%鹽酸搖勻，至試劑完全溶解，液體澄清；c) 將

B

A

液中，放置

h

以上，即成為康威營(yíng)養(yǎng)液。5.1.2 藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方見(jiàn)附錄

A。5.2固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配制藻種固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配方見(jiàn)附錄B。5.3 藻種擴(kuò)繁用培養(yǎng)液配制滅菌海水冷卻后，按照：1體積比分別加入滅菌的康威營(yíng)養(yǎng)液、康威培養(yǎng)基—硅酸鈉溶液和尿素溶液后搖勻。5.4 固體培養(yǎng)基配制向

ml海水中加入0.8

g～1

g瓊脂粉，加熱至溶解制成瓊脂海水基質(zhì)，高壓滅菌后置超凈工作臺(tái)中，于室溫下冷卻至45℃～55℃時(shí)按照1000：1體積比分別添加滅菌的康威營(yíng)養(yǎng)液、康威培養(yǎng)基—硅酸DB2102/T

—2023鈉溶液、尿素溶液和抗生素溶液后搖勻，立即向一次性滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)倒入約

ml，使培養(yǎng)基鋪滿每個(gè)培養(yǎng)皿底部，靜止放置至培養(yǎng)基凝固后，倒置于超凈臺(tái)中備用。6 消毒除菌6.1 藻種擴(kuò)繁用海水滅菌按照SC/T

2047-2006中規(guī)定的微藻分離、保存用海水的消毒方法執(zhí)行。6.2 營(yíng)養(yǎng)液和固體培養(yǎng)基滅菌康威營(yíng)養(yǎng)液、康威培養(yǎng)基—硅酸鈉溶液以及瓊脂粉海水基質(zhì)應(yīng)采用121

℃高壓蒸汽滅菌15

素溶液應(yīng)采用0.22μ

m孔徑無(wú)菌針筒式濾膜過(guò)濾器過(guò)濾除菌。6.3 器具滅菌塑料器具應(yīng)采用121℃高壓蒸汽滅菌15

min3

h滅菌。7 固體培養(yǎng)上藻種培養(yǎng)與保存7.1 接種7.1.1 藻種活化藻種（細(xì)胞濃度為8×106

cell/ml～×107

）按照1：1000比例接種藻種擴(kuò)繁用培養(yǎng)液，環(huán)境溫度17℃～20℃，光照度3000

～6000

Lux下培養(yǎng)2

d。7.1.2 藻種的接種用微量移液器向固體培養(yǎng)基上添加μ

Lμ

L～20

μ

L放入固體培養(yǎng)基中，使滅菌海水與藻種混合。向固體培養(yǎng)基上加入46顆直徑4

培養(yǎng)基上隨機(jī)滾動(dòng)，將藻種和海水均勻涂布在固體培養(yǎng)基上。2

h～4

h后，固體培養(yǎng)基上液體被基本吸收后，用封口膜纏繞培養(yǎng)皿側(cè)面，將培養(yǎng)皿上下結(jié)合部空間封閉。7.2 藻種克隆的培養(yǎng)適宜條件下（見(jiàn)7.1.1）培養(yǎng)固體培養(yǎng)基上的藻種細(xì)胞，

d～

d后，在固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出1

以上的藻種克隆。7.3 藻種克隆的度夏保種當(dāng)固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出大于1

mm存期可達(dá)5個(gè)月～17個(gè)月。8 細(xì)胞提純復(fù)壯及擴(kuò)繁DB2102/T

—20238.1 固體培養(yǎng)基上藻種細(xì)胞的提純復(fù)壯秋季，室溫下降至20℃時(shí)，對(duì)固體培養(yǎng)基上藻種細(xì)胞進(jìn)行提純復(fù)壯篩選：沒(méi)有細(xì)菌混雜的藻種克隆；

10

7.1.1）培養(yǎng)，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)藻種克隆的篩選培養(yǎng)，一個(gè)藻種克隆培養(yǎng)一管，不同藻種克隆間不應(yīng)相互混淆。8.2 提純復(fù)壯藻種的擴(kuò)繁當(dāng)試管內(nèi)的藻細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)3×106

400

ml擴(kuò)繁營(yíng)養(yǎng)液的

ml三角燒瓶中,

7.1.13.0

100

DB2102/T

—2023AA附

錄 A（資料性）藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方A.1藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方見(jiàn)表表表

A.1 藻種培養(yǎng)用尿素溶液配方100

100

100

DB2102/T

—2023BB附

錄B（資料性）藻種固體培養(yǎng)基用抗生素溶液配方B.1藻種固體培養(yǎng)基