PCR技術(shù)原理完整

變性與復(fù)性PCR原理1精選2021版課件DNA的變性(denaturation)：

在某些理化因素作用下，DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵斷裂，使規(guī)則有序的雙螺旋結(jié)構(gòu)變?yōu)椴灰?guī)則無序的單鏈線團樣結(jié)構(gòu)的過程。2精選2021版課件3精選2021版課件解鏈溫度（融解溫度，Tm）

(meltingtemperature)： 使50%的DNA發(fā)生變性時的環(huán)境溫度。 DNA的變性從開始解鏈到完全解鏈?zhǔn)窃谝粋€相當(dāng)窄的溫度內(nèi)完成的。4精選2021版課件5精選2021版課件增色效應(yīng)：

DNA變性后對260nm紫外光收增加的現(xiàn)象。6精選2021版課件DNA的復(fù)性（renaturation)：

在適當(dāng)條件下，變性DNA的兩條互補鏈可再恢復(fù)成天然的雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程。

熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過程稱為退火(annealing)。7精選2021版課件8精選2021版課件減色效應(yīng)：變性DNA復(fù)性后對260nm紫外光吸收減少的現(xiàn)象。9精選2021版課件1.常用的變性方法：

①熱變性

②酸堿變性

③化學(xué)試劑變性

10精選2021版課件2.影響復(fù)性的因素

①序列簡單的分子復(fù)性快，如poly(dT)和poly(dA)識別快②DNA片段愈大，擴散速度愈低，復(fù)性慢③離子強度↑→有利于復(fù)性④DNA濃度↑→復(fù)性↑

Tm值的估算①<20bpTm=4（G+C）+2（A+T）②>20bpTm=69.3+0.41(G+C)%③ Tm=81.5℃+16.6lgM+0.41（G+C）% -500/n-0.61×（甲酰胺%）

11精選2021版課件PCR技術(shù)總論

12精選2021版課件

聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction)簡稱ＰＣＲ，是一項在短時間內(nèi)大量擴增特定的ＤＮＡ片段的分子生物學(xué)技術(shù)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也可以當(dāng)作一項極其重要的酶促合成DNA技術(shù)。PCR又稱為無細胞克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增法，是基因擴增技術(shù)的一次重大革新，它可將極微量的靶DNA特異地擴增上百萬倍。70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）兩家研究室分別用改進的Kleppe法獲得了大量染色體DNA單拷貝基因。當(dāng)時的PCR技術(shù)須在每次變性和退火后，擴增反應(yīng)前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系統(tǒng)引入了熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶，這是從水生棲熱菌（Thermusaquaticus）中提取的耐熱DNA聚合酶，簡稱TaqDNA聚合酶。多次循環(huán)后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反應(yīng)體系自動往復(fù)多次地進行對所需的DNA的片段的酶促合成，使反應(yīng)產(chǎn)物按指數(shù)增長，所以命名為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。PCR基本原理PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng))是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟:(1)變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈;(2)退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對;(3)延伸(Extension):DNA模板—引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。(Plateau)。

到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。。

PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension16精選2021版課件PCRproduct17精選2021版課件PCR反應(yīng)曲線18精選2021版課件標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul19精選2021版課件PCR反應(yīng)五要素引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）20精選2021版課件引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增21精選2021版課件引物設(shè)計的原則（一）①引物長度：15-30bp，常用為20mer左右引物的有效長度不能大于38mer，否則最適延伸溫度會超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（74℃），不能保證PCR擴增產(chǎn)物的特異性②引物擴增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴增長至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列22精選2021版課件引物設(shè)計的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗⑥引物中有或能加上合適的酶切位點被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處23精選2021版課件引物設(shè)計的原則（三）⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會24精選2021版課件引物設(shè)計的原則（四）RT-PCR引物設(shè)計特別注意：跨越兩個外顯子25精選2021版課件酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少26精選2021版課件dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時（偏高或偏低），就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低27精選2021版課件模板（靶基因，targetgene）模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一傳統(tǒng)的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標(biāo)本SDS的主要功能是：溶解細胞膜上的脂類與蛋白質(zhì)，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，并解離細胞中的核蛋白，SDS還能與蛋白質(zhì)結(jié)合而沉淀蛋白酶K能水解消化蛋白質(zhì)，特別是與DNA結(jié)合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀核酸28精選2021版課件模板（靶基因，targetgene）提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴增RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA29精選2021版課件Mg2+濃度Mg2+對PCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少30精選2021版課件PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時間循環(huán)次數(shù)31精選2021版課件溫度與時間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸32精選2021版課件①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失敗33精選2021版課件

②退火(復(fù)性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想34精選2021版課件引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合35精選2021版課件③延伸溫度與時間：TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行36精選2021版課件③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10Kb需延伸至15min延伸進間過長會導(dǎo)致非特異性擴增對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些37精選2021版課件循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多38精選2021版課件PCR反應(yīng)特點特異性強靈敏度高簡便、快速對標(biāo)本的純度要求低39精選2021版課件特異性強關(guān)鍵：引物與模板的正確結(jié)合引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的合成反應(yīng)的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高40精選2021版課件PCR反應(yīng)的特異性決定因素引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對原則；TaqDNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；靶基因的特異性與保守性

41精選2021版課件靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6)水平從100萬個細胞中檢出一個靶細胞在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌42精選2021版課件簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的TaqDNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2~4小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣

43精選2021版課件對標(biāo)本的純度要求低不需分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA粗制品及總RNA均可作為擴增模板可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等粗制的DNA擴增檢測44精選2021版課件熱啟動PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不對稱PCR原位PCR連接酶鏈反應(yīng)RACE-PCRAFLP免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特異PCR45精選2021版課件1）不對稱PCR

目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。用途：制備核酸序列測定的模板；制備雜交探針；基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究

PCR的類型46精選2021版課件

高濃度引物低濃度引物47精選2021版課件2)反向PCR(reversePCR)

用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。

未知序列未知序列已知序列48精選2021版課件已知序列未知序列未知序列限制酶限制酶連接酶49精選2021版課件3）多重PCR（復(fù)合PCR）用于檢測特定基因序列的存在或缺失。50精選2021版課件電泳引物1234123451精選2021版課件4）LP-PCR（Labelledprimers)利用同位素、熒光素等對ＰＣＲ引物進行標(biāo)記,用以直觀地檢測目的基因。特別適合大量臨床標(biāo)本的基因診斷可同時檢測多種基因成分52精選2021版課件標(biāo)記引物ＰＣＲ觀察PCR產(chǎn)物53精選2021版課件5）錨定PCR（anchoredPCR,A-PCR）

錨定PCR首先合成第一鏈cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),與同聚物尾配對的3’錨定引物（帶有限制性內(nèi)切位點polydC)一起作PCR擴增54精選2021版課件cDNA末端核酸轉(zhuǎn)移酶3’GG…GG5’CC…CC錨定引物3’GG…GG5’CC…CC3’GG…GGCC…CC55精選2021版課件6）PCR固相分析法模板生物素化引物PCR擴增探針親和固相介質(zhì)檢測探針信號可用于基因芯片的制作56精選2021版課件7）原位ＰＣＲ原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利用完整的細胞作為一個微小的反應(yīng)體系來擴增細胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細胞的前提下,利用一些特定的檢測手段來檢測細胞內(nèi)的擴增產(chǎn)物。直接用細胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個細胞中進行ＰＣＲ擴增。可進行細胞內(nèi)定位和檢測病理切片中含量較少的靶序列。57精選2021版課件操作步驟1.細胞或組織固定：細胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）進入2.PCR擴增細胞內(nèi)目的片段3.原位雜交檢測擴增產(chǎn)物A.陽性對照B.陰性對照C.原位檢測mRNA表達58精選2021版課件8）ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴增59精選2021版課件9)熒光定量PCR（real-timePCR)

通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針,對PCR產(chǎn)物進行標(biāo)記跟蹤,實時在線監(jiān)控反應(yīng)過程,結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對結(jié)果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。內(nèi)摻式染料 SYBRGreenI序列特異性探針 Taqman MolecularBeacons DualProbes(FRET)引物特異性探針

Amplifluor(Intergen)60精選2021版課件5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI

61精選2021版課件實時熒光定量PCR儀梯度PCR儀普通PCR儀62精選2021版課件什么是測序？確定一條染色體片斷上的堿基順序。Sanger法：在PCR時加入熒光標(biāo)記的復(fù)制終止劑，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相應(yīng)于4種堿基）ddX的兩個作用：可以當(dāng)作正常堿基參與復(fù)制一旦鏈入DNA中，其后就不能再繼續(xù)連接電泳誰終止，堿基就是誰此方法獲1974年的Nobel獎63精選2021版課件Sanger第一步：加入復(fù)制終止劑熒光檢測探頭電泳，看誰跑得快64精選2021版課件Sanger第二步：熒光檢測65精選2021版課件Shotgun測序DNA的提取和純化載體預(yù)備：DNA片斷結(jié)合，從而能夠在細菌中擴增。DNA片段的制備：將DNA用超聲波切成能夠測序的小片斷轉(zhuǎn)化培養(yǎng)：小片斷和載體結(jié)合，植入細菌中進行擴增。提質(zhì)粒：從細菌中提取出繁殖好的質(zhì)粒電泳檢測：檢測質(zhì)量的好壞測序：上測序儀測序66精選2021版課件DNA整體切成小段小段和載體結(jié)合結(jié)合后進行測序67精選2021版課件Shotgun測序（2）——68精選2021版課件拼接錯誤：Repeat的存在69精選2021版課件基因的概念經(jīng)典遺傳學(xué)：遺傳物質(zhì)的傳遞規(guī)律分子遺傳學(xué)（1953，Watson&Crick）：

基因的本質(zhì)－化學(xué)、結(jié)構(gòu)基因的功能－基因表達、調(diào)控與性狀表現(xiàn)基因的變化－基因突變等70精選2021版課件經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念

孟德爾稱控制性狀的因子為遺傳因子

1909年約翰生提出了基因這個名詞，取代孟德爾的遺傳因子→摩爾根等人對果蠅、玉米等的大量遺傳研究，建立了以基因和染色體為主體的經(jīng)典遺傳學(xué)

經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：基因是遺傳上最小的結(jié)構(gòu)與功能單位，不能分割。是結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一體71精選2021版課件分子遺傳學(xué)中基因的概念基因的本質(zhì)：（1）基因是特定長度和堿基序列的DNA片段（2）核苷酸序列中蘊藏著遺傳信息：

mRNA多肽DNA

tRNA